氨基酸紙上層析

1、氨基酸紙上層析一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康? 、通過(guò)氨基酸的別離，學(xué)習(xí)并掌握紙層析的原理和操作技術(shù)；2 、掌握分配層析法；3 、掌握影響分配系數(shù)的因素。層析別離技術(shù)是利用被別離的混合物中各組分物理化學(xué)的性質(zhì)分子的形狀和大小、分子極性、吸附力、 分子親和力、分配系數(shù)等的不同，使各組分以不同程度分布在兩相流動(dòng)相和固定相中，當(dāng)流動(dòng)相流過(guò) 固定相時(shí)，各組分以不同的速度移動(dòng)，從而到達(dá)別離。層析別離技術(shù)在 20 世紀(jì)初就已得到應(yīng)用；1903 年用于植物色素的別離；1931 年用氧化鋁柱別離了胡蘿卜素的兩種同分異構(gòu)體；1944 年出現(xiàn)了以濾紙作為支持物的紙層析。層析別離的種類(lèi)很多：1 、按流動(dòng)相的狀態(tài)分類(lèi)： 1液相層析 2

2、氣相層析；2、按固定相的使用形式分類(lèi)： 1柱層析 2紙層析 3薄層層析等；3 、按別離過(guò)程所主要依據(jù)的物理化學(xué)性質(zhì)分類(lèi)： 1吸附層析 2分配層析 3離子交換層析 4凝膠層析 5親和層析等。二、實(shí)驗(yàn)原理紙層析：是以濾紙作為支持物的分配層析法，是 20 世紀(jì) 40 年代開(kāi)展起來(lái)的一種生化別離技術(shù)。由于設(shè)備簡(jiǎn)單，操 作方便，所需樣品量少，分辨力較高等優(yōu)點(diǎn)而廣泛的用于物質(zhì)的別離，并可進(jìn)行定性和定量的分析。缺點(diǎn)是 展開(kāi)時(shí)間較長(zhǎng)。分配層析法： 是利用物質(zhì)在兩種或兩種以上不同的混合溶劑中的分配系數(shù)不同，而到達(dá)別離的目的的一種實(shí)驗(yàn)方法。在一定條件下，一種物質(zhì)在某種溶劑系統(tǒng)中的分配系數(shù)是一個(gè)常數(shù)即a=溶質(zhì)在固定

3、相的濃度/溶質(zhì)在流動(dòng)相的濃度。溶劑系統(tǒng)：由有機(jī)溶劑和水組成，水和濾紙纖維素有較強(qiáng)的親和力，因而其擴(kuò)散作用降低形成固定相，有機(jī)溶劑和濾紙親和力弱，所以在濾紙毛細(xì)管中自由流動(dòng)，形成流動(dòng)相，由于混合液中各種氨基酸的分配系數(shù)值 不同，其在兩相中的分配數(shù)量及移動(dòng)速率即遷移率 Rf 值就不同，從而到達(dá)別離的目的。移動(dòng)速率：Rf=原點(diǎn)到層析點(diǎn)中心的距離/原點(diǎn)到溶劑前沿的距離。影響 Rf 值的主要因素：Rf 決定于被別離物質(zhì)在兩相間的分配系數(shù)以及兩相間的體積比。由于在同一實(shí)驗(yàn)條件下，兩相體積比是一 常數(shù)，所以主要決定于分配系數(shù)。不同物質(zhì)分配系數(shù)不同， Rf 也就不同。 1物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和分子極性：結(jié)構(gòu)不同極性不同

4、， 在兩相中的溶解度也就不同， 物質(zhì)的極性決定了物質(zhì)在水和有機(jī)溶劑之間的分配情況， 極性大的易溶于水中即固定相中，Rf小；反之Rf那么較大；2層析溶劑：首先，溶劑的純度要高，否那么需經(jīng)預(yù)先處理酸堿抽提，重蒸餾，脫水枯燥等；其次，溶劑系統(tǒng)選擇應(yīng)考慮被別離的物質(zhì)在溶劑系統(tǒng)中的Rf在0.050.85 ,樣品被別離物質(zhì)的組分的 Rf之差最好大于0.05。再次，有些溶劑系統(tǒng)需必須新鮮配制，如正丁醇- 甲酸- 水系統(tǒng)久放易引起酯化；最后，溶質(zhì)和溶劑之間假設(shè)能形成氫鍵，對(duì)分配系數(shù)的影響很大；3 pH 值：溶劑、濾紙和樣品的pH值都會(huì)影響物質(zhì)的解離，從而影響物質(zhì)的極性和溶解度，使Rf改變；溶劑的pH還可以影響

5、流動(dòng)相的含水量，溶劑的酸堿度大，吸水量多，使極性物質(zhì)的Rf增加將濾紙和溶劑用緩沖溶液處理； 4濾紙：層析濾紙由高純度棉花制成，要求濾紙要清潔，質(zhì)地均一，厚薄一致，纖維松緊度適中，具有一定的機(jī)械 強(qiáng)度，要被溶劑所飽和。不同型號(hào)的濾紙，其厚薄程度、纖維松緊度各不相同，因此，濾紙纖維結(jié)合水的量不一樣，兩相的體積比也就不同， Rf 也不同；另外，濾紙的雜質(zhì)也會(huì)影響Rf,必要時(shí)進(jìn)行預(yù)處理可用 0.010.4M的HCI處理除去金屬離子； 5室驗(yàn)室的溫度和時(shí)間 :溫度影響物質(zhì)在兩相中的溶解度,即影響分配系數(shù)；也影響濾紙纖維的水合作用,影響固定相的體積；也 顯著地影響溶劑系統(tǒng)的含水量,即影響流動(dòng)相的組分比例,

6、層析必須在恒溫條件下進(jìn)行,某些對(duì)溫度敏感的 溶劑系統(tǒng),最好不配制成飽和溶液。層析時(shí)間長(zhǎng) Rf 大。 6展開(kāi)方式：下行法層析缸上部有一盛展開(kāi)劑的液槽 , 濾紙點(diǎn)樣端向上進(jìn)入槽中,重現(xiàn)性差,斑點(diǎn)易擴(kuò)散Rf 大,上行法 Rf ?。画h(huán)行法最好用無(wú)方向性的特制濾紙用圓形濾紙層析時(shí)，由于內(nèi)圈較外圈小，限制了溶劑的流動(dòng)， Rf 較小。7樣品溶液中雜質(zhì)：如氯化鈉的存在會(huì)影響氨基酸的 Rf 值。三、實(shí)驗(yàn)材料、儀器和試劑：1 、實(shí)驗(yàn)材料：谷氨酸、組氨酸、脯氨酸、亮氨酸標(biāo)準(zhǔn)品2 、儀器： 1 毛細(xì)管 2 電熱吹風(fēng)機(jī) 3 層析缸 4 層析濾紙 5小型玻璃噴霧器 6鉛筆、直尺等。3 、試劑： 1氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液：亮氨酸、

7、脯氨酸、谷氨酸、組氨酸標(biāo)準(zhǔn)品。2溶劑系統(tǒng)：正丁醇：甲酸：水 =15： 3： 2體積比搖勻；30.25%的水合茚三酮溶液。四、實(shí)驗(yàn)步驟：1、 樣品的準(zhǔn)備：稱(chēng)取谷氨酸、組氨酸、脯氨酸、亮氨酸標(biāo)準(zhǔn)品各1mg混合溶于10%異丙醇中。2、 濾紙的準(zhǔn)備：取一長(zhǎng)方形濾紙，在濾紙縱向?qū)?yīng)的兩邊距邊沿2cm處，各畫(huà)兩條平行線(xiàn)，一條作前沿標(biāo)志，一條作點(diǎn)樣線(xiàn)，在點(diǎn)線(xiàn)上每隔2cm畫(huà)一個(gè)“ +作為點(diǎn)樣位置，共 5個(gè)點(diǎn)。3 、點(diǎn)樣：用毛細(xì)管點(diǎn)樣，中間的點(diǎn)混合氨基酸，兩側(cè)點(diǎn)四種標(biāo)準(zhǔn)氨基酸；每個(gè)點(diǎn)樣點(diǎn)重復(fù)點(diǎn)5 次，每點(diǎn)一次用電吹風(fēng)吹干后再點(diǎn)下次此時(shí)，用冷風(fēng)吹干，防止氨基酸變性降解，點(diǎn)樣點(diǎn)的直徑應(yīng)控制在2mm左右,點(diǎn)樣完畢用大頭針將濾紙做成筒形，點(diǎn)樣面向外 , 注意紙的兩邊不要接觸。4 、展層：向?qū)游龈字袇⒓訉游鋈軇簩硬灰^(guò)點(diǎn)樣線(xiàn)，高約1.5cm，約50- 60ml溶劑將濾紙點(diǎn)樣點(diǎn)朝下放入層析溶劑中，將層析缸密閉，待溶劑到達(dá)標(biāo)志線(xiàn)后取出，冷風(fēng)吹干。5 、顯色：用噴霧器將 0