第六免疫比濁分析

1、人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社第六章第六章 免疫比濁分析免疫比濁分析 第六章第六章免疫比濁分析免疫比濁分析李士軍李士軍 教授教授大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社第六章第六章 免疫比濁分析免疫比濁分析 目錄目錄 免疫比濁技術(shù)原理免疫比濁技術(shù)原理 1自動(dòng)化免疫比濁分析自動(dòng)化免疫比濁分析 2返回總目錄返回總目錄小結(jié)小結(jié) 3人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社第六章第六章 免疫比濁分析免疫比濁分析 第一節(jié)第一節(jié) 免疫比濁技術(shù)原理免疫比濁技術(shù)原理免疫比濁技術(shù)分類(lèi)：免疫比濁技術(shù)分類(lèi)：透射免疫比濁法透射免疫比濁法（turbidimetric immunoassa

2、y）散射免疫比濁法散射免疫比濁法（nephelometry immunoassay）速率散射比濁法速率散射比濁法終點(diǎn)散射比濁法終點(diǎn)散射比濁法人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社第六章第六章 免疫比濁分析免疫比濁分析 4一、透射免疫比濁法一、透射免疫比濁法 當(dāng)一定波長(zhǎng)的光通過(guò)抗原抗體反應(yīng)形成當(dāng)一定波長(zhǎng)的光通過(guò)抗原抗體反應(yīng)形成的免疫復(fù)合物時(shí)會(huì)因?yàn)榉瓷浜臀斩鴾p弱，的免疫復(fù)合物時(shí)會(huì)因?yàn)榉瓷浜臀斩鴾p弱，一定范圍內(nèi)，透射光被吸收的量與復(fù)合物的一定范圍內(nèi)，透射光被吸收的量與復(fù)合物的量呈量呈正相關(guān)正相關(guān)關(guān)系，而復(fù)合物的量與抗原抗體關(guān)系，而復(fù)合物的量與抗原抗體量為一定的函數(shù)關(guān)系。量為一定的函數(shù)關(guān)系。（一）基本原理（

3、一）基本原理人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社第六章第六章 免疫比濁分析免疫比濁分析 在抗原或抗體量一定的條件下，可以利用比在抗原或抗體量一定的條件下，可以利用比濁儀在光源的光路方向上測(cè)定透射光強(qiáng)度與濁儀在光源的光路方向上測(cè)定透射光強(qiáng)度與入射光強(qiáng)度的比值或吸光度，來(lái)判斷待測(cè)抗入射光強(qiáng)度的比值或吸光度，來(lái)判斷待測(cè)抗原的量，這種方法稱(chēng)為原的量，這種方法稱(chēng)為透射比濁法透射比濁法 。人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社第六章第六章 免疫比濁分析免疫比濁分析 透射免疫比濁法光路圖透射免疫比濁法光路圖人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社第六章第六章 免疫比濁分析免疫比濁分析 待測(cè)的抗原抗體復(fù)合物分子量足夠大。待測(cè)的抗原抗體復(fù)合

4、物分子量足夠大。 抗原抗體復(fù)合物數(shù)量足夠多?？乖贵w復(fù)合物數(shù)量足夠多。 具有充分的反應(yīng)時(shí)間。具有充分的反應(yīng)時(shí)間。 高親和力的抗體，并保證抗體過(guò)量。高親和力的抗體，并保證抗體過(guò)量。（二）技術(shù)要求（二）技術(shù)要求人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社第六章第六章 免疫比濁分析免疫比濁分析 透射免疫比濁法的靈敏度是單向瓊脂擴(kuò)散透射免疫比濁法的靈敏度是單向瓊脂擴(kuò)散方法的方法的5 51010倍，但其與標(biāo)記免疫分析技術(shù)倍，但其與標(biāo)記免疫分析技術(shù)相比還不夠高。因此，透射比濁類(lèi)的自動(dòng)分相比還不夠高。因此，透射比濁類(lèi)的自動(dòng)分析儀用于免疫測(cè)定已趨減少，該測(cè)定原理析儀用于免疫測(cè)定已趨減少，該測(cè)定原理主主要用于生化分析儀。要用于

5、生化分析儀。（三）方法學(xué)評(píng)價(jià)（三）方法學(xué)評(píng)價(jià)人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社第六章第六章 免疫比濁分析免疫比濁分析 抗原抗體反應(yīng)曲線(xiàn)抗原抗體反應(yīng)曲線(xiàn)人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社第六章第六章 免疫比濁分析免疫比濁分析 10二、二、散射免疫比濁法散射免疫比濁法散射比濁法散射比濁法是指一定波長(zhǎng)的光沿水平軸照射，是指一定波長(zhǎng)的光沿水平軸照射，通過(guò)溶液時(shí)遇到其中的抗原抗體復(fù)合物，光通過(guò)溶液時(shí)遇到其中的抗原抗體復(fù)合物，光線(xiàn)被粒子顆粒折射而發(fā)生偏轉(zhuǎn)，產(chǎn)線(xiàn)被粒子顆粒折射而發(fā)生偏轉(zhuǎn)，產(chǎn) 生散射生散射光。光。（一）基本原理（一）基本原理人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社第六章第六章 免疫比濁分析免疫比濁分析 其中光線(xiàn)偏轉(zhuǎn)的

6、角度與發(fā)射光的波長(zhǎng)和抗其中光線(xiàn)偏轉(zhuǎn)的角度與發(fā)射光的波長(zhǎng)和抗原抗體復(fù)合物的大小和多少密切相關(guān)。散射光原抗體復(fù)合物的大小和多少密切相關(guān)。散射光的強(qiáng)度與復(fù)合物的含量成的強(qiáng)度與復(fù)合物的含量成正比正比，即待測(cè)的抗原，即待測(cè)的抗原越多，形成的復(fù)合物越多，散射光就越強(qiáng)。越多，形成的復(fù)合物越多，散射光就越強(qiáng)。人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社第六章第六章 免疫比濁分析免疫比濁分析 透射濁度法和散射濁度法的光路透射濁度法和散射濁度法的光路人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社第六章第六章 免疫比濁分析免疫比濁分析 應(yīng)選擇應(yīng)選擇適當(dāng)適當(dāng)?shù)墓庠磸?qiáng)度、反應(yīng)時(shí)間、測(cè)量的光源強(qiáng)度、反應(yīng)時(shí)間、測(cè)量角度及光源的波長(zhǎng)。另外，要注意保證抗角度及

7、光源的波長(zhǎng)。另外，要注意保證抗原濃度合適。此外，還要選擇適宜的離子原濃度合適。此外，還要選擇適宜的離子強(qiáng)度、強(qiáng)度、pHpH值等。值等。（二）技術(shù)要求（二）技術(shù)要求人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社第六章第六章 免疫比濁分析免疫比濁分析 散射免疫比濁法散射免疫比濁法是當(dāng)今免疫化學(xué)分析中比較是當(dāng)今免疫化學(xué)分析中比較有優(yōu)勢(shì)的方法?？梢詫?shí)現(xiàn)自動(dòng)化管理，但用于免有優(yōu)勢(shì)的方法?？梢詫?shí)現(xiàn)自動(dòng)化管理，但用于免疫沉淀反應(yīng)有很多缺陷，如因?yàn)槭且淮涡詼y(cè)定光疫沉淀反應(yīng)有很多缺陷，如因?yàn)槭且淮涡詼y(cè)定光吸收值，沒(méi)有考慮單個(gè)待測(cè)樣本的散射效果，可吸收值，沒(méi)有考慮單個(gè)待測(cè)樣本的散射效果，可能使測(cè)定結(jié)果不準(zhǔn)確。能使測(cè)定結(jié)果不準(zhǔn)確。（

8、三）方法學(xué)評(píng)價(jià)（三）方法學(xué)評(píng)價(jià)人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社第六章第六章 免疫比濁分析免疫比濁分析 測(cè)定的時(shí)間依然較長(zhǎng)，且隨時(shí)間延長(zhǎng)，抗測(cè)定的時(shí)間依然較長(zhǎng)，且隨時(shí)間延長(zhǎng)，抗原抗體復(fù)合物有重新結(jié)合的趨勢(shì)，可影響散射原抗體復(fù)合物有重新結(jié)合的趨勢(shì)，可影響散射值的變化及存在反應(yīng)本底，在微量測(cè)定時(shí)，值的變化及存在反應(yīng)本底，在微量測(cè)定時(shí)，本本底的干擾底的干擾是影響測(cè)定準(zhǔn)確性的重要因素。是影響測(cè)定準(zhǔn)確性的重要因素。人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社第六章第六章 免疫比濁分析免疫比濁分析 16三、三、速率免疫比濁法速率免疫比濁法該法是抗原抗體結(jié)合反應(yīng)的一種該法是抗原抗體結(jié)合反應(yīng)的一種動(dòng)態(tài)測(cè)定動(dòng)態(tài)測(cè)定方法。方法。將抗原

9、抗體的沉淀反應(yīng)與散射比濁分析相結(jié)合，將抗原抗體的沉淀反應(yīng)與散射比濁分析相結(jié)合，對(duì)單位時(shí)間內(nèi)抗原和抗體結(jié)合形成復(fù)合物的速對(duì)單位時(shí)間內(nèi)抗原和抗體結(jié)合形成復(fù)合物的速度進(jìn)行動(dòng)力學(xué)測(cè)定即為度進(jìn)行動(dòng)力學(xué)測(cè)定即為速率免疫比濁法速率免疫比濁法。（一）基本原理（一）基本原理人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社第六章第六章 免疫比濁分析免疫比濁分析 當(dāng)抗體的濃度固定于一定范圍時(shí)，速度峰當(dāng)抗體的濃度固定于一定范圍時(shí)，速度峰值的高低與抗原的含量成值的高低與抗原的含量成正比正比，隨著時(shí)間的延，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，免疫復(fù)合物的量逐漸增多，抗原抗體結(jié)合長(zhǎng)，免疫復(fù)合物的量逐漸增多，抗原抗體結(jié)合速度的峰值在一定的時(shí)間出現(xiàn)。通過(guò)微機(jī)處理速度

10、的峰值在一定的時(shí)間出現(xiàn)。通過(guò)微機(jī)處理即可得到待測(cè)蛋白成份的含量。即可得到待測(cè)蛋白成份的含量。人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社第六章第六章 免疫比濁分析免疫比濁分析 累計(jì)時(shí)間復(fù)合物產(chǎn)生總量產(chǎn)生速率510152025303540455055608132560150230300360415450480500512359080706055453020 抗原抗體復(fù)合物形成時(shí)間與速率的關(guān)系抗原抗體復(fù)合物形成時(shí)間與速率的關(guān)系人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社第六章第六章 免疫比濁分析免疫比濁分析 速率散射比濁法速率散射比濁法峰值出現(xiàn)的時(shí)間峰值出現(xiàn)的時(shí)間與抗體濃與抗體濃度及純度直接相關(guān)，需選用抗體純度及親和力度及純度直

11、接相關(guān)，需選用抗體純度及親和力交高的試劑。此外，要保證待測(cè)樣本血清的性交高的試劑。此外，要保證待測(cè)樣本血清的性狀符合要求，如嚴(yán)重脂血等即為不合格樣本。狀符合要求，如嚴(yán)重脂血等即為不合格樣本。（二）技術(shù)要求（二）技術(shù)要求人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社第六章第六章 免疫比濁分析免疫比濁分析 該法具有快速、敏感度及精密度高的特該法具有快速、敏感度及精密度高的特點(diǎn)，其最大優(yōu)點(diǎn)在于點(diǎn)，其最大優(yōu)點(diǎn)在于快速快速，檢測(cè)不必等到，檢測(cè)不必等到抗原抗體達(dá)到平衡，大大節(jié)省反應(yīng)時(shí)間，抗原抗體達(dá)到平衡，大大節(jié)省反應(yīng)時(shí)間，每小時(shí)可檢測(cè)標(biāo)本數(shù)十份；敏感度高，最每小時(shí)可檢測(cè)標(biāo)本數(shù)十份；敏感度高，最小檢出量達(dá)微克小檢出量達(dá)微克/

12、 /升水平。升水平。（三）方法學(xué)評(píng)價(jià)（三）方法學(xué)評(píng)價(jià)人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社第六章第六章 免疫比濁分析免疫比濁分析 21四、免疫膠乳比濁法四、免疫膠乳比濁法將抗體吸附在大小適中、均勻一致的膠乳顆粒將抗體吸附在大小適中、均勻一致的膠乳顆粒上，制成致敏的膠乳顆粒，當(dāng)遇到相應(yīng)抗原時(shí)，上，制成致敏的膠乳顆粒，當(dāng)遇到相應(yīng)抗原時(shí)，發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，形成抗原抗體復(fù)合物，膠乳顆發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，形成抗原抗體復(fù)合物，膠乳顆粒發(fā)生凝集。粒發(fā)生凝集。（一）基本原理（一）基本原理人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社第六章第六章 免疫比濁分析免疫比濁分析 單個(gè)膠乳顆粒在入射光波長(zhǎng)之內(nèi)并不阻單個(gè)膠乳顆粒在入射光波長(zhǎng)之內(nèi)并不阻礙光線(xiàn)透

13、過(guò)，兩個(gè)及其兩個(gè)以上膠乳顆粒凝礙光線(xiàn)透過(guò)，兩個(gè)及其兩個(gè)以上膠乳顆粒凝聚時(shí)則使透過(guò)的光減少，其減少的程度與膠聚時(shí)則使透過(guò)的光減少，其減少的程度與膠乳顆粒凝聚的程度呈正比，即與待測(cè)抗原量乳顆粒凝聚的程度呈正比，即與待測(cè)抗原量呈正比，由此可檢測(cè)樣本中的特定抗原含量。呈正比，由此可檢測(cè)樣本中的特定抗原含量。人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社第六章第六章 免疫比濁分析免疫比濁分析 膠乳顆粒的膠乳顆粒的均一性均一性將直接影響光散射作用，將直接影響光散射作用，影響檢測(cè)結(jié)果，因此需要選擇均勻一致的影響檢測(cè)結(jié)果，因此需要選擇均勻一致的膠乳顆粒。此外，試劑需要加保護(hù)劑以提膠乳顆粒。此外，試劑需要加保護(hù)劑以提高其穩(wěn)定性，

14、所用器皿要潔凈，避免雜質(zhì)高其穩(wěn)定性，所用器皿要潔凈，避免雜質(zhì)微粒的干擾。微粒的干擾。（二）技術(shù)要求（二）技術(shù)要求人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社第六章第六章 免疫比濁分析免疫比濁分析 該法敏感度高，試劑穩(wěn)定，個(gè)體免疫復(fù)該法敏感度高，試劑穩(wěn)定，個(gè)體免疫復(fù)合物對(duì)結(jié)果影響也小，因此結(jié)果穩(wěn)定、可合物對(duì)結(jié)果影響也小，因此結(jié)果穩(wěn)定、可靠，特異性好，精確度高，且不需要特殊靠，特異性好，精確度高，且不需要特殊的儀器設(shè)備，一般分光光度計(jì)、自動(dòng)化生的儀器設(shè)備，一般分光光度計(jì)、自動(dòng)化生化分析儀或散射比濁儀均可使用?；治鰞x或散射比濁儀均可使用。返回章目錄返回章目錄（三）方法學(xué)評(píng)價(jià)（三）方法學(xué)評(píng)價(jià)人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出

15、版社第六章第六章 免疫比濁分析免疫比濁分析 （一）（一）BNBN特種蛋白分析測(cè)定系統(tǒng)特種蛋白分析測(cè)定系統(tǒng)該系統(tǒng)的測(cè)定方法是透射免疫比濁法的一種該系統(tǒng)的測(cè)定方法是透射免疫比濁法的一種改良。以發(fā)光二極管作為光源，檢測(cè)前向角改良。以發(fā)光二極管作為光源，檢測(cè)前向角13132424度的散射光，然后利用硅化光電二極度的散射光，然后利用硅化光電二極管接收散射光信號(hào)，經(jīng)過(guò)微電腦處理，與標(biāo)管接收散射光信號(hào)，經(jīng)過(guò)微電腦處理，與標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)進(jìn)行比較，最后轉(zhuǎn)換成待檢物質(zhì)的濃準(zhǔn)曲線(xiàn)進(jìn)行比較，最后轉(zhuǎn)換成待檢物質(zhì)的濃度。度。第二節(jié)第二節(jié) 自動(dòng)化免疫比濁分析自動(dòng)化免疫比濁分析一、主流免疫比濁設(shè)備概況一、主流免疫比濁設(shè)備概況1.測(cè)

16、定原理測(cè)定原理人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社第六章第六章 免疫比濁分析免疫比濁分析 系統(tǒng)由分析儀、計(jì)算機(jī)、條碼讀取器、打系統(tǒng)由分析儀、計(jì)算機(jī)、條碼讀取器、打印機(jī)四部分組成，其中印機(jī)四部分組成，其中分析儀分析儀是主要組成部分，是主要組成部分，包括散射測(cè)濁儀、自動(dòng)加樣系統(tǒng)、運(yùn)輸裝置和包括散射測(cè)濁儀、自動(dòng)加樣系統(tǒng)、運(yùn)輸裝置和比色杯裝置。比色杯裝置。 2.儀器基本組成儀器基本組成人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社第六章第六章 免疫比濁分析免疫比濁分析 BN100BN100、BNBN特種蛋白分析分析系統(tǒng)特種蛋白分析分析系統(tǒng)人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社第六章第六章 免疫比濁分析免疫比濁分析 本系統(tǒng)屬于速率散射比濁

17、分析法，在抗體過(guò)量的本系統(tǒng)屬于速率散射比濁分析法，在抗體過(guò)量的前提下，光束通過(guò)抗原抗體復(fù)合物時(shí)所產(chǎn)生的散前提下，光束通過(guò)抗原抗體復(fù)合物時(shí)所產(chǎn)生的散射光速率變化大小與抗原濃度成正比。速率的峰射光速率變化大小與抗原濃度成正比。速率的峰值通過(guò)電腦處理系統(tǒng)轉(zhuǎn)換成待測(cè)抗原的濃度。值通過(guò)電腦處理系統(tǒng)轉(zhuǎn)換成待測(cè)抗原的濃度。1.測(cè)定原理測(cè)定原理（二）（二）ARRAYARRAY分析系統(tǒng)分析系統(tǒng)人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社第六章第六章 免疫比濁分析免疫比濁分析 ARRAY ARRAY系統(tǒng)由分析儀、電腦處理系統(tǒng)、打印系統(tǒng)由分析儀、電腦處理系統(tǒng)、打印機(jī)構(gòu)成，其主要構(gòu)成部分為分析儀，由加液機(jī)構(gòu)成，其主要構(gòu)成部分為分析儀

18、，由加液系統(tǒng)、散射測(cè)濁儀、系統(tǒng)、散射測(cè)濁儀、4040孔樣本轉(zhuǎn)盤(pán)、孔樣本轉(zhuǎn)盤(pán)、2020孔試孔試劑轉(zhuǎn)盤(pán)、軟盤(pán)驅(qū)動(dòng)器等組成。劑轉(zhuǎn)盤(pán)、軟盤(pán)驅(qū)動(dòng)器等組成。2.儀器基本組成儀器基本組成人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社第六章第六章 免疫比濁分析免疫比濁分析 Array360Array360、IMMAGEIMMAGE特種蛋白分析分析系統(tǒng)特種蛋白分析分析系統(tǒng)人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社第六章第六章 免疫比濁分析免疫比濁分析 二、免疫比濁分析的主要影響因素二、免疫比濁分析的主要影響因素1 1抗原抗體比例抗原抗體比例 抗原抗體比例要適當(dāng)?？乖贵w比例要適當(dāng)。2 2抗體的純度與效價(jià)抗體的純度與效價(jià) 診斷試劑應(yīng)盡可能診斷試劑應(yīng)盡可能選擇高純度與高效價(jià)的抗體。選擇高純度與高效價(jià)的抗體。3 3免疫復(fù)合物的大小及穩(wěn)定性免疫復(fù)合物的大小及穩(wěn)定性 溶液中免溶液中免疫復(fù)合物顆粒的分散度盡可能相同，顆粒應(yīng)疫復(fù)合物顆粒的分散度盡可能相同，顆粒應(yīng)該不容