第6章-誘變育種

1、第第6章章 誘變育種誘變育種 n 從自然界直接分離的菌種，一般而言其發(fā)從自然界直接分離的菌種，一般而言其發(fā)酵活力往往是比較低的，不能達到工業(yè)生酵活力往往是比較低的，不能達到工業(yè)生產(chǎn)的要求，因此要根據(jù)菌種的形態(tài)、生理產(chǎn)的要求，因此要根據(jù)菌種的形態(tài)、生理上的特點，改良菌種。以微生物的自然變上的特點，改良菌種。以微生物的自然變異為基礎的生產(chǎn)選種的幾率并不高，因為異為基礎的生產(chǎn)選種的幾率并不高，因為這種變異率太小，僅為這種變異率太小，僅為10-610-10。為了。為了加大其變異率，采用物理和化學因素促進加大其變異率，采用物理和化學因素促進其誘發(fā)突變，這種以誘發(fā)突變?yōu)榛A的育其誘發(fā)突變，這種以誘發(fā)突變?yōu)?/p>

2、基礎的育種就是誘變育種，它是國內(nèi)外提高菌種產(chǎn)種就是誘變育種，它是國內(nèi)外提高菌種產(chǎn)量、性能的主要手段。量、性能的主要手段。誘變育種的意義誘變育種的意義n 當今發(fā)酵工業(yè)所使用的高產(chǎn)菌株，幾乎都當今發(fā)酵工業(yè)所使用的高產(chǎn)菌株，幾乎都是通過誘變育種而大大提高了生產(chǎn)性能。誘是通過誘變育種而大大提高了生產(chǎn)性能。誘變育種不僅能提高菌種的生產(chǎn)性能而且能改變育種不僅能提高菌種的生產(chǎn)性能而且能改進產(chǎn)品的質(zhì)量、擴大品種和簡化生產(chǎn)工藝等。進產(chǎn)品的質(zhì)量、擴大品種和簡化生產(chǎn)工藝等。從方法上講，它具有方法簡便、工作速度快從方法上講，它具有方法簡便、工作速度快和效果顯著等優(yōu)點。因此，雖然目前在育種和效果顯著等優(yōu)點。因此，雖然目

3、前在育種方法上，雜交、方法上，雜交、 轉化、轉導以及基因工程、轉化、轉導以及基因工程、原生質(zhì)體融合等方面的研究都在快速地發(fā)展，原生質(zhì)體融合等方面的研究都在快速地發(fā)展，但誘變育種仍為目前比較主要、廣泛使用的但誘變育種仍為目前比較主要、廣泛使用的育種手段。育種手段。 誘變物理、化學或生物誘變方法物理、化學或生物誘變方法第一節(jié)誘變育種的作用 提高有效產(chǎn)物的產(chǎn)量 改善菌種特性 開發(fā)新產(chǎn)品 效價：指有效成分的濃度。1ug/ul稱為1 單位1945時間1943194319431947195519711977目前發(fā)酵單位(u/ml)10025050085085080002萬5萬510萬 從青霉素產(chǎn)量看誘變育

4、種第二節(jié)準備工作 了解影響菌種生長發(fā)育的主要因素 培養(yǎng)基 斜面培養(yǎng)基制作技術 移種的密度 溫度 濕度 藥品原材料質(zhì)量 了解影響菌株的菌落特征 區(qū)分不同菌落類型 區(qū)分不同菌落類型的原因 了解菌種特性及其生產(chǎn)性能的關系了解菌種特性及其生產(chǎn)性能的關系 建立準確的檢測方法建立準確的檢測方法 合適的菌種保藏技術合適的菌種保藏技術 第三節(jié)誘變劑和誘變處理n 物理誘變劑：射線如紫外線、物理誘變劑：射線如紫外線、X射線、射線、射線，快中子；射線，快中子；n物理因素中目前使用得最方便而且十分有效物理因素中目前使用得最方便而且十分有效的是紫外線。許多高產(chǎn)菌株的選育都用過紫的是紫外線。許多高產(chǎn)菌株的選育都用過紫外線

5、，對于一般實驗室、中小型工廠都適用，外線，對于一般實驗室、中小型工廠都適用，也很安全。也很安全。n其他的幾種射線都是電離性質(zhì)的，有一定的其他的幾種射線都是電離性質(zhì)的，有一定的穿透力，一般都由專業(yè)人員在專門的設備中穿透力，一般都由專業(yè)人員在專門的設備中使用，否則有一定危險性。使用，否則有一定危險性。 化學因子如堿基類似物、化學因子如堿基類似物、5 5氟尿嘧啶、烷化劑等。氟尿嘧啶、烷化劑等?；瘜W誘變劑中使用最多、最有效的是烷化劑?；瘜W誘變劑中使用最多、最有效的是烷化劑。使用化學誘變劑的優(yōu)缺點：使用化學誘變劑的優(yōu)缺點：1 1、大多數(shù)情況下，就突變數(shù)量而言，要比電離輻射、大多數(shù)情況下，就突變數(shù)量而言，

6、要比電離輻射更有效。更有效。 化學誘變劑化學誘變劑2 2、化學誘變劑是很經(jīng)濟的，因為只需要少量的合、化學誘變劑是很經(jīng)濟的，因為只需要少量的合適的誘變劑，設備是實驗室的一般玻璃器皿，適的誘變劑，設備是實驗室的一般玻璃器皿，一個蒸氣罩。而用電離輻射一個蒸氣罩。而用電離輻射行工作時，設備行工作時，設備費用大，并要注意安全性。費用大，并要注意安全性。3 3、大部分誘變劑是致癌劑，所以在使用中必須非、大部分誘變劑是致癌劑，所以在使用中必須非常謹慎，要避免化學誘變劑與皮膚接觸，且常謹慎，要避免化學誘變劑與皮膚接觸，且切勿吸入其蒸氣，有人對某些誘變劑極其敏感，切勿吸入其蒸氣，有人對某些誘變劑極其敏感，甚至未

7、直接接觸就會過敏，這就更要當心甚至未直接接觸就會過敏，這就更要當心。誘變劑的選擇誘變劑的選擇1 1堿基類似物和羥胺具有很高的特異性，但很少使堿基類似物和羥胺具有很高的特異性，但很少使用，回復突變率高，效果不大。用，回復突變率高，效果不大。2 2亞硝酸和烷化劑應用的范圍較廣，造成的遺傳損亞硝酸和烷化劑應用的范圍較廣，造成的遺傳損傷較多。其中亞硝基胍和甲基磺酸乙酯常被稱為傷較多。其中亞硝基胍和甲基磺酸乙酯常被稱為“超誘變劑超誘變劑”，甲基磺酸乙酯是毒性最小的誘變，甲基磺酸乙酯是毒性最小的誘變劑之一。劑之一。3 3吖啶類誘變劑可以造成生化代謝途徑的完全吖啶類誘變劑可以造成生化代謝途徑的完全中斷。中斷

8、。4 4紫外線仍十分有效。電離輻射是造成染色體紫外線仍十分有效。電離輻射是造成染色體巨大損傷的最好誘變劑，它能造成不可回復的巨大損傷的最好誘變劑，它能造成不可回復的缺突變。但它可能影響鄰近基因的性能。缺突變。但它可能影響鄰近基因的性能。三、誘變育種步驟出發(fā)菌株的選擇出發(fā)菌株的選擇處理菌懸液的制備處理菌懸液的制備誘變處理誘變處理中間培養(yǎng)中間培養(yǎng)分離和篩選分離和篩選 誘變誘變育種的步驟育種的步驟：原始菌種原始菌種純化純化斜面斜面/肉湯培養(yǎng)肉湯培養(yǎng)單孢子單孢子/單細胞懸液單細胞懸液誘變劑處理誘變劑處理平板分離平板分離移至斜面移至斜面小試小試中試中試初篩初篩復篩復篩計算存活率計算存活率觀察形態(tài)變異，觀

9、察形態(tài)變異，挑單菌落挑單菌落良種保藏良種保藏原菌種特性鑒定原菌種特性鑒定出發(fā)菌株出發(fā)菌株同步培養(yǎng)同步培養(yǎng) 使菌細胞處于相同或接近的生理狀態(tài)使菌細胞處于相同或接近的生理狀態(tài)單細胞（或單孢子）菌懸液的制備單細胞（或單孢子）菌懸液的制備 單細胞或單孢子的意義單細胞或單孢子的意義 酵母或霉菌孢子酵母或霉菌孢子10106 6 /ml /ml 、細菌、細菌10108 8 /ml /ml 誘變劑的選擇及其劑量的確定誘變劑的選擇及其劑量的確定 以致死率為以致死率為9099 為宜為宜誘變處理誘變處理 物理誘變劑物理誘變劑 化學誘變劑化學誘變劑誘變育種的程序誘變育種的程序 出發(fā)菌株出發(fā)菌株 菌種純化菌種純化 制備

10、斜面孢子制備斜面孢子或菌懸液或菌懸液 誘變處理誘變處理 平板涂布平板涂布 初篩初篩 復篩復篩 傳代穩(wěn)定性實驗傳代穩(wěn)定性實驗 放大試驗放大試驗致死率確定致死率確定性能精測性能精測活菌計數(shù)活菌計數(shù)性能初測性能初測 活菌計數(shù)活菌計數(shù)性能測定性能測定菌種保藏菌種保藏并用于生產(chǎn)并用于生產(chǎn)誘變育種的基本過程：誘變育種的基本過程：選擇選擇合適的出發(fā)菌株選擇選擇合適的出發(fā)菌株制備待處理的菌懸液制備待處理的菌懸液誘變處理誘變處理篩選篩選保藏和擴大試驗保藏和擴大試驗 出發(fā)菌株出發(fā)菌株用來用來育種處理的育種處理的起始菌株起始菌株出發(fā)菌株應具備：出發(fā)菌株應具備： 對誘變劑的敏感性高；對誘變劑的敏感性高； 具有特定生產(chǎn)

11、性狀的能力或潛力；具有特定生產(chǎn)性狀的能力或潛力； 出發(fā)菌株的來源；出發(fā)菌株的來源； 自然界直接分離到的野生型菌株：自然界直接分離到的野生型菌株： 歷經(jīng)生產(chǎn)考驗的菌株：歷經(jīng)生產(chǎn)考驗的菌株： 已經(jīng)歷多次育種處理的菌株：已經(jīng)歷多次育種處理的菌株：( (一一) )出發(fā)菌株的選擇出發(fā)菌株的選擇1自然界新分離的野生型菌株，對誘變處理較敏感，自然界新分離的野生型菌株，對誘變處理較敏感，容易達到好的效果。容易達到好的效果。2在生產(chǎn)中經(jīng)生產(chǎn)選種得到的菌株與野生型較相像，在生產(chǎn)中經(jīng)生產(chǎn)選種得到的菌株與野生型較相像，也是良好的出發(fā)菌株。也是良好的出發(fā)菌株。3每次誘變處理都有一定提高的菌株，往往多次誘每次誘變處理都有

12、一定提高的菌株，往往多次誘變能積累較多的提高。變能積累較多的提高。4出發(fā)菌株開始時可以同時選出發(fā)菌株開始時可以同時選23株，在處理比較株，在處理比較后，將更適合的出發(fā)菌株留作繼續(xù)誘變后，將更適合的出發(fā)菌株留作繼續(xù)誘變。 5要盡量選擇單倍體細胞、單核或核少的多細胞要盡量選擇單倍體細胞、單核或核少的多細胞體來作出發(fā)誘變細胞，這是由于變異性狀大部分體來作出發(fā)誘變細胞，這是由于變異性狀大部分是隱性的，特別是高產(chǎn)基因。是隱性的，特別是高產(chǎn)基因。 6根據(jù)采用的誘變劑或根據(jù)細胞生理狀態(tài)或誘變根據(jù)采用的誘變劑或根據(jù)細胞生理狀態(tài)或誘變譜選擇誘變劑，因為同一誘變劑的重復處理會使譜選擇誘變劑，因為同一誘變劑的重復處

13、理會使細胞產(chǎn)生抗性，使誘變效果下降。有的誘變劑是細胞產(chǎn)生抗性，使誘變效果下降。有的誘變劑是作用于營養(yǎng)細胞，就要選對數(shù)期的細胞：有的作作用于營養(yǎng)細胞，就要選對數(shù)期的細胞：有的作用于休止期，就可選用孢子。用于休止期，就可選用孢子。 ( (二二) )處理菌懸液的制備處理菌懸液的制備n這一步驟的關鍵是制備單細胞和單孢子狀態(tài)這一步驟的關鍵是制備單細胞和單孢子狀態(tài)的、活力類似的菌懸液，為此要進行合適培的、活力類似的菌懸液，為此要進行合適培養(yǎng)基的培養(yǎng)，并要離心，洗滌，過濾。養(yǎng)基的培養(yǎng)，并要離心，洗滌，過濾。制備細胞懸液制備細胞懸液要求：要求： 菌體處于對數(shù)生長期，并使細胞處于同步生長；菌體處于對數(shù)生長期，并

14、使細胞處于同步生長； 細胞分散且為單細胞，以避免細胞分散且為單細胞，以避免表型遲延現(xiàn)象表型遲延現(xiàn)象方法：方法： 玻璃珠打散玻璃珠打散10-15min; 10-15min; 加加.3%.3%吐溫吐溫8080（表面活性劑）（表面活性劑） 用無菌脫脂棉過濾。用無菌脫脂棉過濾。 制備：制備： 物理誘變劑物理誘變劑生理鹽水（生理鹽水（0.85%NaCl) 0.85%NaCl) 化學誘變劑化學誘變劑緩沖液緩沖液 濃度：濃度： 細菌、放線菌細菌、放線菌 10108 8個個/ml /ml 霉菌、酵母菌霉菌、酵母菌 10106 6個個/ml/ml( (三三) )誘變處理誘變處理 根據(jù)前面有關誘變劑及誘變處理的介

15、根據(jù)前面有關誘變劑及誘變處理的介紹，結合誘變對象的實際，設計誘變處紹，結合誘變對象的實際，設計誘變處理方案。理方案。l在選用理化因子作誘變劑時，在同樣效果在選用理化因子作誘變劑時，在同樣效果下，應選用下，應選用最方便最方便的因素；而在同樣方便的因素；而在同樣方便的情況下，則應選擇的情況下，則應選擇最高效最高效的因素。在物的因素。在物理誘變劑中，尤以理誘變劑中，尤以紫外線紫外線為最方便，而在為最方便，而在化學誘變劑中，一般可選用誘變效果最為化學誘變劑中，一般可選用誘變效果最為顯著的顯著的“超誘變劑超誘變劑”，如，如NTGNTG。1 1、選擇誘變劑的種類、選擇誘變劑的種類 誘變劑具有普遍性：某種誘

16、變劑對高等動植物有誘變作用,對微生物也有效。選擇簡便有效的誘變劑：選擇簡便有效的誘變劑： 物理誘變劑:紫外線 化學誘變劑：亞硝酸、亞硝基胍（亞硝酸、亞硝基胍（NTGNTG）、）、 氮芥、吖啶黃等氮芥、吖啶黃等 劑量的表示法劑量的表示法：不同種類和不同生長階段：不同種類和不同生長階段的微生物對誘變劑的敏感程度不同，所的微生物對誘變劑的敏感程度不同，所以在誘變處理前，一般應預先作誘變劑以在誘變處理前，一般應預先作誘變劑用量對菌體死亡數(shù)量的致死曲線，選擇用量對菌體死亡數(shù)量的致死曲線，選擇合適的處理劑量。合適的處理劑量。致死率是最好的誘致死率是最好的誘變劑相對劑量的表示方法。變劑相對劑量的表示方法。2

17、、確定合適的劑量：、確定合適的劑量：劑量的表示方法劑量的表示方法：常用殺菌率表示誘變劑的劑量。：常用殺菌率表示誘變劑的劑量。 殺菌率殺菌率 = =（ mnmn）/m /m 100100 m m：未被處理菌體長出的菌落數(shù)：未被處理菌體長出的菌落數(shù) n n：被處理菌體長出的菌落數(shù)：被處理菌體長出的菌落數(shù) 使用劑量使用劑量：一般劑量：一般劑量誘變率誘變率，但達到一定劑量，但達到一定劑量后劑量后劑量誘變率誘變率。 以前，一般使用以前，一般使用90%-9990%-999 9以上細胞死亡以上細胞死亡的劑量。的劑量。 而近來則傾向于采用殺菌率為而近來則傾向于采用殺菌率為70%-7570%-75的劑量的劑量

18、在生產(chǎn)實踐或科研中，要確定某個誘變劑的合適劑量，在生產(chǎn)實踐或科研中，要確定某個誘變劑的合適劑量，是通過多次試驗后才決定的，而且更換誘變劑或處理不是通過多次試驗后才決定的，而且更換誘變劑或處理不同的菌株，也還要重新進行試驗。同的菌株，也還要重新進行試驗?；瘜W誘變劑劑量的確定化學誘變劑劑量的確定n 決定化學誘變劑劑量的因素主要有誘變劑的決定化學誘變劑劑量的因素主要有誘變劑的濃度、作用溫度和作用時間?；瘜W誘變劑的處濃度、作用溫度和作用時間?；瘜W誘變劑的處理濃度常用幾微克理濃度常用幾微克幾毫克毫升，但是這個幾毫克毫升，但是這個濃度取決于藥劑、溶劑及微生物本身的特性，濃度取決于藥劑、溶劑及微生物本身的特

19、性，還受水解產(chǎn)物的濃度、一些金屬離子以及某些還受水解產(chǎn)物的濃度、一些金屬離子以及某些情況下誘變劑的延遲作用的影響。情況下誘變劑的延遲作用的影響。 n 一般對于一種化學誘變劑，處理濃度對不同一般對于一種化學誘變劑，處理濃度對不同微生物有一個大致范圍，在進行預試驗時，也通微生物有一個大致范圍，在進行預試驗時，也通常是將處理濃度、處理溫度確定后，測定不同時常是將處理濃度、處理溫度確定后，測定不同時間的致死率來確定適宜的誘變劑量。這里需要說間的致死率來確定適宜的誘變劑量。這里需要說明的是化學誘變劑與物理誘變劑不同，在處理到明的是化學誘變劑與物理誘變劑不同，在處理到確定時間后，要有合適的終止反應方法，一

20、般采確定時間后，要有合適的終止反應方法，一般采用稀釋法、解毒劑或改變用稀釋法、解毒劑或改變pH值等方法來終止反應。值等方法來終止反應。 n 要確定一個合適的劑量，通常要經(jīng)過多次試驗，就要確定一個合適的劑量，通常要經(jīng)過多次試驗，就一般微生物而言，誘變頻率往往隨劑量的增高而增一般微生物而言，誘變頻率往往隨劑量的增高而增高，但達到一定劑量后，再提高劑量會使誘變頻率高，但達到一定劑量后，再提高劑量會使誘變頻率下降。根據(jù)對紫外線、下降。根據(jù)對紫外線、x 射線及乙烯亞胺等誘變劑射線及乙烯亞胺等誘變劑誘變效應的研究，發(fā)現(xiàn)正突變較多地出現(xiàn)在較低的誘變效應的研究，發(fā)現(xiàn)正突變較多地出現(xiàn)在較低的劑量中。而負突變則較

21、多地出現(xiàn)在高劑量中，同時劑量中。而負突變則較多地出現(xiàn)在高劑量中，同時還發(fā)現(xiàn)經(jīng)多次誘變而提高產(chǎn)量的菌株中，高劑量更還發(fā)現(xiàn)經(jīng)多次誘變而提高產(chǎn)量的菌株中，高劑量更容易出現(xiàn)負突變。因此，在誘變育種工作中，目前容易出現(xiàn)負突變。因此，在誘變育種工作中，目前較傾向于采用較低劑量。較傾向于采用較低劑量。 n在誘變育種時，有時可根據(jù)實際情況，采用多種在誘變育種時，有時可根據(jù)實際情況，采用多種誘變劑復合處理的辦法。復合處理方法主要有三誘變劑復合處理的辦法。復合處理方法主要有三類：第一類是兩種或多種誘變劑先后使用；第二類：第一類是兩種或多種誘變劑先后使用；第二類是同一種誘變劑的重復使用；第三類是兩種或類是同一種誘變

22、劑的重復使用；第三類是兩種或多種誘變劑的同時使用。如果能使用不同作用機多種誘變劑的同時使用。如果能使用不同作用機制的誘變劑來做復合處理，可能會取得更好的誘制的誘變劑來做復合處理，可能會取得更好的誘變效果。誘變劑的復合處理常呈現(xiàn)一定的協(xié)同效變效果。誘變劑的復合處理常呈現(xiàn)一定的協(xié)同效應，這對誘變育種的工作是很有價值的。應，這對誘變育種的工作是很有價值的。 3、誘變處理方式誘變處理方式 單一因子處理：單一因子處理： 復合因子處理：復合因子處理： 兩種以上因素兩種以上因素先后使用先后使用 同時使用同時使用 單一因子重復使單一因子重復使用用簡便有效的誘變方法：簡便有效的誘變方法：l紫外線的照射最為方便。

23、紫外線的照射最為方便。 化學誘變劑的種類、濃度和處理方法尤其是中止化學誘變劑的種類、濃度和處理方法尤其是中止反應的方法很多，實際工作時可參看有關書籍。一種反應的方法很多，實際工作時可參看有關書籍。一種較有效的簡易處理方法的大致操作步驟是：先在平板較有效的簡易處理方法的大致操作步驟是：先在平板上涂上出發(fā)菌株細胞，然后在平板上均勻地放上幾顆上涂上出發(fā)菌株細胞，然后在平板上均勻地放上幾顆很小的誘變劑顆粒（也可放吸有誘變劑溶液的濾紙很小的誘變劑顆粒（也可放吸有誘變劑溶液的濾紙片），經(jīng)培養(yǎng)后，在制菌圈的邊緣挑取若干突變菌落，片），經(jīng)培養(yǎng)后，在制菌圈的邊緣挑取若干突變菌落，分別制成懸浮液，然后將其涂在一般

24、平板表面使長出分別制成懸浮液，然后將其涂在一般平板表面使長出許多單菌落，最后許多單菌落，最后可用影印培養(yǎng)法或逐個檢出法可用影印培養(yǎng)法或逐個檢出法選出突變種。選出突變種。 ( (四四) )中間培養(yǎng)中間培養(yǎng) 由于在發(fā)生了突變尚未表現(xiàn)出來之前，有由于在發(fā)生了突變尚未表現(xiàn)出來之前，有一個表現(xiàn)延遲的過程，即細胞內(nèi)原有酶量的稀一個表現(xiàn)延遲的過程，即細胞內(nèi)原有酶量的稀釋過程釋過程( (生理延遲生理延遲) )，需，需3 3代以上的繁殖才能將代以上的繁殖才能將突變性狀表現(xiàn)出來。這個過程對今后的篩選和突變性狀表現(xiàn)出來。這個過程對今后的篩選和獲得穩(wěn)定菌株都是極為重要的。獲得穩(wěn)定菌株都是極為重要的。 方法方法 讓變異

25、處理后細胞在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)幾小時，讓變異處理后細胞在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)幾小時，以讓細胞的遺傳物質(zhì)復制，讓細胞繁殖幾代，以以讓細胞的遺傳物質(zhì)復制，讓細胞繁殖幾代，以得到純的變異細胞。這樣，隱性的變異就會顯現(xiàn)得到純的變異細胞。這樣，隱性的變異就會顯現(xiàn)出來，若不經(jīng)液體培養(yǎng)基的中間培養(yǎng)，直接在平出來，若不經(jīng)液體培養(yǎng)基的中間培養(yǎng)，直接在平皿上分離就會出現(xiàn)變異和不變異細胞同時存在于皿上分離就會出現(xiàn)變異和不變異細胞同時存在于一個菌落內(nèi)的可能，形成混雜菌落，以致造成篩一個菌落內(nèi)的可能，形成混雜菌落，以致造成篩選結果的不穩(wěn)定和將來的菌株退化。選結果的不穩(wěn)定和將來的菌株退化。第四節(jié)分離和篩選第四節(jié)分離和篩選n篩選

26、分初篩和復篩。初篩以迅速篩出大量的達到初篩選分初篩和復篩。初篩以迅速篩出大量的達到初步要求的分離菌落為目的，以量為主。步要求的分離菌落為目的，以量為主。n復篩則是精選，以質(zhì)為主，也就是以精確度為主。復篩則是精選，以質(zhì)為主，也就是以精確度為主。因此在具體方法上就有差異因此在具體方法上就有差異. . 例如初篩可以在平皿上直接以菌落的代謝產(chǎn)物與某例如初篩可以在平皿上直接以菌落的代謝產(chǎn)物與某些染料或基質(zhì)的作用形成的變色圈或透明圈的大小些染料或基質(zhì)的作用形成的變色圈或透明圈的大小來挑取參加復篩者，而將來挑取參加復篩者，而將90%90%的菌落淘汰。在數(shù)量減的菌落淘汰。在數(shù)量減少后就要仔細比較參加復篩和再復

27、篩的菌株，最后少后就要仔細比較參加復篩和再復篩的菌株，最后才能選得優(yōu)秀菌株。在以后的復篩階段，還應不斷才能選得優(yōu)秀菌株。在以后的復篩階段，還應不斷結合自然分離，純化菌株。結合自然分離，純化菌株。 實際工作中，為了提高篩選效率，往往將篩選工作分實際工作中，為了提高篩選效率，往往將篩選工作分為初篩和復篩兩步進行。為初篩和復篩兩步進行。 初篩的目的：刪去明確不符合要求的大部分菌株，把初篩的目的：刪去明確不符合要求的大部分菌株，把生產(chǎn)性狀類似的菌株盡量保留下來，使優(yōu)良性狀的菌生產(chǎn)性狀類似的菌株盡量保留下來，使優(yōu)良性狀的菌株不至于漏網(wǎng)；因此，初篩工作以量為主，測定的精株不至于漏網(wǎng)；因此，初篩工作以量為主

28、，測定的精確性還在其次；初篩手段應盡可能快速、簡單。確性還在其次；初篩手段應盡可能快速、簡單。 復篩的目的：確認符合要求的菌株；復篩的目的：確認符合要求的菌株；復篩以質(zhì)為復篩以質(zhì)為主，應精確測定每個菌株的生產(chǎn)指標。主，應精確測定每個菌株的生產(chǎn)指標。篩選方案篩選方案 整個篩選工作分兩步比較好。 第一步為初篩階段:選出菌株數(shù)目要多,但準確性要求不高，基本可以不讓高產(chǎn)變異菌株遺漏,又可以減少許多工作量。 一般采用一些方法加以簡化，如利用形態(tài)突變直接淘一般采用一些方法加以簡化，如利用形態(tài)突變直接淘汰低產(chǎn)變異菌株，或利用平皿反應直接挑取高產(chǎn)變異菌汰低產(chǎn)變異菌株，或利用平皿反應直接挑取高產(chǎn)變異菌株等。株等

29、。 平皿反應是指每個變異菌落產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物與培養(yǎng)平皿反應是指每個變異菌落產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物與培養(yǎng)基內(nèi)的指示物在培養(yǎng)基平板上作用后表現(xiàn)出一定的生理基內(nèi)的指示物在培養(yǎng)基平板上作用后表現(xiàn)出一定的生理效應，如變色圈、透明圈、生長圈、抑菌圈等，這些效效應，如變色圈、透明圈、生長圈、抑菌圈等，這些效應的大小表示變異菌株生產(chǎn)活力的高低，以此作為篩選應的大小表示變異菌株生產(chǎn)活力的高低，以此作為篩選的標志。的標志。 常用的方法有紙片培養(yǎng)顯色法、透明圈法、瓊脂塊常用的方法有紙片培養(yǎng)顯色法、透明圈法、瓊脂塊培養(yǎng)法等。培養(yǎng)法等。 第二步為復篩階段:測定的菌株數(shù)目較少,準確性要求高,這樣可以通過重復測定,從中選出最好的菌株

30、。 復篩常采用搖瓶或臺式發(fā)酵罐進行放大試驗,以進行接近實際的生產(chǎn)性能測定。 經(jīng)篩選后獲得的優(yōu)良菌株,進行保藏,供生產(chǎn)需要時用?？梢?，設計和采用效率高的篩選方案和方可見，設計和采用效率高的篩選方案和方法極其重要。法極其重要。以選育高產(chǎn)突變株為例，誘變育種的基本環(huán)節(jié)概括如下：以選育高產(chǎn)突變株為例，誘變育種的基本環(huán)節(jié)概括如下：第一輪：第一輪：一個出發(fā)菌株一個出發(fā)菌株選出選出200個菌株個菌株選出選出50株株選出選出5株株誘變處理初篩（每瓶一株）復篩（每瓶四株）第二輪第二輪：5個出發(fā)菌株個出發(fā)菌株 選出選出50株株 選出選出5株株40株株40株株40株株40株株40株株誘變處理初篩復篩（每瓶一株）（每

31、瓶四株）第五節(jié)變異菌的一般篩選方法第五節(jié)變異菌的一般篩選方法1、 平皿快速檢測法平皿快速檢測法l變色圈法變色圈法l透明圈法透明圈法l生長圈法生長圈法l抑菌圈法抑菌圈法l梯度平板法梯度平板法2、 搖瓶培養(yǎng)法搖瓶培養(yǎng)法紫外線的誘變育種（細菌）紫外線的誘變育種（細菌）n 紫外線誘變一般采用紫外線誘變一般采用15W紫外線殺菌燈，波長紫外線殺菌燈，波長為為253.7A燈與處理物的距離為燈與處理物的距離為1530cm，照射時間依菌種而異，一般為幾秒至幾十分鐘。照射時間依菌種而異，一般為幾秒至幾十分鐘。一般我們常以細胞的死亡率表示，希望照射的劑一般我們常以細胞的死亡率表示，希望照射的劑量死亡率控制在量死亡率

32、控制在70%80%為宜。為宜。 (一一)要求要求n 被照射的菌懸液細胞數(shù)，細菌為被照射的菌懸液細胞數(shù)，細菌為106個個ml左右，霉菌孢子和酵母細胞為左右，霉菌孢子和酵母細胞為106107個個ml。由于紫外線穿透力不強，要求照射液不。由于紫外線穿透力不強，要求照射液不要太深，約要太深，約0.51.0cm厚，同時要用電磁攪厚，同時要用電磁攪拌器或手工進行攪拌，使照射均勻。拌器或手工進行攪拌，使照射均勻。n由于紫外線照射后有光復活效應，所以照射由于紫外線照射后有光復活效應，所以照射時和照射后的處理應在紅燈下進行。時和照射后的處理應在紅燈下進行。1將細菌培養(yǎng)液以將細菌培養(yǎng)液以3000rmin離心離心5

33、min，傾上，傾上清液，將菌體打散加入無菌生理鹽水再離心洗滌。清液，將菌體打散加入無菌生理鹽水再離心洗滌。 2將菌懸液放入一巳滅菌的，裝有玻璃珠的三角瓶將菌懸液放入一巳滅菌的，裝有玻璃珠的三角瓶內(nèi)用手搖動，以打散菌體。將菌液倒入有定性濾內(nèi)用手搖動，以打散菌體。將菌液倒入有定性濾紙的漏斗內(nèi)過濾，單細胞濾液裝入試管內(nèi)，一般紙的漏斗內(nèi)過濾，單細胞濾液裝入試管內(nèi)，一般處于渾濁態(tài)的細胞液含細胞數(shù)可達處于渾濁態(tài)的細胞液含細胞數(shù)可達108個個ml左右，左右，作為待處理菌懸液。作為待處理菌懸液。 (二二)操作步驟操作步驟3 3取取2 24m14m1制備的菌液加到直徑制備的菌液加到直徑9cm9cm培養(yǎng)皿內(nèi)，放入

34、培養(yǎng)皿內(nèi)，放入一無菌磁力攪拌子，然后置磁力攪拌器上、一無菌磁力攪拌子，然后置磁力攪拌器上、15W15W紫紫外線下外線下30cm30cm處。在正式照射前，應先開紫外線處。在正式照射前，應先開紫外線10min10min，讓紫外燈預熱，然后開啟皿蓋正式在攪拌，讓紫外燈預熱，然后開啟皿蓋正式在攪拌下照射下照射101050s50s。操作均應在紅燈下進行，或用黑。操作均應在紅燈下進行，或用黑紙包住，避免白熾光。紙包住，避免白熾光。 4取未照射的制備菌液和照射菌液各取未照射的制備菌液和照射菌液各o.5ml進進行稀釋分離，計數(shù)活菌細胞數(shù)。行稀釋分離，計數(shù)活菌細胞數(shù)。 5取照射菌液取照射菌液2ml于液體培養(yǎng)基中

35、于液體培養(yǎng)基中(300ml三三角瓶內(nèi)裝角瓶內(nèi)裝30ml培養(yǎng)液培養(yǎng)液)，120rmin振蕩培養(yǎng)振蕩培養(yǎng)46h。 6取中間培養(yǎng)液稀釋分離、培養(yǎng)。取中間培養(yǎng)液稀釋分離、培養(yǎng)。 7挑取菌落進行篩選。挑取菌落進行篩選。亞硝基胍誘變曲霉菌亞硝基胍誘變曲霉菌n N甲基甲基N-硝基硝基-N-亞硝基胍亞硝基胍(NGN，MNNG或或TG)對真核或原核微生物都有強烈的對真核或原核微生物都有強烈的誘變作用。其精確的作用機制尚不很清楚，據(jù)誘變作用。其精確的作用機制尚不很清楚，據(jù)認為是伴隨著重氮甲烷的生成及在酸性條件下認為是伴隨著重氮甲烷的生成及在酸性條件下生成亞硝酸，直接作用于細胞內(nèi)的生成亞硝酸，直接作用于細胞內(nèi)的DN

36、A復制系復制系統(tǒng)，從而誘發(fā)了變異。統(tǒng)，從而誘發(fā)了變異。MNNG的誘變作用隨的誘變作用隨pH的升高而增強。的升高而增強。n (一一)原理原理n1單孢子懸液制備單孢子懸液制備 取斜面，加入取斜面，加入6ml 0.1molL pH6.o的磷酸緩沖液，用接種環(huán)刮下孢子，的磷酸緩沖液，用接種環(huán)刮下孢子，振蕩試管，立即通過帶濾紙漏斗過濾，由此制得振蕩試管，立即通過帶濾紙漏斗過濾，由此制得單孢子懸液，若孢子液渾濁狀，其孢子濃度可達單孢子懸液，若孢子液渾濁狀，其孢子濃度可達l06個個ml，此為待處理孢子懸液。，此為待處理孢子懸液。 2MNNG溶液的制備溶液的制備 用分析天平稱取用分析天平稱取2mg，加，加入入

37、2ml 0.1molL pH 6.0磷酸緩沖液，于暗處磷酸緩沖液，于暗處振蕩溶解。振蕩溶解。n (二二)操作步驟操作步驟3誘變處理誘變處理 吸取吸取MNNG溶液溶液lml，加入到，加入到1m1孢子懸液中，孢子懸液中，30振蕩振蕩30min，立即稀釋，立即稀釋1000倍停止作用，然后以倍停止作用，然后以10-2，10-4兩個稀釋度分離兩個稀釋度分離培養(yǎng)，培養(yǎng)，30 3天后計數(shù)。天后計數(shù)。4死亡率計算死亡率計算 將未處理的孢子液將未處理的孢子液1ml加入加入1ml磷磷酸緩沖液中，同上逐級稀釋分離，酸緩沖液中，同上逐級稀釋分離， 30下培養(yǎng)下培養(yǎng)3天。根據(jù)處理前后的活孢子數(shù)可計算出死亡率。天。根據(jù)處

38、理前后的活孢子數(shù)可計算出死亡率。5挑取菌落進行糖化酶及蛋白酶產(chǎn)量篩選挑取菌落進行糖化酶及蛋白酶產(chǎn)量篩選第六節(jié)第六節(jié) 營養(yǎng)缺陷型的選育營養(yǎng)缺陷型的選育n 營養(yǎng)缺陷型是指通過誘變而產(chǎn)生的缺乏合成營養(yǎng)缺陷型是指通過誘變而產(chǎn)生的缺乏合成某些營養(yǎng)物質(zhì)如氨基酸、維生素和堿基等的能某些營養(yǎng)物質(zhì)如氨基酸、維生素和堿基等的能力，必須在其基本培養(yǎng)基中加入相應的營養(yǎng)成力，必須在其基本培養(yǎng)基中加入相應的營養(yǎng)成分才能正常生長的變異株。分才能正常生長的變異株。n 與營養(yǎng)缺陷型對應的是野生型與營養(yǎng)缺陷型對應的是野生型。n能滿足野生型菌株正常生長的培養(yǎng)基稱基本培能滿足野生型菌株正常生長的培養(yǎng)基稱基本培養(yǎng)基養(yǎng)基(MM)；n在基

39、本培養(yǎng)基中加入相應的營養(yǎng)成分的稱補充在基本培養(yǎng)基中加入相應的營養(yǎng)成分的稱補充培養(yǎng)基培養(yǎng)基(SM)；n能滿足各種營養(yǎng)缺陷型生長的稱完全培養(yǎng)基能滿足各種營養(yǎng)缺陷型生長的稱完全培養(yǎng)基(CM)，如牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、麥芽汁培養(yǎng)，如牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、麥芽汁培養(yǎng)基等?；?。營養(yǎng)缺陷型突變株的用途 作為雜交的手段作為雜交的手段 作為生產(chǎn)核苷酸或氨基酸等生產(chǎn)菌株作為生產(chǎn)核苷酸或氨基酸等生產(chǎn)菌株 在科研中，它可用來了解生物體內(nèi)氨基在科研中，它可用來了解生物體內(nèi)氨基酸和核苷酸等物質(zhì)的合成途徑，并可作為酸和核苷酸等物質(zhì)的合成途徑，并可作為氨基酸、維生素或堿基等物質(zhì)生物測定的氨基酸、維生素或堿基等物質(zhì)生物測定的試驗

40、菌種，也是研究雜交、轉化、轉導等試驗菌種，也是研究雜交、轉化、轉導等遺傳重組規(guī)律的不可缺少的基因標記菌種。遺傳重組規(guī)律的不可缺少的基因標記菌種。篩選營養(yǎng)缺陷型的步驟篩選營養(yǎng)缺陷型的步驟n誘變誘變n淘汰野生型淘汰野生型n檢出缺陷型檢出缺陷型n確定生長譜確定生長譜誘變誘變淘汰野生型淘汰野生型檢出檢出鑒定營養(yǎng)缺陷型鑒定營養(yǎng)缺陷型誘變誘變淘汰野生型淘汰野生型:抗生素法、菌絲過濾法抗生素法、菌絲過濾法檢出缺陷型：檢出缺陷型： 同一平板同一平板夾層培養(yǎng)、限量補充夾層培養(yǎng)、限量補充 不同平板不同平板逐個檢出、影印接種逐個檢出、影印接種鑒定營養(yǎng)缺陷型：生長譜法鑒定營養(yǎng)缺陷型：生長譜法篩選方法篩選方法:一、誘變

41、方法一、誘變方法n物理誘變物理誘變n化學誘變化學誘變二、淘汰野生型二、淘汰野生型n 在誘變處理后的存活個體中，營養(yǎng)缺陷在誘變處理后的存活個體中，營養(yǎng)缺陷型的比例一般很低，通常只有百分之幾至型的比例一般很低，通常只有百分之幾至千分之幾，采用抗菌素法或菌絲過濾法，千分之幾，采用抗菌素法或菌絲過濾法，可以淘汰為數(shù)眾多的野生型菌株，從而達可以淘汰為數(shù)眾多的野生型菌株，從而達到濃縮營養(yǎng)缺陷型的目的。到濃縮營養(yǎng)缺陷型的目的。1、抗生素法：、抗生素法：n 野生型能在基本培養(yǎng)基（野生型能在基本培養(yǎng)基（ MM ）中生長，）中生長，而缺陷型不能，于是將誘變處理液在而缺陷型不能，于是將誘變處理液在MM中培中培養(yǎng)短時

42、讓野生型生長，處于活化階段，而缺陷養(yǎng)短時讓野生型生長，處于活化階段，而缺陷型無法生長，仍處于休眠狀態(tài)。由于細菌或酵型無法生長，仍處于休眠狀態(tài)。由于細菌或酵母對一些抗生素敏感，于是就相應加入一定量母對一些抗生素敏感，于是就相應加入一定量的抗生素，結果活化狀態(tài)的野生型就被殺死，的抗生素，結果活化狀態(tài)的野生型就被殺死，保存了缺陷型。一般細菌可以采用青霉素，酵保存了缺陷型。一般細菌可以采用青霉素，酵母可采用制霉菌素。母可采用制霉菌素。2、菌絲過濾法、菌絲過濾法n 菌絲過濾法只適用于絲狀真菌，其原理是在基本菌絲過濾法只適用于絲狀真菌，其原理是在基本培養(yǎng)基中，野生型的孢子能發(fā)芽成菌絲，而營養(yǎng)缺培養(yǎng)基中，野

43、生型的孢子能發(fā)芽成菌絲，而營養(yǎng)缺陷型則不能。因此將誘變處理后的孢子在基本培養(yǎng)陷型則不能。因此將誘變處理后的孢子在基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)一段時間后，基中培養(yǎng)一段時間后，就可用濾紙過濾法將菌絲濾就可用濾紙過濾法將菌絲濾去，而缺陷型孢子卻因未發(fā)芽而不能濾過。去，而缺陷型孢子卻因未發(fā)芽而不能濾過。如此重如此重復數(shù)次后，就可以除去大部分野生型菌株，同樣達復數(shù)次后，就可以除去大部分野生型菌株，同樣達到到“濃縮濃縮”營養(yǎng)缺陷型的目的營養(yǎng)缺陷型的目的。淘汰野生型-菌絲過濾法基本培養(yǎng)基 接入微生物孢子 涂布均勻后培養(yǎng)長出菌絲體（野生型）菌絲過濾得營養(yǎng)突變株 三、檢出缺陷型三、檢出缺陷型n 營養(yǎng)缺陷型的檢出方法很多，主

44、要有影印法、夾營養(yǎng)缺陷型的檢出方法很多，主要有影印法、夾層法、逐個檢出法、限量補充培養(yǎng)法等四種。層法、逐個檢出法、限量補充培養(yǎng)法等四種。n原理：在固體基本培養(yǎng)基和完全培養(yǎng)基上，生長原理：在固體基本培養(yǎng)基和完全培養(yǎng)基上，生長情況完全不同，缺陷型在情況完全不同，缺陷型在完全培養(yǎng)基（完全培養(yǎng)基（ CM ）上生長良好，而在上生長良好，而在MM上則不生長，野生型都能上則不生長，野生型都能生長。生長。 n1 1將一較平皿直徑小將一較平皿直徑小1cm1cm的金屬圓筒蒙上一層滅的金屬圓筒蒙上一層滅菌的絲絨，用金屬夾夾住，滅菌。菌的絲絨，用金屬夾夾住，滅菌。n2 2將完全培養(yǎng)基上長出的全部菌落在絲絨上輕輕將完全

45、培養(yǎng)基上長出的全部菌落在絲絨上輕輕一壓，使之成為印模，標記方位。一壓，使之成為印模，標記方位。n3 3將基本培養(yǎng)基平皿和完全培養(yǎng)基平皿在標記的將基本培養(yǎng)基平皿和完全培養(yǎng)基平皿在標記的同一方位上先后輕輕一壓，此菌印模即復印于上。同一方位上先后輕輕一壓，此菌印模即復印于上。 ( (一一) )影印法影印法n4 4 將將CMCM和和MMMM在恒溫箱中培養(yǎng)。在恒溫箱中培養(yǎng)。n5 5二平皿相同方位進行比較，二平皿相同方位進行比較， 即可發(fā)現(xiàn)在即可發(fā)現(xiàn)在MMMM平皿上長出的菌落少于平皿上長出的菌落少于GMGM平板上的。平板上的。MMMM上未上未長而相應于長而相應于CMCM上長出的那幾個菌落就可能是缺上長出的

46、那幾個菌落就可能是缺陷型。陷型。n此法要求平皿上菌落不能太多，菌落之間應有此法要求平皿上菌落不能太多，菌落之間應有一定間隔。一定間隔。影印影印平板法Velveteen (錦絨布）錦絨布）Auxotroph (營養(yǎng)缺陷型營養(yǎng)缺陷型)Prototroph (原養(yǎng)型原養(yǎng)型)（二）逐個檢出法（二）逐個檢出法n是將經(jīng)過誘變處理的細胞涂布在完全培養(yǎng)基是將經(jīng)過誘變處理的細胞涂布在完全培養(yǎng)基平板上，待長出單個菌落后，用接種針或牙平板上，待長出單個菌落后，用接種針或牙簽將這些單個菌落逐個依次地分別接種到基簽將這些單個菌落逐個依次地分別接種到基本培養(yǎng)基和另一完全培養(yǎng)基平板上。經(jīng)培養(yǎng)本培養(yǎng)基和另一完全培養(yǎng)基平板上。經(jīng)培養(yǎng)后，如果在完全培養(yǎng)基上長出菌落，而在基后，如果在完全培養(yǎng)基上長出菌落，而在基本培養(yǎng)基上卻不長菌落，說明這是一個營養(yǎng)本培養(yǎng)基上卻不長菌落，說明這是一個營養(yǎng)缺陷型菌株缺陷型菌株。 檢出缺陷型-逐個檢出法涂布