基于RNA-seq技術(shù)的宮頸癌與癌旁組織差異表達基因分析

1、基于rna-seq技術(shù)的宮頸癌與癌旁組織 差異表達基因分析張志珊蔣燕成陳紫萱陳婉花李愛祿李純孝福建醫(yī)科大學(xué)附屬泉州第一醫(yī)院摘要：目的探討宮頸癌的發(fā)病機制。方法應(yīng)用rna-seq技術(shù)分析3對宮頸癌及癌旁組 織轉(zhuǎn)錄組，利用生物信息方法對差異基因進行基因本體(go)分析和通路富集 性分析。結(jié)果在宮頸癌組織中發(fā)現(xiàn)1755個差界表達基因，其中758個基因表達 上調(diào)，997個基因表達下調(diào)。功能富集分析表明，差異基因富集于細胞粘附、dna 損傷有關(guān)的信號通路上。且宮頸癌組織中發(fā)現(xiàn)rab22a-bcas1等融合基因。結(jié)論 細胞粘附信號通路、rab22a-bcas1融合基因可能與宮頸癌的發(fā)生機制有關(guān)。關(guān)鍵詞：宮

2、頸癌;rna-seq;轉(zhuǎn)錄組;差異表達基因;融合基因;收稿日期：2017-06-22基金：福建省自然科學(xué)基金(編號:2014j01436)analysis of differently expressed genes of tumor and adjacentnon一tumor tissues from patients with cervical cancer by rna sequencingzhang zhishan jiang yancheng chen zixuanquanzhou first hospital, fujian medicaluniversity;abstract：o

3、bjective to explore the possible pathogenesy of cervical cancer. methods rna sequencing was performed to screen the differently expressed genes of 3 pairs of cervical carcinoma and matched adjacent non-tirnior tissues. the differently expressed genes were identified with gene ontology (go) analysis

4、and pathway cnrichment emalysis. rcsuits there were a t otal of 1755 cliff ere ntly expressed genes in the samples, including 758 up-regulated genes and 997 down-regulated genes. these differently expressed genes were enriched in pathway related to cell adhesion and dna damage. moreover, rab22 a-bca

5、s1 fusion gene was found in cervical ceincer tissues. conclusion the pathway of cell adhesion and rab22 a-bcas1 fusion gene may be related to the tumorigenesis and development of cervical cancer.keyword：cervical careinoma; rna-seq; transcriptome; differently expressed gene; fusion gene;received： 201

6、7-06-22宮頸癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，人乳頭狀瘤病毒(hpv)的感染是引起宮 頸癌的重要因素，但并非所有感染hpv的患者都會發(fā)展為宮頸癌，只有hpv持續(xù) 感染導(dǎo)致細胞的基因組異常才最終導(dǎo)致宮頸癌的發(fā)生。本研究擬收集福建醫(yī)科大 學(xué)附屬泉州第一醫(yī)院婦科就診的宮頸癌患者3例，釆用rna-seq技術(shù)分析宮頸癌 組織與癌旁組織的轉(zhuǎn)錄組，篩選出差異表達基因，進而分析差異表達基因所涉 及的信號通路以及融合基因表達，有利于闡明宮頸癌的發(fā)病機制，尋找宮頸癌 特異的分子標志物，同時也為基因藥物的開發(fā)提供候選的藥物作用靶點。1材料與方法1.1研究對象收集福建醫(yī)科大學(xué)附屬泉州第一醫(yī)院婦科就診的宮頸癌患者3例

7、，術(shù)前經(jīng)未經(jīng) 放化療及藥物治療，經(jīng)病理組織學(xué)確診為宮頸癌iib期，同時取癌組織和癌旁 組織(距離宮頸癌癌灶邊緣3 cm),置于rna保存液中-80°c保存。1.2 rna提取及質(zhì)檢3對癌組織及癌旁組織分別用qiagen微量rna提取試劑盒按操作說明書提取 rna。瓊脂糖凝膠電泳分析rna的純度和完整性，nanodrop檢測rna的純度(0d 260/280比值),qubit 2.0對rna濃度進行精確定量,agilent 2100精確檢測 rna的完整性。1. 3文庫構(gòu)建及測序 用帶有oligo (d t)的磁珠富集真核生物mrna,加入fragmentationbuffer將 mr

8、ta打斷成短片段，以mr-na為模板，用六堿基隨機引物(random hexamers) 合成一鏈c dna,加入緩沖液、d ntps和dma polymerase i和rnase h合成二 鏈c dna,利用ampurc xp beads純化雙鏈c dna。純化的雙鏈c dna先進行末 端修復(fù)、加a尾并連接測序接頭，再用ampure xpbeads進行片段大小選擇。采 取pcr擴增，用ampure xp beads純化pcr產(chǎn)物，得到文庫。文庫構(gòu)建完成后，先 使用qubit 2.0進行初步定量，稀釋文庫，使用agilent2100對文庫的插入片段 進行檢測，使用q-pcr方法對文庫的有效濃度

9、進行準確定量，保證文庫質(zhì)量。文 庫檢測合格后，使用illumina高通量測序平臺(hi scq/mi sep)進行測序。1. 4測序數(shù)據(jù)分析測序數(shù)據(jù)的質(zhì)量主要分布在q30以上，才能保證后續(xù)高級分析的正常進行。將原 始數(shù)據(jù)中包含的接頭(adapter)信息、低質(zhì)量堿基、未測出的堿基去除，得到 最終的有效數(shù)據(jù)(clean data)。利用top hat2軟件將獲得的數(shù)據(jù)與參考基因 組進行序列比對，比對到指定的參考基因組上的reads稱為mapped reads,利 用cufflinks軟件將mapped reads進行轉(zhuǎn)錄本拼接，利用cufflinks軟件計算 癌組織和癌旁組織基因表達量。1. 5

10、差異表達基因篩選應(yīng)用cuff di ff軟件進行分析，在不同樣本組差異表達rna檢測過程中，將fold change2且fdr0. 05作為篩選標準。差異倍數(shù)(fold change)表示兩樣品間 表達量的比值。1. 6差異表達基因通路富集及基因本體(go)分析應(yīng)用信號通路分析軟件(ipa)對2組樣木差異表達基因進行信號通路富集、疾 病功能富集分析，利用軟david工具進行g(shù)0分析。1. 7融合基因分析應(yīng)用top hat fusion分析融合基因，tophat fusion通過將未能比對到參考基 因組的reads打碎成25 bp的片段，然后采用bowtie將25 bp的片段比對到基 因組，從而

11、找岀比對到兩個染色體的片段或者比對到同一染色體不同位置的 readso2結(jié)果2.1差異表達基因分析將癌組織和癌旁組織相比，共發(fā)現(xiàn)1755個差異表達基因，癌組織相對于癌旁組 織樣本中有758個基因表達量上調(diào)，997個基因表達量下調(diào)。2. 2 go及通路分析 1755個差異基因共富集到582條go_bp, 1755個差異表達基因共富集到378條 通路。這些差異表達的基因主要涉應(yīng)粘附、dna損傷等通路。最有意義的前5條 信號通路富集結(jié)果如表1所示。表1癌組織和癌旁組織差界表達基因前5條信號通路富集結(jié)果下載原表2. 3融合基因分析癌組織屮存在的融合基因，分析結(jié)果及說明見表2。表2融合基因分析結(jié)果及說明

12、下載原表3討論雖然高危型hpv的持續(xù)感染是引起宮頸癌的根本原因，但僅有一小部分感染者 發(fā)展為宮頸癌£11。目前眾多研究證實宮頸組織基因水平上表達異常會誘發(fā)宮頸 癌的發(fā)生宜。rna-seq技術(shù)不僅能檢測組織已知基因的轉(zhuǎn)錄活動，還能檢測未 知基因rl本研究中收集福建醫(yī)科大學(xué)附屬泉州第一醫(yī)院婦科就診的宮頸癌患者3例，采 取rna-seq技術(shù)，共發(fā)現(xiàn)1755個差異表達基因，共富集到582條go種類和378 條通路，這些差異表達的基因主要涉及粘附、dna損傷等通路。排在前2位的通 路均與細胞粘附和滲出有關(guān)，而細胞粘附分子在細胞的粘附與滲出中起重要的 作用。研究顯示細胞粘附分子與宮頸癌的侵襲轉(zhuǎn)移

13、有密切關(guān)系。在宮頸癌的形成、 發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程中，細胞粘附分子起著至關(guān)重要的作用皿?；罨准毎掣椒?子在不同惡變程度宮頸癌屮的表達存在差異，并在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展過程屮表 達量呈上升趨勢固。因此我們推測與細胞粘附相關(guān)的信號通路可能在宮頸癌的 發(fā)生中起一定的作用。融合基因是指兩個基因的編碼區(qū)首尾相連構(gòu)成的嵌合基因。融合基因編碼的蛋白 通常具有致癌性，會影響細胞的正常生理功能，是導(dǎo)致癌癥的主要原因之一。目 前，在肺癌、甲狀腺、乳腺癌等疾病屮，都發(fā)現(xiàn)了融合基因的存在6-7,但是 與宮頸癌的相關(guān)性尚未見報道。本研究通過rna-seq技術(shù)檢測宮頸癌組織和癌旁 組織的轉(zhuǎn)錄組發(fā)現(xiàn)，與癌旁組織相比，3個宮頸癌組

14、織中都存在不同程度的融合 基因。其中rab22a-bcas1融合基因有2個宮頸癌樣木中同時存在orab22a是ras 相關(guān)的小g蛋白家族成員，是囊泡運輸重要的調(diào)節(jié)因子。rab22a在包括肝癌、 黑色素瘤、卵巢癌、骨肉瘤在內(nèi)的多種腫瘤中過表達吐1。乳腺癌擴增序列-1 (bcas1)位于20ql3.2區(qū)域，bcas1高表達在乳腺癌浸潤和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要的作 用10, bcas1還參與三陰乳腺癌的發(fā)生11。此外，有研究表明，bcas1還與 前列腺癌、胃食管連接處腺癌、月夷腺癌相關(guān)12。rab22a. bcas1與宮頸癌的相 關(guān)性尚未見報道，而rab22a-bcas1融合基因以及本研究中發(fā)現(xiàn)的其他融合基

15、因 是否為導(dǎo)致宮頸癌的潛在致癌基因，在后續(xù)的研究中，我們將擴大樣本量進行 進一步的驗證。綜上所述，我們通過高通量rna-seq技術(shù)分析宮頸癌及癌旁轉(zhuǎn)錄組，發(fā)現(xiàn)1755 個差異表達基因，這些差異表達基因富集到與細胞粘附、dna損傷等信號通路上, 且發(fā)現(xiàn)了 rab22a-bcas1等融合基因，推測可能與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)，為 后續(xù)進一步研究宮頸癌的發(fā)生機制提供了新的方向和思路。參考文獻1 moody ca, laimins la. hunrnn papillomavirus oncoproteins:pathways totransforniationjnat rev cancer, 2010

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17、胞粘附分子與宮頸癌的侵襲轉(zhuǎn)移j西南軍醫(yī)，200& 105 : 95-97.5 楊瀟，王艷清，鮮舒等活化白細胞黏附分子在宮頸癌中的表達及功能研究 j醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)雜志,2016, 13 (5) :267-271.6 wu ym, su f, kalyana-sundaram s, et al. idemtification of targetable fgfr gene fusions in diverse camccrsj.cemccr discov, 2013, 36 : 636-647.7 panagopoulos i, gorunova l, bjerkehagen b, et

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