IPTG誘導蛋白表達的原理

1、IPTG誘導蛋白表達的原理IPTG誘導的產物是重組后表達載體中的插入序列所能夠翻譯的蛋白，并可視載體構建情況翻譯后續(xù)的標簽序列。用乳糖操縱子作為啟動子進行蛋白質表達的時候 ,需要誘導物進行誘導(相當于點火 ),但乳糖可以被細胞利用掉 ,所以利用 IPTG(異丙基 -D-硫代半乳糖苷 )在結構上與乳糖的相似性也可以將 基因表達 啟動 ,但它不能被細胞利用掉 ,從而實現(xiàn)持續(xù)的表達 .IPTG 是一種誘導外源基因表達的誘導劑，它不僅僅如我們學過的作為乳糖的類似物誘導大腸桿菌表達半乳糖苷酶， 它是一種普遍應用的誘導劑，能誘導菌種表達多種外源基因。但是它能誘導基因表達的具體原理我卻了解的不是很多，我在網

2、上查到以下一些內容，供查閱者借鑒。最早應用于的表達系統(tǒng)是 Lac 乳糖操縱 子，乳糖的類似物 IPTG 可以和 lacI 產物結合，使其構象改變離開 lacO，從而激活轉錄 .這種可誘導的轉錄調控成為了大腸桿菌表 達系統(tǒng)載體構建的常用元件。 tac 啟動子是 trp 啟動子和 lacUV5 的拼接雜合啟動子，且轉錄水平更高，比 lacUV5 更優(yōu)越。 trc 啟動 子是 trp 啟動子和 lac 啟動子的拼合啟動子， 同樣具有比 trp 更高的轉錄效率和受 lacI 阻遏蛋白調控的強啟動子特性。在常規(guī)的大腸桿菌中， lacI 阻遏蛋白表達量不高，僅能滿足細胞自身的lac 操縱子，無法應付多拷貝

3、的質粒的需求，導致非誘導條件下較高的本底表達，為了讓表達系統(tǒng)嚴謹調控產物表達，能過量表達lacI 阻遏蛋白的lacIq 突變菌株常被選為Lac/Tac/trc 表達系統(tǒng)的表達菌株?，F(xiàn)在的 Lac/Tac/trc 載體 上通常還帶有 lacIq 基因，以表達更多 lacI 阻遏蛋白實現(xiàn)嚴謹?shù)恼T導調控。 IPTG 廣泛用于誘導表達系統(tǒng)， 但是 IPTG 有一定 毒性，有人認為在制備醫(yī)療目的的重組蛋白并不合適， 因而也有用乳糖代替 IPTG 作 為誘導物的研究。另外一種研究方向是用lacI 的溫度敏感突變體， 30度下抑制轉錄， 42 度開發(fā)。熱誘導不用添加外來的誘導物，成本低，但是由于發(fā)酵過程中加

4、熱升溫比較慢而影響誘導效果，而且熱誘導本身會導致大腸桿菌的熱休克蛋白激活，一些蛋白酶會影響產物穩(wěn)定.T7 啟動子是當今大腸桿菌表達系統(tǒng)的主流，這個功能強大兼專一性高的啟動子經過巧妙的設計而成為原核表達的首選，尤其以Novagen 公司的 pET 系統(tǒng)為杰出代表。強大的 T7 啟動子完全專一受控于 T7 RNA 聚合酶，而高活性的 T7 RNA 聚合酶合成 mRNA 的速度比大腸桿菌 RNA 聚合酶快 5 倍 當二者同時存在時， 宿主本身基因的轉 錄競爭不過 T7 表達系統(tǒng)，幾乎所有的細胞資源都用于表達目的蛋白；誘導表達后僅 幾個小時目的蛋白通?？梢哉嫉郊毎偟?白的 50%以上。由于大腸桿菌本

5、身不含 T7 RNA 聚合酶，需要將外源的 T7 RNA 聚合酶 引入宿主菌，因而 T7 RNA 聚合酶的調控模式就決定了 T7 系統(tǒng)的調控模式 非誘導條件下，可以使目的基因完全處于沉默狀 態(tài)而不轉錄，從而避免目的基因毒性對宿 主細胞以及質粒穩(wěn)定性的影響；通過控制 誘導條件控制 T7 RNA 聚合酶的量，就可以 控制產物表達量，某些情況下可以提高產 物的可溶性部分。有幾種方案可用于調控T7 RNA 聚合酶的合成，從而調控T7 表達系統(tǒng).1.噬菌體 DE3 是 lambda 噬菌體的衍生株，含有 lacI 抑制基因和位于 lacUV5 啟動子下的 T7 RNA 聚合酶基因。 DE3 溶源化的菌株

6、如 BL21(DE3) 就是最常用的表達菌株，構建好 的表達載體可以直接轉入表達菌株中，誘導調控方式和lac 一樣都是 IPTG 誘導 .2.另一種策略是用不含T7 RNA 聚合酶的宿主菌克隆目的基因，即可完全避免因目的蛋白對宿主細胞的潛在毒性而造成的質粒不穩(wěn)定。然后用 CE6噬菌體侵染宿主細胞 CE6 是 lambda 噬菌體含溫度敏感突變(cI857ts)和 pL/pR 啟動子控制 T7 RNA 聚合 酶的衍生株，在熱誘導條件下可以激活T7 RNA 聚合酶的合成 .此了噬菌體之外，還可以通過共轉化質粒提供 T7 RNA 聚合酶。比如有人用受溶氧濃度控制的啟動子調控T7 RNA 聚合酶合成，

7、據說這比較適合工業(yè)化發(fā)酵的條件控制.由于 T7 RNA 聚合酶的調控方式仍有可能有痕量的本底表達，控制基礎表達的手 段之一是培養(yǎng)基外加葡萄糖，有助于控制本底表達水平。2.是采用帶有 T7lac 啟動 子的載體 在緊鄰 T7 啟動子的下游有一 段 lacI 操縱子序列編碼表達 lac 阻遏蛋白 (lacI) ，lac 阻遏蛋白可以作用于宿主染 色體上 T7 RNA 聚合酶前的 lacUV5 啟動子并抑制其表達，也作用于載體 T7 lac 啟動 子，以阻斷任何 T7 RNA 聚合酶導致的目的 基因轉錄。 pLacI 工轉化也是同樣的原理 .如果這還不夠，更為嚴謹調控手段還有 在宿主菌中表達另一個可以結合并 抑制 T7 RNA 聚合酶的基因 T7 融菌酶，降低本底。常用的帶溶菌酶質粒有 pLysS 和 pLysE，相容的 ori 都不會影響后繼的表達 質粒轉化，前者表達的溶菌酶的水平要比后者低得多，對細胞生長影響小，而 pLysE 會明顯降低宿主菌的生長水平，容易出現(xiàn) 過度調節(jié)，增加蛋白表達的滯后時間，從而降低表達水平 .通過幾種不同方法來巧妙調控 T7 聚合