論質量源于設計(QbD)在制劑處方篩選中的應用—以長春新堿脂質體為例

1、摘 要研究背景：長春新堿是一種廣譜抗癌藥，廣泛應用于腫瘤聯(lián)合化療，但由于嚴重的神經毒性和組織刺激性等不良反應，其臨床應用受到限制。眾所周知，脂質體是一種靶向給藥制劑，具有類細胞結構，進入體內主要被網(wǎng)狀內皮系統(tǒng)吞噬而活化機體的自身免疫功能，并改變被包封藥物的體內分布，從而提高藥物的治療指數(shù)、減少藥物的治療劑量和降低藥物的毒性。研究目的：本研究擬將長春新堿開發(fā)成長循環(huán)脂質體制劑，以減小其嚴重的毒副反應。本論文主要論述長循環(huán)長春新堿脂質處方的開發(fā)，著重探討QbD在制劑處方篩選中的應用。研究方法：根據(jù)QbD的理念，首先明確長循環(huán)長春新堿脂質體的目標產品質量概況，結合以往脂質體處方開發(fā)的經驗和風險評估的

2、手段確定藥品的關鍵質量屬性。然后以藥品的關鍵質量屬性和目標產品質量為出發(fā)點，從內相緩沖液的種類、培化磷脂酰乙醇銨（PEG-DSPE）的用量和藥物的裝載比例等因素進行系統(tǒng)篩選，以找出高包封率和可接受的體外藥物釋放度的處方。然后將這些長春新堿脂質體和游離藥物進行藥代動力學、毒性和抗腫瘤效果對比，最終篩選出既有最佳的抗腫瘤效果又表現(xiàn)出最低毒性的處方，同時對該處方進行初步穩(wěn)定性考察。結果表明篩選出的處方在冷藏條件下穩(wěn)定，不易滲漏，包封率高，粒徑分布均勻， 其質量屬性符合預先設定的目標。研究結論：本研究應用QbD的方法進行產品開發(fā)，對影響產品的關鍵質量屬性進行了科學系統(tǒng)的研究，找出了影響產品質量的與處方

3、和工藝相關的因素， 從而制定合理的控制戰(zhàn)略， 使研發(fā)出的產品能夠順利轉移到生產部門， 最終實現(xiàn)商業(yè)化生產。關鍵詞：質量源于設計，QbD；處方篩選；脂質體；關鍵質量屬性；風險評估；穩(wěn)定性；藥物動力學The application of QbD in Formulation Development for Vincristine Liposome InjectionAbstractBackground: Vincristine has been widely used in treatment of various cancers, especially in combined chemother

4、apy. However, clinical use of vincristine may cause severe neurotoxicity and tissues irritation, which limits its clinical application. It is well-known that liposome formulation is a targeted drug delivery system, which has structure similar to cells. There are many advantages to use liposome formu

5、lation in clinics. Liposomes could stimulate immune system once engulfed by reticuloendothelial system (RES). In-vivo distribution of a drug entrapped into liposomes could be changed, leading to decrease of therapeutical doses and thus adverse effects. Research Purposes: formulating vincristine into

6、 long-circulating liposomes may significantly reduce its severe adverse effects, so the clinical outcome could be further improved. The purpose of this thesis is to develop PEGylated vincristine liposome formulations using current Quality-by-Design (QbD) approach.Research Methods: Using QbD approach

7、 in formulation development, the quality target product profile (QTPP) of long-circulating vincristine liposome was first established and critical quality attributes (CQA) were identified using prior experience and risk assessment tool. Then, the type of intraliposomal trapping agents, the amount of

8、 PEG-DSPE and the drug-to-HSPC ratio (D/L) were investigated to obtain formulations with high encapsulation efficiency and acceptable in-vitro drug release profile. Moreover, in-vivo evaluation in animals was also conducted, including pharmacokinetic studies, acute toxicity and antitumor efficacy. F

9、inally， a PEGylated liposome formulation with improved therapeutic index and reduced toxicity was selected. The selected liposome vincristine formulation met the predefined QTPP with good physical and chemical stability, higher encapsulation efficiency, lower leaking rate, and acceptable particle si

10、ze distribution. Research Conclusions: The thesis work followed the principle of QbD to systemically and scientifically evaluate the factors that have impact on product quality attributes and identify critical quality attributes. Thus, source of variables in formulation and process can be understood

11、 and properly controlled. The vincristine liposome formulation developed from this study should be able to successfully transfer to production site in next step to achieve final commercial production.Keywords: Quality by design, QbD, formulation screen, liposome, critical quality attributes, risk as

12、sessment, stability, pharmacokinetics目錄第1章前言1第2章長春新堿市售制劑分析32.1長春新堿理化性質32.2長春新堿的市售制劑32.3長春新堿的臨床應用32.4長春新堿的藥代動力學3第3章長循環(huán)長春新堿脂質體的目標產品質量概況及關鍵質量屬性53.1長循環(huán)長春新堿脂質體的目標產品質量概況53.2長循環(huán)長春新堿脂質體的關鍵質量屬性63.2.1 pH63.2.2 粒徑63.2.3 包封率和體外釋放率73.2.4 降解產物73.2.5 殘留溶劑73.2.6 無菌和細菌內毒素7第4章處方篩選104.1 處方變量的風險評估104.2 內相緩沖液的影響124.2.1

13、脂質體的制備方學124.2.2 初步分析方法學134.2.3 硫酸銨梯度法1144.2.4 磺丁基醚-環(huán)糊精-三乙胺梯度法5144.2.5 試驗結果154.3 培化磷脂酰乙醇銨（PEG-DSPE）密度的影響164.4 藥物-類脂比（D/L）的影響194.5 不同脂質體處方對藥代動力學的影響204.5.1方案設計204.5.2動物及飼養(yǎng)204.5.3供試品和對照品214.5.4樣品采集及處理214.5.5試驗結果214.6 不同脂質體處方對體內毒性的影響224.6.1方案設計224.6.2動物及飼養(yǎng)224.6.3供試品和對照品234.6.4試驗內容234.6.5試驗結果244.7不同脂質體處方的

14、抗腫瘤活性比較244.7.1方案設計254.7.2供試品和對照品254.7.3 動物及飼養(yǎng)264.7.4試驗內容264.7.5試驗結果274.8脂質體處方的初步穩(wěn)定性考察284.8.1穩(wěn)定性研究284.8.2試驗結果294.9處方因素的更新風險評估30第5章結論32參考文獻34致謝35V第1章 前言脂質體系指將藥物包封于類脂質雙分子層內而形成的微型泡囊體。早在1965年，英國學者Bangham和Standish將磷脂分散在水中進行電鏡觀察時發(fā)現(xiàn)了這樣的分子結構，把它稱作為脂質體，并首次展示了脂質體的圖像，球狀的、自我封閉的、分散在水中并且包封一部分水性介質的脂質粒子1。之后脂質體進入快速發(fā)展期

15、。近年來，隨著生物技術的不斷發(fā)展，脂質體的制備工藝逐步完善，加之脂質體適合于生物體內降解、無毒性和無免疫原性，特別是脂質體作為藥物載體，具有靶向性，從而能夠減少藥物劑量，降低毒性，減少副作用等，因此脂質體靶向給藥系統(tǒng)已愈來愈受到重視并得到廣泛應用。癌癥是人類的大敵，在攻克癌癥堡壘中，目前化療還是主要的手段，而提高化療效果的關鍵是如何提高藥物的靶向性和降低藥物的毒副作用。脂質體劑型可以在某種程度上提高化療藥物的靶向性，并大幅度地降低化療藥物的毒副作用，從幾種途徑上提高化療藥物的治療指數(shù)。與目前其他的抗癌藥物劑型相比較，藥物脂質體具有獨特的優(yōu)點，早已為國內外專家所矚目。長春新堿是從夾竹桃科植物長春

16、花中提取的一種生物堿，有廣泛的臨床應用（尤其是治療兒童和成人的惡性腫瘤），被認為是一種重要的抗腫瘤藥物。長春新堿對細胞有多種影響，但其作用機理仍在進一步研究中。一般認為的作用機理是長春新堿抑制了微管蛋白的聚合，從而影響紡錘體微管的形成，使細胞分裂阻止在中期，從而抑制了腫瘤的生長。隨著長春新堿在臨床上的廣泛應用，其不良反應報道也日趨增多，尤其是與劑量相關的神經系統(tǒng)毒性，主要引起外周神經癥狀，如手指、神經毒性等，與累積量有關。其他還有足趾麻木、腱反射遲鈍或消失，外周神經炎。此外也有腹痛、便秘，麻痹性腸梗阻的報道。運動神經、感覺神經和腦神經也可受到破環(huán)，并產生相應癥狀。神經毒性常發(fā)生于40歲以上者，

17、兒童的耐受性好于成人，惡性淋巴瘤病人出現(xiàn)神經毒性的傾向高于其他腫瘤病人。骨髓抑制和消化道反應較輕，有局部組織刺激作用，藥液不能外漏，否則可引起局部壞死，可見脫發(fā)，偶見血壓的改變。其嚴重的神經毒性和組織刺激性等不良反應，已經限制了其臨床應用。而脂質體作為抗癌藥物載體具有能增加與癌細胞的親和力，克服耐藥性，增加藥物被癌細胞的攝取量，降低用藥劑量，提高療效，降低毒副作用的特點。因此本研究擬將長春新堿開發(fā)成長循環(huán)脂質體制劑。本論文采用QbD理念來研發(fā)療效高、毒性低的長循環(huán)長春新堿脂質體。首先分析研究長春新堿的市售制劑的臨床用量、理化性質、藥代動力學等參數(shù)。進而確定長循環(huán)脂質體制劑的目標產品質量概況（Q

18、TPP）以及關鍵質量屬性（CQA）。然后以此為目標，從輔料的種類、用量、和藥物的裝載比例等因素進行系統(tǒng)研究，并和市售制劑進行對比，最終篩選出既有好的抗腫瘤效果， 又有最低毒性的處方。本論文應用實例闡明了QbD的理念在制劑處方開發(fā)中的應用。應用QbD的理念進行產品開發(fā)，可以使研發(fā)人員可從臨床患者角度出發(fā)來確定產品的目標質量特征，建立藥品的關鍵質量屬性，以保證藥品的質量能滿足患者需要。在產品的研發(fā)過程中，強調對影響產品質量的處方和工藝過程中的變異因素進行科學系統(tǒng)的研究，從而理解哪些因素對關鍵質量屬性有影響，并對此加以合理地控制， 以確保上市產品生產的長期可靠性和一致性。第2章 長春新堿市售制劑分析

19、2.1長春新堿理化性質游離長春新堿為片狀結晶，極不穩(wěn)定，因此常用其硫酸鹽。其鹽為白色或類白色結晶粉末，無臭，有吸濕性，遇光或熱易變黃。熔點為218-220C。在水中易溶，在甲醇或三氯甲烷中能溶解，在乙醇中微溶。硫酸長春新堿為親水性藥物，因此擬開發(fā)的長春新堿脂質體可以采用主動載藥方式，即先形成空白脂質體，再借助特定的梯度（如pH梯度或硫酸銨梯度）來實現(xiàn)藥物的裝載。2.2長春新堿的市售制劑目前臨床上使用的均為硫酸長春新堿普通注射劑型，即注射用硫酸長春新堿，規(guī)格均為1mg。國內有兩家單位申報長春新堿的特殊制劑，分別為上海復旦張江生物醫(yī)藥股份有限公司申報的注射用硫酸長春新堿脂質體濃溶液和南京思科藥業(yè)有

20、限公司申報的注射用硫酸長春新堿脂質體。臨床上應用的均為長春新堿的普通注射劑，因此擬開發(fā)的長春新堿脂質體的質量特征和市售制劑對比時，直接采用原料藥配制的水溶液來代替。2.3長春新堿的臨床應用靜脈給藥，成人劑量12mg(或1.4mg/m2）最大不大于2mg，年齡大于65歲者，最大每次1mg。兒童75gkg或2.0mg/m2, 每周1次靜脈注射或沖入。聯(lián)合化療是連續(xù)用藥2周為一周期。市售制劑規(guī)格為1mg，臨床上最大使用劑量為2mg，鑒于計劃開發(fā)的長循環(huán)長春新堿脂質體有可能降低毒副作用，可以增加給藥劑量，故將產品規(guī)格升高到臨床的最大使用劑量2mg。2.4長春新堿的藥代動力學靜脈注射長春新堿后，藥物迅速

21、分布于各組織，神經細胞內濃度較高，很少透過血腦屏障，腦脊液濃度是血漿濃度的1/301/20。蛋白結合率75%。在成人，T1/2小于5分鐘，T1/2為50155分鐘，末梢消除相T1/2長達85小時。長春新堿在肝內代謝，在膽汁中濃度最高，主要隨膽汁排出，糞便排泄70%，尿中排泄5%16%。為了提高長春新堿在體內的循環(huán)時間，計劃將長春新堿開發(fā)成長循環(huán)脂質體，即隱形脂質體。普通脂質體靜脈注射后，迅速從血液循環(huán)中清除，因此脂質體可能還沒有到達靶區(qū)，就已經被機體清除掉而無法發(fā)揮其治療作用。而隱形脂質體能夠阻止巨噬細胞對脂質體的識別和攝取，從而延長脂質體在血中的循環(huán)時間，增加藥物與腫瘤細胞的作用時間，并且更

22、利于脂質體借助實體瘤的高通透性和滯留（EPR）效應富集到腫瘤組織中，以此提高對腫瘤細胞的殺傷力，增強藥物療效。隱形脂質體主要是由攜帶親水性長鏈的脂質插入脂質體膜上制備得到的，它能在血液循環(huán)中長時間保留，作用機制主要是親水性長鏈在脂質體表面形成了親水性保護層，阻止了調理素的吸附，因而減少了網(wǎng)狀內皮系統(tǒng)（RES）的攝取。常用于長循環(huán)脂質體的脂質成分為培化磷脂酰乙醇胺（PEG2000DSPE），目前這種材料已經商業(yè)化，已上市的鹽酸多柔比星脂質體制劑中也使用了該種長循環(huán)材料。因此，開發(fā)體內長循環(huán)脂質體是切實可行的。第3章 長循環(huán)長春新堿脂質體的目標產品質量概況及關鍵質量屬性3.1長循環(huán)長春新堿脂質體的

23、目標產品質量概況目標產品的質量概況是藥品質量屬性的前瞻性總結，具備這些質量屬性，才能確保產品質量，并最終保證藥品的安全性和有效性。目標產品的質量概況是QbD方法的一個基本要素，構成了該產品的設計基礎。因此，從長春新堿的市售產品的屬性出發(fā)，考慮到臨床患者的需求，首先確定計劃開發(fā)的長循環(huán)長春新堿脂質體的目標產品質量概況。表3-1 目標產品質量概況（QTPP）QTPP要素目標劑型注射劑藥代動力學延長在體內的循環(huán)時間，其半衰期大于游離藥穩(wěn)定性2-8穩(wěn)定，貯存期間，藥物不從脂質體囊泡中滲漏療效不低于游離藥毒性低于游離藥藥品質量屬性性狀符合質量標準鑒別pH粒徑包封率體外釋放率含量有關物質殘留溶劑無菌細菌內

24、毒素3.2長循環(huán)長春新堿脂質體的關鍵質量屬性關鍵質量屬性（CQA）是產品的某種物理、化學、生物學或微生物學特性或特點，只有當這一性質或特點在一個適當?shù)南薅?、范圍或分布內，才能保證所期望的產品質量， 保證產品安全有效2。因此需在QTPP中確認關鍵質量屬性，作為產品控制戰(zhàn)略的關鍵部分。3.2.1 pH在脂質體制備過程中，無論是天然來源的磷脂，還是人工合成的飽和磷脂，都有可能發(fā)生水解。磷脂水解掉一條?；満?，就會形成溶血磷脂。溶血磷脂作為表面活性分子，如果在脂質體中的含量超過一定的比例，就會導致脂質體解體。同時溶血磷脂本身由于可以破壞磷脂膜，對機體的細胞可能也有毒害作用。因此要嚴格的監(jiān)控磷脂水解的程

25、度。通常，磷脂分子在pH6.5左右最為穩(wěn)定1，如果pH偏酸或者偏堿，或者溫度升高，磷脂的水解常數(shù)都會增加。因此為了保證產品的質量，對產品的pH需要進行嚴格控制。3.2.2 粒徑實體瘤的高通透性和滯留效應（enhanced permeability and retention effect，EPR）是脂質體從血液向腫瘤中轉運并在腫瘤組織中滯留的原因。正常組織中的微血管內皮間隙致密、結構完整，大分子和脂質顆粒不易透過血管壁，而實體瘤組織中血管豐富、血管壁間隙較寬、結構完整性差，淋巴回流缺失，造成大分子類物質和脂質顆粒具有選擇性高通透性和滯留性，這種現(xiàn)象被稱作實體瘤組織的高通透性和滯留效應，簡稱EP

26、R效應。EPR效應促進了大分子類物質在腫瘤組織的選擇性分布，可以增加藥效并減少系統(tǒng)副作用。文獻報道3，當脂質體粒徑在100 nm左右時，血循環(huán)時間最長?？赡苡捎诹匠^100 nm的脂質體進入體內后迅速被單核吞噬細胞系統(tǒng)（MPS）清除，其半衰期很短，而粒徑小于100 nm的脂質體能穿過竇狀型毛細血管離開循環(huán)系統(tǒng)到相關組織(肝、脾、骨髓和實質性腫瘤等)。脂質體粒度的控制是一個非常重要的問題。最終產品的粒度會顯著影響其體內行為，進而影響被包封的藥物的治療效果和毒性。經過合理設計的脂質體由于EPR效應能夠在腫瘤組織中蓄積，減少藥物在正常組織的分布，從而提高了藥物的安全性和治療的有效性。因此本研究中將

27、粒徑控制在100nm左右。為了使最終產品的粒度在需要的范圍內，必須使用合適的制備工藝和制備設備。不同的制備工藝得到的脂質體的粒度是不同的。本研究選用同一制備工藝，考察處方中各種變量的影響。因此僅需對產品的粒度進行控制，使其在合適的范圍即可。3.2.3 包封率和體外釋放率包封率(entrapment efficiency，EE)，又稱為包裹率、包封效率等，是指包封在脂質體內的藥物量占投料量的百分比。包封率和很多因素相關，如類脂的種類及用量、藥物的性質、藥物-類脂比等，是脂質體制劑的一項重要質量指標，直接影響脂質體在機體組織的行為。一個良好的脂質體處方應該具備較高的包封率，且在貯存期內穩(wěn)定，因此將

28、其作為關鍵質量屬性，進行重點評價。一個良好的抗腫瘤脂質體處方應該具備經靜脈給藥后，在血液循環(huán)中藥物不釋放或較少釋放；當?shù)竭_腫瘤區(qū)后，藥物能有效的釋放的特點，這樣才能降低藥物毒性，更好的發(fā)揮治療作用。體內的釋放情況往往用體外方法代替。因體外釋放試驗是在體溫下，等滲的緩沖液中進行的，這些觸發(fā)藥物釋放的因素和血漿中是類似的，例如稀釋效應，逆轉的pH梯度，可以很好的模擬體內釋放情況。因此體外釋放度也是脂質體制劑的一項重要質量指標，將其作為關鍵質量屬性，進行重點評價。3.2.4 降解產物降解產物是指新藥制劑在生產和貯藏過程中，因光照、溫度、pH、水或與賦形劑和/或包裝系統(tǒng)互相反應而導致原料藥發(fā)生化學變化

29、而產生的雜質4。雖然長春新堿原料對光、熱敏感，但考慮到制成脂質體后，可以將原料藥包裹到脂質雙層的囊泡中，因此在處方篩選階段不作為關鍵質量屬性進行考察，僅在初步的穩(wěn)定性研究中作為考察指標。3.2.5 殘留溶劑制備脂質體的過程中，幾乎不可避免的要使用有機溶劑。除了乙醇以外，幾乎所有的溶劑都是對機體有害的溶劑；因此制備的產品，對有機溶劑的殘留量應該予以控制。不同的制備工藝，使用的有機溶劑不同，應采取不同的控制手段。但在本研究中，采取同樣的制備工藝，同時制備規(guī)模較小，為實驗室制備，可以很有效的除去有機溶劑，因此在本研究中，對殘留溶劑暫不進行考察。3.2.6 無菌和細菌內毒素無菌和細菌內毒素是無菌制劑的

30、關鍵質量屬性，主要與制備工藝和生產系統(tǒng)相關，本研究為實驗室規(guī)模，不具備無菌生產所需要潔凈環(huán)境，因此對此不進行考察。藥品的質量屬性的系統(tǒng)分析結果，如下表所示：表3-2 藥品質量屬性藥品質量屬性目標是否是CQA依據(jù)性狀乳白色的混懸液否產品的性狀不直接與安全性和有效性相關聯(lián)。因此不是關鍵質量屬性。鑒別確定為原料藥長春新堿是雖然對于安全性和有效性來說，鑒別項是關鍵指標，但這個關鍵質量屬性可通過質量管理體系得到有效控制，并會在藥品放行是進行檢測。處方和工藝變量不會影響鑒別項，因此在處方篩選過程中不會對該關鍵質量屬性進行討論。pH6.0-7.0是pH的變化會影響磷脂的穩(wěn)定性，從而影響產品的安全性，但在處方

31、篩選過程中，采用相同pH條件制備，因此不再對該關鍵質量屬性進行討論。粒徑75nm-150nm是粒徑的變化會影響安全性和有效性，處方的變化可能會影響藥品的粒徑，因此，在處方篩選的過程中，需要對該關鍵質量屬性進行控制，將其控制在合適的范圍內。包封率不小于90%是包封率的變化會影響安全性和有效性，處方和工藝變量均會對包封率造成影響，因此，對包封率的測評貫穿于產品和工藝開發(fā)的整個過程。體外釋放度在釋放介質中能緩慢釋放是藥物釋放的快慢直接影響產品的安全性和有效性，且隨著處方的變化而變化，因此，在處方篩選的過程中，需要對該關鍵質量屬性進行評價。含量標示含量的90%-110%是含量的變化會影響安全性和有效性

32、，工藝變量可能影響藥品的含量，但在處方篩選過程，影響較小，因此在處方篩選過程中，不進行重點考察，僅在穩(wěn)定性研究中考察。降解產物總雜質小于1%是降解產物會影響安全性，必須根據(jù)藥典要求對其進行控制以減少對患者的影響。因在制備過程中，原料較穩(wěn)定，因此在處方篩選過程中，不進行重點考察，僅在穩(wěn)定性研究中考察。殘留溶劑符合藥典規(guī)定是雖然殘留溶劑會影響安全性，但處方和工藝變量不太可能影響該關鍵質量屬性，因此不再討論。無菌符合藥典規(guī)定是不符合無菌將會影響患者的安全。然而，在本研究中，僅限于小試處方篩選階段，暫不考慮無菌方面的影響，因此在處方篩選的過程中，不再對該關鍵質量屬性進行討論。細菌內毒素符合藥典規(guī)定是不

33、符合細菌內毒素同樣將會影響患者的安全。然而，在本研究中，僅限于小試處方篩選階段，暫不考慮細菌內毒素方面的影響，因此在處方篩選的過程中，不再對該關鍵質量屬性進行討論。第4章 處方篩選4.1 處方變量的風險評估本公司已經開發(fā)出鹽酸多柔比星脂質體注射液和鹽酸米托蒽醌脂質體注射液，其中鹽酸多柔比星脂質體注射液已經取得生產批件，鹽酸米托蒽醌脂質體注射液取得臨床批件，正在進行期臨床試驗。兩種產品和普通劑型相比較，均顯著降低了藥物毒性，明顯提高了治療安全指數(shù)。本公司在脂質體的處方研究中積累了一定的經驗，根據(jù)以往的研究經驗，首先對擬開發(fā)的長循環(huán)長春新堿脂質體的處方變量進行了初始風險評估，風險評估結果見表4-1

34、,4-2。表4-1 處方變量的初始風險評估藥品CQA處方變量內相緩沖液種類培化磷脂酰乙醇胺（PEG2000DSPE）用量藥物-類脂比率pH低低低粒徑低低低包封率高高中體外釋放度高高中含量低低低降解產物低低低表4-2 處方變量初始風險評估依據(jù)處方變量藥品CQAs依據(jù)內相緩沖液種類pH產品pH值與外相緩沖液的初始pH及緩沖能力相關，所以風險低。粒徑內相緩沖液種類對脂質體形成初期的粒徑大小有一定影響，但在整粒過程中通過調整設備參數(shù)可以達到預期的目標值，所以風險低。包封率在長春新堿的裝載過程中，不同的內相溶液提供的pH梯度能力不同，與藥物形成復合物的穩(wěn)定性也不同，從而使藥物裝載效率差別較大，因此高度風

35、險。體外釋放度長春新堿和不同緩沖液的陰離子形成的復合物的解離行為不同，從而影響藥物從脂質體內釋放的速率，因此高度風險。含量產品初始含量與載藥時藥物加入量和總體積相關，也會受到除菌過濾膜的影響，存儲期含量與藥物降解相關，所以風險低。降解產物藥物降解與其存在處方的pH、氧化性、輔料相互作用等相關，主動載藥脂質體內部pH為酸性是弱堿性藥物相對穩(wěn)定的條件，且所選緩沖液的陰離子均能與藥物形成復合物從而進一步增加其穩(wěn)定性，因此風險低。培化磷脂酰乙醇胺（PEG2000DSPE）用量pH產品pH值與外相緩沖液的初始pH及緩沖能力相關，所以風險低。粒徑PEG的用量對脂質體形成初期的粒徑大小有一定的影響，但在整粒

36、過程中通過調整設備參數(shù)可以到達預期的目標值，所以風險低。包封率PEG磷脂為荷負電的磷脂，其分布在脂質體雙分子層中，與陽離子藥物會產生一定的作用力從而影響藥物裝載，長春新堿為陽離子藥物因此其載藥過程可能會受到PEG磷脂的影響，因此高度風險。體外釋放度PEG磷脂所荷負電對陽離子藥物裝載會有影響，同理會對藥物的釋放會有影響，因此高度風險。含量產品初始含量與載藥時藥物加入量和總體積相關，也會受到除菌過濾膜的影響，存儲期含量與藥物降解相關，所以風險低。降解產物藥物降解與其存在處方的pH、氧化性、輔料相互作用等相關，PEG磷脂所荷負電與荷正電的藥物會產生一定作用力，但是不可能影響藥物所處環(huán)境的pH、氧化性

37、等，單純的電荷吸引對藥物降解影響也較低，因此風險低。藥物-類脂比率pH產品pH值與外相緩沖液的初始pH及緩沖能力相關，所以風險低。粒徑藥物裝載是在制備成合適粒徑的脂質體之后，因此藥物裝載量基本不會影響粒徑的變化，從而風險低。包封率一定尺度的脂質體能夠裝載的藥物是有限的，因此隨著藥物-類脂比的增加，藥物的包封率會在某一臨界值后快速降低，因此該風險適中。體外釋放度藥物在脂質體內部的量越多其釋放會越慢，這是由于藥物的陰離子復合物的溶解和解離速度隨濃度增加而降低，但是影響其解離速度最主要的是復合物的性質，而濃度只是對藥物釋放有一定的影響，因此該風險適中。含量產品初始含量與載藥時藥物加入量和總體積相關，

38、也會受到除菌過濾膜的影響，存儲期含量與藥物降解相關，所以風險低。降解產物藥物降解與其存在處方的pH、氧化性、輔料相互作用等相關，藥物與類脂比率不會影響藥物所處環(huán)境的pH、氧化性，而類脂與弱堿性藥物作用較弱，且類脂與內水相形成復合物的藥物產生相互作用的機會很少，因此風險低。根據(jù)對處方變量的風險評估結果，分別從體內和體外兩個方面進行處方篩選。在體外通過對內相緩沖液、培化磷脂酰乙醇胺（PEG2000DSPE）和藥物-類脂比例進行考察，初步確定脂質體處方。然后將不同的脂質體處方通過體內的藥代動力學、毒性和抗腫瘤活性的評價，最終確定毒性降低療效增強的脂質體處方。4.2 內相緩沖液的影響硫酸長春新堿為親水

39、性藥物，宜采用主動載藥的制備方式，即先形成空白脂質體，再借助特定的梯度來實現(xiàn)藥物的裝載，常用的主動載藥技術為pH值梯度法和硫酸銨梯度法。使用主動載藥技術，對藥物的性質要求比較嚴格，能和脂質體的內相緩沖液可以生成較穩(wěn)定的復合物或者沉淀。只有藥物可以和內相緩沖液生成較穩(wěn)定的復合物或沉淀，才有可能保證藥物在貯存期維持其包封效率和載藥量，并且給藥后，不會由于體液的稀釋效應導致藥物的大量滲漏。但是這種復合物或沉淀作用又不宜太強，否則有可能藥物在病變部位不釋放，導致藥物的療效下降。因此內相緩沖液的篩選尤為重要。4.2.1 脂質體的制備方學簡要地說，氫化大豆卵磷脂（HSPC）、膽固醇（Chol）和培化磷脂酰

40、乙醇胺（PEG2000DSPE）的混合物溶解在氯仿中，然后在氮氣下干燥成一層磷脂膜，接著在真空條件下除去殘留的溶媒。在所有的實例中，HSPC和chol的摩爾比設定為3:2，PEG-DSPE和HSPC的摩爾比根據(jù)需要進行調整，比例是0.5%、2.9%和8.3%。干燥的磷脂膜隨后用內相緩沖液水化。水化過程在60孵育1小時。水化后的溶液在60下，通過0.1m的聚碳酸酯膜擠出8遍，所用擠出儀為Avestin。該過程形成了粒徑100nm的均一的粒子囊泡。該囊泡的平均粒徑通過Zetasizer Nano ZS（馬爾文儀器）進行檢測。待粒徑合格后，再使用Sephadex G-75凝膠柱，和脂質體的外相緩沖液

41、進行置換，從而產生跨膜的離子梯度。在實驗中使用的外相緩沖液是pH6.5的300mM蔗糖和20mM組氨酸溶液，通過緩沖液的置換，空白脂質體具有了跨膜的離子梯度，然后和長春新堿以設定的質量比進行混合。這混合溶液在60孵育設定時間，從而完成藥物的裝載。4.2.2 初步分析方法學包封率：采用凝膠過濾法分離脂質體和游離藥物測定包封率，本實驗采用葡聚糖凝膠Sephadex G-75對游離藥物和脂質體進行分離。具體操作如下：用0.9%氯化鈉溶液平衡Sephadex G-75層析柱3倍柱體積以上，然后取100l的樣品，加入層析柱上端，待藥液完全進入膠內后，用0.9%氯化鈉溶液洗脫，流速控制在1.0ml/min

42、左右，采用中壓層析系統(tǒng)在線監(jiān)測洗脫情況。根據(jù)洗脫曲線，可以很好的分離脂質體部分和游離藥物部分。洗脫曲線如下圖所示：圖4-1 洗脫曲線A：脂質體；B：游離藥包封率體外釋放度：在體內，脂質體的釋放由粒徑、雙分子膜組成及內水相的組成決定；在體外，脂質體的釋放受溫度、介質中銨濃度、pH值等諸多因素影響。在脂質體體外釋放試驗中，通常采用磷酸鹽緩沖液或生理鹽水為釋放介質。但是在體內能夠促進藥物釋的一個主要因素是銨離子濃度，為了更準確的模擬體內環(huán)境，在本研究中選擇pH6.5的葡萄糖組氨酸等滲溶液加入5mM的氯化銨作為釋放介質。精密吸取2 ml稀釋后的長春新堿脂質體注射液，加到經預處理過的透析袋中，將袋口扎緊

43、，固定于槳上并置于裝有400 ml釋放介質的溶出杯中，37 75rpm恒速攪拌，定時吸取0.1 ml脂質體溶液，加入甲醇0.4ml溶解后進行液相測定。含量：取長春新堿脂質體1 ml，置于10ml容量瓶中，用冷甲醇溶液定容至刻度。取20 µl注入液相色譜儀，記錄色譜圖。使用外標法計算含量。液相檢測：使用Waters液相進行色譜分析，用Zorbax的C18色譜柱，150*4mm2，5m。洗脫流動相為甲醇/80mM醋酸銨溶液，用鹽酸調pH至3.0，體積比為52:48，流速為1ml/min，檢測波長297nm。4.2.3 硫酸銨梯度法1硫酸銨梯度法在20世紀90年代初期由以色列學者發(fā)明。該方

44、法的制備過程和傳統(tǒng)的pH值梯度犯有相似之處。首先使用硫酸銨緩沖液制備空白脂質體，之后采用交叉流透析等手段除去脂質體外相的硫酸銨。硫酸銨梯度法之所以能夠實現(xiàn)藥物的裝載，可能和游離的氨跨膜擴散，造成磷脂膜內外的pH值得差異有關。硫酸銨梯度法的優(yōu)勢在于制備空白脂質體的過程中，接近中性的硫酸銨水溶液不會引起過多的磷脂分子水解。因為畢竟如果使用飽和磷脂制備脂質體，需要在較高的溫度下完成。使用傳統(tǒng)的pH值梯度法，可能使得磷脂更容易發(fā)生水解。在本研究中，硫酸銨內相溶液溶度為250mM。4.2.4 磺丁基醚-環(huán)糊精-三乙胺梯度法5使用磺丁基醚-環(huán)糊精-三乙胺為內相制備脂質體的機制基礎和傳統(tǒng)的硫酸銨梯度方法機制

45、類似。簡要地說，當通過緩沖液置換產生磺丁基醚-環(huán)糊精-三乙胺的跨膜梯度時，三乙胺（TEA）由于濃度梯度會穿過磷脂膜。TEA的跨膜運動會引起脂質體內部介質酸化，從而產生pH梯度，長春新堿就能主動積累到囊泡中。在本研究，磺丁基醚-環(huán)糊精-三乙胺內相銨離子濃度為500mM。4.2.5 試驗結果采用同樣的處方，兩種不同內相緩沖液，分別制備長春新堿脂質體，將粒徑控制到同樣范圍內，分別考察包封率和體外釋放度。包封率結果如下表所示：表4-3 不同內相緩沖液對粒徑和包封率的影響處方內相緩沖液PEG密度（mol%）藥物-類脂比粒徑（nm）包封率（%）pLV-s-2.9-2硫酸銨2.92:1096.9±

46、0.0691.6pLV-c-2.9-2磺丁基醚-環(huán)糊精-三乙胺2.92:1096.2±0.0598.9pLV-s-2.9-2硫酸銨2.92:1097.4±0.0690.9pLV-c-2.9-2磺丁基醚-環(huán)糊精-三乙胺2.92:1096.9±0.0599.1圖4-2 不同內相緩沖液對體外釋放度的影響結論：從上表檢測結果來看，兩種內相緩沖液制備的脂質體，雖然包封率均在預期的目標值范圍內（不小于90%），但磺丁基醚-環(huán)糊精-三乙胺內相制備的脂質體包封效率較高，大于95%，和硫酸銨內相相比，具有明顯優(yōu)勢；在傳統(tǒng)的主動載藥技術中，藥物通過與內水相陰離子（如硫酸根）結合形成沉

47、淀，獲得較高的包封率。而長春新堿與脂質體內水相硫酸根不能形成沉淀，因而在內水相中的滯留能力差，影響藥物的裝載，從而包封率較低；長春新堿與脂質體內水相磺丁基醚-環(huán)糊精可能形成復雜的絡合物。在本研究中所使用的磺丁基醚-環(huán)糊精的平均取代度大約為7，也就是一個環(huán)糊精分子中含有的21個羥基中有7個被磺丁基所取代。由于磺酸具有較低的pKa，在脂質體內部（pH約為5-6）磺丁基醚-環(huán)糊精帶有多重負電。長春新堿的pKa值為5.0和7.45，在囊泡內部，幾乎所有的長春新堿分子以帶電的形式存在（攜帶至少一個正電荷），所以每個磺丁基醚-環(huán)糊精分子通過靜電作用能夠結合多個長春新堿分子，形成較穩(wěn)定的絡合物，從而獲得較高

48、的包封率。相反，一個硫酸根僅能結合兩個長春新堿分子，并且不能形成像磺丁基醚-環(huán)糊精-長春新堿絡合物這種物理狀態(tài)。這種復雜的絡合物形式可能和長春新堿從磺丁基醚-環(huán)糊精囊泡中緩慢釋放相關。從體外釋放的結果可以看出，磺丁基醚-環(huán)糊精-三乙胺內相制備的脂質體緩慢釋放，而硫酸銨內相脂質體釋放較迅速，在4小時內已經釋放93%。一個良好的抗腫瘤脂質體處方應該具備經靜脈給藥后，在血液循環(huán)中藥物不釋放或較少釋放；當?shù)竭_腫瘤區(qū)后，藥物能有效的釋放的特點。從體外的釋放數(shù)據(jù)來看，硫酸銨內相的脂質體釋放較快，推測其在體內可能尚未到達腫瘤區(qū)，在血液循環(huán)過程中就已經有效釋放，從而影響治療效果。因此從體外釋放的角度來看，磺丁

49、基醚-環(huán)糊精-三乙胺內相緩沖液較理想。4.3 培化磷脂酰乙醇銨（PEG-DSPE）密度的影響使用PEG化脂可以增強脂質體膜的親水性，減少血漿蛋白與脂質體膜的相互作用，阻止了脂質體的凝集和融合，避免了網(wǎng)狀內皮系統(tǒng)細胞對脂質體的吸收，從而延長了脂質體的體內循環(huán)時間。循環(huán)時間延長的多少與PEG分子量大小和加入量有關。文獻報道，使用PEG化脂（PEG-DSPE）修飾脂質體時，PEG分子會在脂質體表面形成不同的構象，至于形成哪種構象，與PEG分子量大小和加入量有關6。對于PEG-DSPE而言，當PEG-DSPE與HSPC的摩爾百分比大于4%時，會在脂質體表面形成致密的刷狀構象，當小于1%時，會形成相互獨

50、立的蘑菇狀構象，在1-4%之間時，會形成較密集的蘑菇狀構象7 8。由于PEG-DSPE荷負電，從而脂質體表面荷負電。而脂質體表面電性對其包封效率、穩(wěn)定性、靶器官分布及對靶細胞作用影響較大。在此，僅就PEG密度對包封率的影響進行初步探討。下面以磺丁基醚-環(huán)糊精-三乙胺為例，來說明PEG密度對裝載效率的影響。圖4-3 PEG密度對裝載效率的影響如圖4-3（b）所示，在高PEG密度時，在脂雙層上形成了完全的電子屏障。所以質子化的TEA由于強大的靜電相互作用能夠吸附到膜上，導致解離平衡移動從而產生更多的質子化的TEA。所以游離的TEA，即跨膜穿過的TEA量減少，這就意味著不能形成有效的pH梯度。如果產

51、生的pH梯度不足以介導藥物裝載，包封率會急劇降低。同樣長春新堿也會結合到脂質體表面的PEG上，所以導致藥物的包封率降低。相反，如果PEG密度較低時（如表a所示），靜電的相互作用較弱，因此不會對藥物的裝載產生影響。為了研究不同PEG-DSPE密度對裝載長春新堿效率的影響，采用3個不同濃度，分別為0.5%、2.9%和8.3%，分別代表不同構象。采用第一節(jié)中脂質體的制備方法分別制備不同PEG密度的長春新堿脂質體，考察對包封效率的影響。結果如下所示：表4-4 不同PEG密度對粒徑和包封率的影響處方內相緩沖液PEG密度（mol%）藥物-類脂比粒徑（nm）包封率（%）pLV-c-0.5-2磺丁基醚-環(huán)糊精

52、-三乙胺0.52:1098.9±0.0598.6pLV-c-2.9-2磺丁基醚-環(huán)糊精-三乙胺2.92:1099.3±0.0598.5pLV-c-8.3-2磺丁基醚-環(huán)糊精-三乙胺8.32:1098.3±0.0585.9pLV-s-0.5-2硫酸銨0.52:1098.5±0.0593.3pLV-s-2.9-2硫酸銨2.92:1098.7±0.0691.6pLV-s-8.3-2硫酸銨8.32:1099.2±0.0570.6結論：相對于磺丁基醚-環(huán)糊精-三乙胺內相的脂質體來說，不同的PEG-DSPE密度對長春新堿的裝載效率影響不同，在高P

53、EG密度時（8.3%），對包封率的影響較大，產生的pH梯度不足以介導藥物裝載，從而導致包封率較低；而在低PEG密度時，由于靜電相互作用較弱，跨膜穿過的TEA較多，能形成有效的pH梯度，產生的pH梯度足以介導藥物裝載，所以包封效率較高，且PEG密度為0.5%或2.9%時，包封效率差別不大。硫酸銨內相的脂質體也得到相同的結論。從本次試驗數(shù)據(jù)來看，再次證明了磺丁基醚-環(huán)糊精-三乙胺內相優(yōu)于硫酸銨內相。從上述試驗結果，初步確定內相緩沖液為磺丁基醚-環(huán)糊精-三乙胺，PEG-DSPE密度為0.5%或2.9%。4.4 藥物-類脂比（D/L）的影響載藥量的大小直接影響到藥物的臨床應用劑量，載藥量愈大，愈易滿足

54、臨床需要。此外，較高的載藥量也會影響脂質體的穩(wěn)定性，因此本研究目標篩選較低的載藥量，即每10mg氫磷脂對應1、2、3mg長春新堿。本次試驗采用磺丁基醚-環(huán)糊精-三乙胺為內相緩沖液，PEG-DSPE密度分別為0.5%、2.9%，藥物-類脂比為1:10、2:10、3:10。采用第一節(jié)中脂質體的制備方法分別制備不同藥脂比的長春新堿脂質體，考察不同藥脂比對包封效率和體外釋放度的影響。表4-5 不同藥物-類脂比對粒徑和包封率的影響處方內相緩沖液PEG密度（mol%）藥物-類脂比粒徑（nm）包封率（%）pLV-c-0.5-1磺丁基醚-環(huán)糊精-三乙胺0.51:10101.9±0.0499.6pLV

55、-c-0.5-2磺丁基醚-環(huán)糊精-三乙胺0.52:10101.3±0.0298.2pLV-c-0.5-2磺丁基醚-環(huán)糊精-三乙胺0.53:10104.3±0.0591.6pLV-c-2.9-1磺丁基醚-環(huán)糊精-三乙胺2.91:10102.3±0.0698.9pLV-c-2.9-2磺丁基醚-環(huán)糊精-三乙胺292:10101.7±0.0698.1pLV-c-2.9-3磺丁基醚-環(huán)糊精-三乙胺2.93:10103.6±0.0592.0從上述數(shù)據(jù)的結果來看，隨著藥脂比的增加，藥物的包封率下降。雖然包封率均在預期的目標值范圍內（不小于90%），但因長春新

56、堿的臨床用量不大，在滿足臨床需求的情況下，應選擇高包封率的產品，因此藥物-類脂比選擇1:10或2:10（兩者包封效率基本無影響）。僅考察藥物-類脂比為1:10和2:10的體外釋放度，其結果如下圖所示：圖4-4 不同藥物-類脂比對體外釋放度的影響從圖中可以看出，在相同PEG密度的情況下，藥脂比高的樣品釋放慢；相同藥脂比的情況下，高PEG密度樣品釋放稍快。從藥物釋放的角度考慮，應該選擇低PEG密度，高藥脂比的處方。4.5 不同脂質體處方對藥代動力學的影響為了考察長春新堿制備成脂質體后，是否能達到預期目標延長在體內的循環(huán)時間，其半衰期大于游離藥，我們進行了相關的藥代動力學研究，比較長春新堿脂質體和長春新堿游離藥在大