連翹的抗氧化成分研究

1、連翹的抗氧化成分研究【摘要】目的研究連翹的抗氧化作用，并分離、鑒定連 翹抗氧化有效成分。方法用二苯代苦味腓基自由基 1, l-diphenyl-2-picrylhydrazyl (dpph)清除實(shí)驗(yàn)方法，對(duì)連 翹的甲醇提取物及其二氯甲烷、正丁醇、水的萃取物進(jìn)行抗氧化作用 評(píng)價(jià)，并從有效部位分離得到化合物。結(jié)果與結(jié)論連翹的二氯甲烷萃 取物具有很強(qiáng)的清除dpph自由基的抗氧化活性，并從中分離、鑒定 4個(gè)化合物，分別為連翹脂素(phillygenin).連翹昔(phillyrin). forsythialan a、連翹酯昔(forsythoside a) o 其中，forsythialan a和連翹

2、酯昔(forsythoside a)具有較強(qiáng)的dpph清除作用，其半數(shù) 有效值ic50分別為154. 05和69.80 yg/ml。【關(guān)鍵詞】 連翹；抗氧化；dpph; forsythialan a;連翹酯abstract: objectiveto investigate the antioxidative activity of forsythia suspensa and to isolate and identify the active components methodsdpph radical scavenging activity was tested for the meoh

3、extract and its ch2c12, buoh, h20 f factions .results and conclusionch2c12 f factions f rom f.suspensa appeared potent antioxidant effects against the dpph radical. four components were isolated and identified as phi 1lyrin, forsythialan a and forsythoside a, respectively. forsythialan a and forsyth

4、oside have strong antioxidant activity and the ic50 values were 154.05 and 69.80 n g/ml, respectively.key words: forsythia suspensa; antioxidant; dpph;forsythialan a; forsythoside a現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究已經(jīng)證實(shí)氧化性應(yīng)激大約與兩百多種疾病的發(fā)生有 關(guān)，其中包括自身免疫性疾病、糖尿病、白內(nèi)障、癌癥等的產(chǎn)生與發(fā) 展都可由自由基及其代謝產(chǎn)物誘發(fā)1 。生物體具有有效的防御系統(tǒng) 來(lái)保護(hù)它們，免遭活性氧或其它自由基導(dǎo)致的紊亂與疾病24。

5、 然而，自由基形成與抗氧化防御系統(tǒng)之間出現(xiàn)不平衡，過(guò)多的氧化壓 抑，遠(yuǎn)超過(guò)防御機(jī)制能力，出現(xiàn)酶抗氧化防御的活性減小或在血清中 的抗氧化劑濃度降低57。生物體內(nèi)過(guò)量的氧自由基會(huì)造成生物 膜損傷、蛋白質(zhì)變性、酶失活及dna復(fù)制出現(xiàn)錯(cuò)誤等，這些勢(shì)必導(dǎo)致 一系列疾病，如血管粥樣硬化、高血壓病、糖尿病、癌、帕金森病、 老年癡呆癥、衰老等。這時(shí)抗氧化劑就起到非常重要的角色?？寡趸?防御系統(tǒng)是靠消除活性氧或使活性氧非活性化來(lái)完成8 10 。所以 人們更多地關(guān)心這種酶抗氧化體系活性的提高或可以直接消除活性 氧的抗氧化劑?，F(xiàn)在研究主要集中在類似a-lipoic acid, coenzyme q10、gsh等人體

6、內(nèi)細(xì)胞水平形成的抗氧化劑，或如維生素c、維生 素e等人體內(nèi)不形成但通過(guò)食物、天然物攝入多種多樣的抗氧化劑 11。但是合成的抗氧化劑，不僅是因?yàn)樗旧淼亩拘?，還有在高 濃度攝取等都可以引起有害身體的問(wèn)題，而且已有很多研究說(shuō)明吃藥 不如通過(guò)天然物攝取抗氧化劑，因此越來(lái)越多的研究者關(guān)心天然抗氧 化劑。中藥連翹為木犀科連翹屬植物連翹fotsythia suspensa (thunb)vahl的干燥果實(shí)，始載于神農(nóng)本草經(jīng)，性平，氣微香, 味微苦，具有清熱解毒、疏散風(fēng)熱、消癰散結(jié)、強(qiáng)心利尿和降血壓之 功效，主產(chǎn)于我國(guó)東北、華北、長(zhǎng)江流域至云南等地，其中以山西晉 南，河南豫西所產(chǎn)不但色澤鮮亮且質(zhì)量佳，為道地

7、藥材。連翹是我國(guó) 常用的大宗藥材，主要含有連翹酚(forsythol)、連翹昔(phil lyrin).連翹昔元(phi 1 lygenin).齊墩果酸(oleanol ic acid, ola)、白樺脂酸(betul inic acid)、烏索酸(ursolic acid,ua)、松 脂素(pinoresinol).輜醇化合物、馬苔樹(shù)脂醇昔(matairesinoside) 和多種姪類、醛酮類、醇酯瞇類揮發(fā)性成分12?，F(xiàn)代藥理研究表 明，連翹具有廣譜抗菌、抗病毒等作用，對(duì)丹毒、頸淋巴結(jié)結(jié)核、尿 路感染、扁桃體炎、腎炎雙球菌等均有抑制作用，常用于急性胃炎， 呼吸道感染等病癥。國(guó)內(nèi)有連翹敗毒片、

8、復(fù)方鱉甲軟肝片、復(fù)方金連 片、雙黃連口服液、復(fù)方金銀花沖劑等連翹復(fù)方制劑。雖然對(duì)連翹的抗氧化活性報(bào)道了一些，但對(duì)連翹的活性氧消除作 用及對(duì)氧化應(yīng)激保護(hù)作用的活性物質(zhì)的研究還不多。因此，對(duì)糖尿病、 癌、動(dòng)脈硬化、老年癡呆以及老化等諸多疾病起主要因素的氧化應(yīng)激, 進(jìn)行闡明連翹抗氧化性能，是很有研究意義的。所以，本研究利用體 外二苯 代苦味腓基自由基1, 1-dipheny l-2-picrylhydrazyl (dpph)清除方法，來(lái)探討連翹的抗氧化效果，并分離、鑒定有效成 分。1材料1, 1-dipheny 1-2-picrylhydrazyl (dpph)購(gòu)自日本 wako pure chem

9、ical industries, ltd.,分離用硅膠(200400 目)購(gòu)自青島化工廠，連翹果實(shí)購(gòu)于北京同仁堂藥店，并經(jīng)本教研室鑒定為 forsythia suspensa果實(shí)。所有試劑均為分析純。2方法2. 1連翹的提取與分離連翹根( 500 g),用8,6,6倍量的80% meoh加熱回流提取3次，每次3 h,合并3次提取液，減壓濃縮， 真空干燥，得甲醇提取干膏84.5 g。甲醇提取物用500 ml的水混 懸，依次用二氯甲烷(3次)、正丁醇(3次)萃取，得二氯甲烷萃取 物 45. 3 go22連翹抗氧化有效成分的分離取連翹二氯甲烷萃取物(24g)進(jìn)行硅膠柱色譜，醋酸乙酯-甲醇(100 ：

10、 12 ： 1)梯度洗脫， 薄層色譜配合檢識(shí)，得到6個(gè)組分(fr. 16)。fr. 4再經(jīng)硅膠柱 色譜，三氯甲烷-甲醇(20 : 1)洗脫，重結(jié)晶，得到化合物1( 20 mg),2 ( 98 mg ), 3 ( 20 mg ), 4 ( 25 mg )o2. 3 dpph自由基消除活性抗氧化活性是參照文獻(xiàn)13稍加 修改后用光譜儀檢測(cè)。用乙醇溶解的不同濃度的樣品100 u 1與120 hmol/l dpph溶液100 nl,加入96孔板中，混勻后,室溫放置30 min,然后在517 nm處測(cè)吸收度。dpph自由基水平用microplate reader (spectramax 340pc, mo

11、lecular devices, sunnyvale, ca, usa)測(cè)定。用百分率與不加樣品的對(duì)照組進(jìn)行自由基消除效果的比 較，然后用半數(shù)抑制率ic50 (抑制50%的dpph自由基生成所需樣品 的濃度)表示抗氧化活性。2.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法每組結(jié)果以土 s表示，控制組與樣品處理組間通過(guò) sas 8. 1 (sas inst i tute inc. , cary, nc, usa)軟件，用 one-wayanova分析數(shù)據(jù)。p< 005則可認(rèn)為組間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)的顯著差異。3結(jié)果3. 1體外dpph消除作用dpph自由基(二苯代苦味腓基自由基1, l-diphenyl-2-picryh

12、ydrazyl)是一種穩(wěn)定的以氮為中心的質(zhì)子自 由基，其乙醇溶液呈紫色，并在517 nm處有強(qiáng)烈吸收，在有自由基 清除劑存在時(shí)，自由基清除劑提供一個(gè)電子與dpph的孤對(duì)電子配對(duì), 而使其褪色，褪色程度與其接受的電子呈定量關(guān)系，在517 nm處的 吸光度變小，其變化程度與自由基清除程度呈線性關(guān)系，即自由基清 除劑的清除自由基能力越強(qiáng)，吸光度越小。連翹甲醇提取物及其不同溶劑萃取物均有濃度依賴性的 dpph消除作用，尤其是二氯甲烷萃取物具有較強(qiáng)的dpph消除作用(見(jiàn)圖ik如圖所示，不同濃度的連翹的甲醇提取物以及其二氯甲烷萃取物、 正丁醇萃取物和水萃取物均顯示出劑量依賴性地dpph自由離子基消 除活性

13、(p< 0.05)。尤其是二氯甲烷萃取物對(duì)dpph自由離子基的 產(chǎn)生具有最強(qiáng)的抑制作用(p< 0. 05 ),在100 mg/ml濃度就清除 75%的dpph,在各萃取組分中活性最強(qiáng)，可判斷為活性成分集中在連 翹的二氯甲烷萃取物中。3.2連翹有效成分的鑒定從連翹二氯甲烷萃取物中，分離得到 4個(gè)化合物。根據(jù)它們的理化性質(zhì)及其質(zhì)譜.1h-nmr、13c-nmr,與 文獻(xiàn)1416 致，被鑒定為連翹脂素(phillygcnin)、連翹昔(phi 1 lyrin) forsythialan a、連翹酯昔(forsythoside a)(見(jiàn) 圖2)。3. 3連翹有效成分的鑒定對(duì)

14、所分離的4個(gè)化合物進(jìn)行dpph自 由基清除活性檢測(cè)，結(jié)果forsythianlan a和連翹酯昔 (forsythoside a)具有較高的dpph清除活性(見(jiàn)表1)。它們的半 數(shù)抑制率(ic50)分別為154. 05和69.80 gg/ml,而其它兩個(gè)化 合物的半數(shù)抑制率超過(guò)200 mg/ml表1連翹有效成分的dpph自由 基清除作用(略)4討論活性氧自由基是生物體生命活動(dòng)過(guò)程中由機(jī)體生物化學(xué)反應(yīng)所產(chǎn) 生的中間產(chǎn)物，是一些處于激發(fā)態(tài)的含氧基團(tuán)，在生物體衰老與疾病、 正常的免疫代謝、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)等過(guò)程中都起著重要的作用。在正常 情況下，體內(nèi)自由基的產(chǎn)生和清除是平衡的，一旦自由基產(chǎn)生過(guò)多或 抗氧

15、化體系出現(xiàn)故障，體內(nèi)自由基代謝可能失衡，從而導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧 化、細(xì)胞損傷、dna斷裂等。研究發(fā)現(xiàn)，生物體的多種疾病都與自由 基對(duì)機(jī)體的氧化損傷有關(guān)?？寡趸瘎┗蜃杂苫宄齽┠苡行б种苹蚓?解自由基對(duì)機(jī)體的不利影響，起到防病、治病和延緩衰老的作用，因 此尋找和開(kāi)發(fā)能夠清除氧自由基的抗氧化劑成為當(dāng)前許多學(xué)科研究 的熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)采用了 dpph自由基清除活性方法來(lái)測(cè)定連翹各組分的抗 氧化活性，這種方法在國(guó)外廣泛用于植物材料的總抗氧化活性的評(píng)價(jià) 和抗氧化劑的篩選。dpph是一種穩(wěn)定存在的有機(jī)自由基，由于苯環(huán) 的內(nèi)軌和位阻及硝基的吸電子作用，呈現(xiàn)紫色，被還原后變?yōu)闇\黃色, 通過(guò)測(cè)定反應(yīng)體系在517 nm附近

16、的吸收峰的下降程度可以直接評(píng)價(jià) 其抗氧化活性，變化程度與自由基清除程度呈線性關(guān)系。該方法簡(jiǎn)便 易行，且靈敏度高。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，連翹的甲醇提取物及其二氯甲烷、正丁醇和水萃 取物都具有一定的抗氧化活性。甲醇提取物和二氯甲烷萃取物具有較 強(qiáng)的抗dpph自由基活性，尤其是二氯甲烷萃取物具有最強(qiáng)的抗氧化 活性(p< 0. 05 ),從中分離、鑒定了有效成分forsythialan a和 連翹酯昔，但其確切的作用機(jī)制尚需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。在接下來(lái)的實(shí) 驗(yàn)中，課題組將結(jié)合化學(xué)成分研究配合現(xiàn)代藥理學(xué)跟蹤，對(duì)獲得的主 要成分進(jìn)行深入研究，為其開(kāi)發(fā)利用提供化學(xué)和藥理學(xué)依據(jù)，以便擴(kuò) 大我國(guó)藥用資源的開(kāi)發(fā)

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