BDFACSCalibur流式細(xì)胞儀簡(jiǎn)易操作步驟corrZY

1、B D F A C S C a l i b u r流 式 細(xì) 胞 儀簡(jiǎn)易操作步驟一、開(kāi)機(jī)1） 先打開(kāi)凈化交流穩(wěn)壓電源，其次打開(kāi) 110V 穩(wěn)壓輸出電源，再次打開(kāi)流式細(xì)胞儀，最后打開(kāi)計(jì)算機(jī)。2） 向前拉開(kāi)儲(chǔ)液箱抽屜，檢查鞘液筒、廢液筒水量，如需充填鞘液，先將減壓閥（紅色箭頭所示）方向調(diào)在VENT 位置（箭頭方向），再加入超純水，保持水位在鞘液桶的3/4 左右，加好后擰緊桶蓋并將減壓閥方向調(diào)在RUN 位置。二、開(kāi)啟CellQuest軟件、編輯實(shí)驗(yàn)文件1）在屏幕下方點(diǎn)擊CELLQuest （第四個(gè)圖標(biāo)）啟動(dòng)軟件。桌面會(huì)出現(xiàn)一 Untitled實(shí)驗(yàn)文件，可點(diǎn)擊實(shí)驗(yàn)文件的左上角的放大鈕（綠色），將實(shí)驗(yàn)文

2、件窗口放大。2）從工具板中點(diǎn)擊散點(diǎn)圖圖示。在實(shí)驗(yàn)文件的空白區(qū)點(diǎn)擊，拖曳對(duì)角線至適當(dāng)大小，然后放開(kāi)鼠標(biāo)。出現(xiàn)散點(diǎn)圖對(duì)話方框（當(dāng)所要編輯的圖窗口被選中時(shí)，會(huì)在其四角出現(xiàn)四個(gè)小黑塊）。3）在出現(xiàn)的散點(diǎn)圖對(duì)話方框中點(diǎn)擊PlotSource ，選擇 AcquisitionandAnalysis(收取、分析 )，確認(rèn) X 和 Y 軸參數(shù)預(yù)設(shè)為FSC-H1024 、 SSC-H1024 。4）從屏幕上方Plots 菜單中選擇DotPlot 功能，可復(fù)制一個(gè)同樣大小的散點(diǎn)圖，在出現(xiàn)的對(duì)話方框內(nèi)選擇X 軸： FL1-H1024 ；如果是雙標(biāo)，Y 軸選擇： FL2-H1024( 根據(jù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)樣品確定所選通道，本步

3、驟選FL1/FL2 來(lái)說(shuō)明 )，如果是單標(biāo)，Y 軸選擇： SSC-H 。點(diǎn)擊 OK ，F(xiàn)L1/FL2 的散點(diǎn)圖出現(xiàn)。完成后可將重制圖移至原圖右方。說(shuō)明： 散點(diǎn)圖（ Dotplot ），又稱二維散點(diǎn)圖是流式分析最常用圖譜，它可以顯示兩個(gè)獨(dú)立參數(shù)的相互關(guān)系。在圖中，橫坐標(biāo)X 軸和縱坐標(biāo)Y 軸參數(shù)分別設(shè)為FSC-H1024 、 SSC-H1024 ；雙熒光標(biāo)記時(shí)，第二圖X 和 Y 軸參數(shù)分別設(shè)為FL1-H1024 、 FL2-H1024 ， X 軸為為熒光 1 強(qiáng)度的相對(duì)值，單位是道數(shù)，Y 軸則通常表示熒光2 或光散射強(qiáng)度的相對(duì)值。儀器使用者可因?qū)嶒?yàn)需求來(lái)修改所有圖譜中顯示之參數(shù)。修改動(dòng)作為輕擊圖譜

4、上X和Y軸參數(shù)，并依需要選擇之（FSC ：細(xì)胞大小， SSC ：細(xì)胞折射率，F(xiàn)L1 ： FITC 綠色熒光，F(xiàn)L2 ：PE 橙色熒光， FL3 ： PerCP 紅色熒光）。5）在工具板中選擇四象限工具，在FL1/FL2 散點(diǎn)圖上拖動(dòng)Quadrant的中心將它設(shè)定在（x，y）（ 10 1， 10 1）處，這些象限將指定陰性/陽(yáng)性區(qū)域。6）從工具板中點(diǎn)擊直方圖圖示，在實(shí)驗(yàn)文件的空白區(qū)點(diǎn)擊，拖曳對(duì)角線至適當(dāng)大小，然后放開(kāi)鼠標(biāo)。單色熒光只需一個(gè)直方圖，和第二個(gè)散點(diǎn)圖一樣，橫坐標(biāo)選擇FL-1 ，縱坐標(biāo)默認(rèn)為Counts ；若是雙色熒光，需畫(huà)2 個(gè)直方圖，一個(gè)橫坐標(biāo)選擇FL-1-1024 ，另一個(gè)橫坐標(biāo)選

5、擇 FL-2-1024 ；7 ）在上面直方圖中畫(huà)出 M1 和 M2 ，其中 M1 代表隱性數(shù)目（一般標(biāo)示是101）， M2 代表陽(yáng)性數(shù)目（除 M1 以外所有的部分）。8）從 Stats 菜單中選擇QuadrantStats （象限統(tǒng)計(jì)）,5）步驟中的點(diǎn)圖將分為四個(gè)象限。三、建立儀器和計(jì)算機(jī)之間通訊從 Acquire 菜單中選擇 ConnecttoCytometer( 快捷鍵 Win+b) ，此時(shí)會(huì)出現(xiàn)AcquisitionControl對(duì)話方框。四、儀器設(shè)置文件注意： 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)質(zhì)量，取決于最適化儀器設(shè)定文件。儀器設(shè)定文件不能在數(shù)據(jù)收取后再更改，研究人員必須在第一次就使用正確的儀器設(shè)定文件。儀器

6、設(shè)定文件（ Instrumentsettings ），含信號(hào)器高壓（ Detector/Amps ），閾值（ Threshold ），熒光補(bǔ)償（ Compensation）等儀器條件的組合。一般而言，儀器設(shè)定的順序?yàn)镈etector/Amps-Threshold-Compensation。1）檢查現(xiàn)有儀器條件，從 Cytometer 菜單中選擇 Detectors/Amps 。出現(xiàn) Detectors/Amps 窗口。在 Detectors/Amps 窗口確認(rèn) FSC 與 SSC （根據(jù)實(shí)驗(yàn)樣品確定，一般細(xì)胞選擇 LIN ，細(xì)菌選擇 LOG ），其它 FL1-3 為L(zhǎng)OG （對(duì)數(shù)放大），將其拖

7、至空白區(qū)。2）從 Cytometer菜單中選擇Threshold ，出現(xiàn) Threshold窗口在 Threshold窗口：確認(rèn)FSC 為設(shè)閾參數(shù)，初步確認(rèn)預(yù)設(shè)閾值52 。將其拖至空白區(qū)。3）從 Cytometer 菜單中選擇 Compensation ，確認(rèn)所有預(yù)設(shè)數(shù)值皆為零。將其拖至空白區(qū)。五、上樣品、設(shè)置儀器使儀器處于HighRUN ，樣品管支撐架左移，上陰性對(duì)照管樣品，支撐架回位。確認(rèn)AcquisitionControl窗口中Setup 前需打叉或打勾(即不儲(chǔ)存數(shù)據(jù)，用于儀器設(shè)置)，點(diǎn)擊 Acquire 。1 、調(diào)節(jié) FSC/SSC探測(cè)器（電壓）觀察 FSC/SSC圖的變化。 FSC

8、電壓 (Voltage) 預(yù)設(shè)為 E00 ，可調(diào)節(jié)AmpGain從 1.00 9.99 使主要細(xì)胞群得以清楚顯示（如細(xì)胞較大，將FSC 電壓設(shè)置于E-1 ；較小細(xì)胞，將FSC 電壓設(shè)置于E01 ）。調(diào)節(jié)SSC 電壓使主要細(xì)胞群得以清楚呈現(xiàn)。調(diào)節(jié)FSC/SSC 圖的原則，在于能得到一獨(dú)立離散的細(xì)胞族群，該細(xì)胞群不與其它族群、細(xì)胞碎片有重迭現(xiàn)象。調(diào)整定位后，點(diǎn)擊 AcquisitionControl 窗口中的 Pause 。2 、 Gating圈選細(xì)胞檢品中，常含有大小不同、性質(zhì)相異的細(xì)胞群體。我們常用前方散射（FSC ）與側(cè)方散射（ SSC ）的二維位圖，即散射光圖譜（ ScatterPlot

9、），來(lái)圈選出不同細(xì)胞群的范圍，選擇性顯示出有意義的細(xì)胞群體，如下圖圈選白血球之淋巴細(xì)胞族群。1）在工具板中選擇多邊形的Region ，在 FSC/SSC 散點(diǎn)圖上劃定淋巴細(xì)胞R1 區(qū)域（如下圖）。分析樣品時(shí)，區(qū)域內(nèi)細(xì)胞應(yīng)會(huì)呈現(xiàn)成紅色，可移動(dòng)或改變形狀來(lái)圈選有意義的細(xì)胞。如果要?jiǎng)h除R1 區(qū)域，您可以在工具列中點(diǎn)選Gates Regionlist，以鼠標(biāo)點(diǎn)選R1 ，再按 Delete 鍵刪除 R1 區(qū)域。刪除R1 區(qū)域后，可用繪圖工具板，重畫(huà)R1 。2） 選取希望Gate 的 FL1/FL2 散點(diǎn)圖，從Plots 菜單中選擇Formatdotplot。在出現(xiàn)的對(duì)話方框內(nèi)，將NoGate 改選 G1

10、=R1 。點(diǎn)擊 OK 。3 、調(diào)節(jié)FL1 、 FL2的探測(cè)器（電壓）1 ）點(diǎn)擊 AcquisitionControl窗口中的Restart 。在 Detector/Amps窗口中調(diào)節(jié)FL1 、 FL2的電壓，使NegativeControl細(xì)胞群著落在所選直方圖或散點(diǎn)圖之10 0-10 1 處。2）在 Threshold 窗口，適當(dāng)?shù)靥岣?FSC 閾值 >52 ，以去除碎片或低階噪音。唯需注意不要切掉主要細(xì)胞族群。3）點(diǎn)擊 AcquisitionControl窗口中的 Pause 、 Abort 。移去陰性對(duì)照管，我們已設(shè)定好有意義細(xì)胞群之自體熒光，不要再改動(dòng)Detector/Amps、

11、Threshold等數(shù)值。4 、調(diào)節(jié)熒光補(bǔ)償說(shuō)明：最適化的最后一步是調(diào)節(jié)光譜重迭。（如是單色熒光實(shí)驗(yàn)可跳過(guò)此步驟）如是樣本，必要時(shí)需調(diào)節(jié)FL2-%FL1 ， FL1-%FL2 （若 3 色樣本，必要時(shí)需調(diào)節(jié)FL2-%FL1FL1-%FL2 、 FL3-%FL2 、 FL2-%FL3的補(bǔ)償）。2 色、1）HighRUN窗口中的，換上單染CD3-FITC管。點(diǎn)擊AcquisitionControlAcquire 。調(diào)節(jié) FL2-%FL1使 FITC 陽(yáng)性細(xì)胞在FL1/FL2散點(diǎn)圖的右下象限。補(bǔ)償調(diào)節(jié)可通過(guò)點(diǎn)擊來(lái)選擇或直接拖動(dòng)滑標(biāo)上下移動(dòng)。調(diào)節(jié)完畢，點(diǎn)擊窗口中的 Pause 。Acquisition

12、Control2）移去單染CD3 ，換上單染CD19-PE管。點(diǎn)擊AcquisitionControl窗口中的Restart 。調(diào)節(jié) FL1-%FL2細(xì)胞在 FL1/FL2 散點(diǎn)圖的左上象限。調(diào)節(jié)完畢，點(diǎn)擊使 PE+AcquisitionControl窗口中的Pause 。3. ）最后以 CD3-FITC/CD19-PE雙染樣本上機(jī)，點(diǎn)擊AcquisitionControl窗口中的 Restart ，確定三群細(xì)胞工整垂直。當(dāng)您已完成2 色熒光之光譜重迭時(shí)，點(diǎn)擊AcquisitionControl窗口中的 Pause 、 Abort 。4）移去樣本管，換上dH2O 管，讓儀器暫且處于Standb

13、y狀態(tài)。關(guān)閉Compensation窗口。您已完成2 色熒光之最適化。六、收集實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)1）決定儲(chǔ)存細(xì)胞總數(shù)：預(yù)設(shè)之儲(chǔ)存細(xì)胞總數(shù)為 10000 中選擇 Acquisition&Storage ，并在出現(xiàn)的窗口功，確認(rèn)。如需修改，從AcquireCollectionCriteria從菜單10000ofAll，再點(diǎn)擊OK 。2） 找個(gè)檔案匣準(zhǔn)備儲(chǔ)存數(shù)據(jù)，本機(jī)所有數(shù)據(jù)都貯存在D 盤(pán) data 盤(pán)中，按實(shí)驗(yàn)日期編排 。 從 Acquire 菜單中選擇ParameterDescription，出現(xiàn) ParameterDescription對(duì)話方框。點(diǎn)擊Folder ，并在隨后出現(xiàn)之對(duì)話方框，選擇Y

14、ourFolder 或新建活頁(yè)夾，點(diǎn)擊此對(duì)話方框的Select YourFolder（一般用實(shí)驗(yàn)日期來(lái)命名Folder ）。3）命名即將儲(chǔ)存之文件名：點(diǎn)擊ParameterDescription對(duì)話方框的File ，出現(xiàn)文件名編輯窗口，輸入文件名（根據(jù)實(shí)驗(yàn)來(lái)決定），點(diǎn)擊此對(duì)話方框的OK。4） Optional ：如有需要，可選擇或在P1-P5 后的空格中輸入相關(guān)參數(shù)名。如P1 ：Size,P2 ： Granularity,P3： CD3FITC 。輸入?yún)?shù)名會(huì)存入實(shí)驗(yàn)檔案中，顯示在圖譜上。5 ）計(jì)數(shù)器 Counters ：從 Acquire 菜單中選擇 Counters. 窗口會(huì)顯示樣品分析速

15、率、與總數(shù)進(jìn)度6 ）開(kāi)始收集實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。 LOWRUN （根據(jù)Counters來(lái)調(diào)節(jié)速度，一般保持在700-800/Second ），將第一管樣品放到檢測(cè)區(qū)，在AcquisitionControl窗口中，將Setup改成Setup ，此時(shí)CellQuest會(huì)自動(dòng)顯示YourFolder文件名為資料文件名。點(diǎn)擊“ Acquire ”便可啟動(dòng)樣品之分析測(cè)定與數(shù)據(jù)儲(chǔ)存。當(dāng)計(jì)算機(jī)成功地收取足夠數(shù)據(jù)，會(huì)自動(dòng)儲(chǔ)存數(shù)據(jù)文件文件名 .001 ，并會(huì)以“嘟”聲告知， CellQuest 會(huì)自動(dòng)升冪附加檔名成文件名 .002 。等待下一指示。7）換上超純水，清洗管路，直到 Counters 持續(xù)顯示 0/Second30s( 約為 10-20s) ，換上下一管樣品，點(diǎn)擊“ Acquire ”啟動(dòng)樣品之分析測(cè)定與數(shù)據(jù)儲(chǔ)存?？衫^續(xù)分析直到所有檢品都分析完畢。七、退出軟件并關(guān)機(jī)1） .檢品分析完畢后，記得從屏幕上方File 指令欄選擇SaveAs ，儲(chǔ)存實(shí)驗(yàn)文件，以備日后使用，不需每次重新編輯。2）檢品分析完畢后，用鼠標(biāo)從屏幕上方Acquire 指令欄中，選取DisconnecttoCytometer以斷絕計(jì)算機(jī)與儀器間之聯(lián)機(jī)。之后如不分析數(shù)據(jù)，您可退出軟件“File ”“ Quit ”(遇有選項(xiàng)永遠(yuǎn)選擇“Don tsav