微生物 基因工程菌

1、基因工程菌2大腸桿菌3被選為基因工程菌的原因常見易得，易于培養(yǎng)質(zhì)粒為常用運載體代謝迅速, 經(jīng)濟高效基因工程菌的通性基因工程菌的通性4作為表達外源基因受體菌的優(yōu)劣比較劣勢缺乏對真核生物蛋白質(zhì)的復性功能缺乏對真核生物蛋白質(zhì)的修飾加工系統(tǒng)內(nèi)源性蛋白酶降解空間構(gòu)象不正確的異源蛋白細胞周質(zhì)內(nèi)含有種類繁多的內(nèi)霉素優(yōu)勢基因克隆表達系統(tǒng)完善全基因組測序，共有4405個開放型閱讀框架繁殖迅速、培養(yǎng)簡單、操作方便、遺傳穩(wěn)定被美國FDA批準為安全的基因工程受體生物工程菌高密度發(fā)酵工藝自重組DNA技術(shù)產(chǎn)生以來，許多在臨床上具有重要治療價值的蛋白藥物通過攜帶有目的基因的大腸桿菌成功地在實驗室和工廠得以生產(chǎn)。利用基因重組

2、技術(shù)構(gòu)建的基因工程菌的發(fā)酵工藝不同于傳統(tǒng)的發(fā)酵工藝，生物工程菌發(fā)酵的目的是希望能狄得大量的外源基因產(chǎn)物，盡可能減少宿主細胞本身蛋白的污染。外源基因的高水平表達不僅涉及宿主、載體和目的基因二者之間的相互關(guān)系，而且與其所處環(huán)境條件息息相關(guān)，因此僅按傳統(tǒng)的發(fā)酵工藝生產(chǎn)生物制品是遠遠不夠的，需要對影響外源基因表達的因素進行分析，探索出適合外源基因表達的發(fā)酵工藝。高密度、高產(chǎn)率和高濃度培養(yǎng)是近幾年發(fā)酵工業(yè)的目標和方向。對于大腸桿菌，尤其是重組大腸桿菌的發(fā)酵來講，實現(xiàn)高密度發(fā)酵，可相應的縮小生物反應器的體積和降低生物量的分離費用，從而降低生產(chǎn)成本，達到提高生產(chǎn)效率的目的。通過對基因工程菌(RRhPI-pQ

3、E40 E.coli M15)發(fā)酵條件的優(yōu)化，可以看出搖床轉(zhuǎn)速與補料方式對發(fā)酵結(jié)果影響最大.搖床轉(zhuǎn)速與發(fā)酵過程中氧氣的供給有很大的關(guān)系。大腸桿菌的生長代謝需要氧氣的參與，溶解氧濃度對菌體的生長及重組產(chǎn)物的影響很大，溶解氧的濃度過高或過低都會影響大腸桿菌的代謝，使后期生長變得極為緩慢，而且會降低重組蛋白的表達量.菌體在進行大量的增殖過程中，消耗氧進行氧化分解代謝，因而飽和氧的及時供給非常重要。隨著發(fā)酵的進行菌體的細胞密度迅速增加，溶解氧的濃度因不斷被菌體消耗而降低，細胞的生長開始減慢，ST值下降，尤其在發(fā)酵后期，下降幅度更大。在高密度發(fā)酵后期，由于菌體密度的擴增，耗氧量極大，發(fā)酵罐的各項物理參數(shù)

4、均不能滿足對氧的供給，結(jié)果導致外源蛋白的表達量很低。所以維持較高水平的溶氧濃度能提高帶有重組質(zhì)粒的大腸桿菌的生長繁殖，有利于外源基因的重組蛋白的表達。一般的高密度發(fā)酵的通風速度達到18L/min ( 20L發(fā)酵罐)，攪拌速度達到500rpm以上，往往還需要供給純氧，需保持60%以上的溶氧飽和度，這樣才能提高帶有重組質(zhì)粒細胞的生長，利于外源蛋白產(chǎn)物的形成。需要注意的是，要考慮通風速度和攪拌速度的增加對泡沫的產(chǎn)生和發(fā)酵液粘稠度的影響，需要在培養(yǎng)基中加入適宜的消泡劑。6酵母菌7酵母菌在工程菌中的應用單細胞真核生物的酵母菌具有比較完備的基因表達調(diào)控機制和對表達產(chǎn)物的加工修飾能力。釀酒酵母（Saccha

5、romyces.Cerevisiae）在分子遺傳學方面被人們的認識最早，也是最先作為外源基因表達的酵母宿主。1981年釀酒酵母表達了第一個外源基因-干擾素基因，隨后又有一系列外源基因在該系統(tǒng)得到表達干擾素和胰島素雖然已經(jīng)利用釀酒酵母大量生產(chǎn)并被廣泛應用，當利用釀酒酵母制備時，實驗室的結(jié)果很令人鼓舞，但由實驗室擴展到工業(yè)規(guī)模時，其產(chǎn)量迅速下降。原因是培養(yǎng)基中維特質(zhì)粒高拷貝數(shù)的選擇壓力消失質(zhì)粒變得不穩(wěn)定，拷貝數(shù)下降?？截悢?shù)是高效表達的必備因素，因此拷貝數(shù)下降，也直接導致外源基因表達量的下降。同時，實驗室用培養(yǎng)基成分復雜且昂貴，當采用工業(yè)規(guī)模能夠接受的培養(yǎng)基時，導致了產(chǎn)量的下降。為克服釀酒酵母的局限

6、，1983年美國Wegner等人最先發(fā)展了以甲基營養(yǎng)型酵母（methylotrophic yeast）為代表的第二代酵母表達系統(tǒng)。甲基營養(yǎng)型酵母包括：Pichia、Candida等以Pichia.pastoris（畢赤巴斯德酵母）為宿主的外源基因表達系統(tǒng)近年來發(fā)展最為迅速，應用也最為廣泛。酵母菌作為基因工程菌的優(yōu)勢1.酵母菌是最成熟的真核生物表達系統(tǒng)2.全基因組測序，基因表達調(diào)控機理比較清楚，遺傳操作簡單3.具有原核生物無法比擬的真核蛋白翻譯后加工系統(tǒng)4.大規(guī)模發(fā)酵歷史悠久，技術(shù)成熟，工藝簡單，成本低廉。5.能將外源基因表達產(chǎn)物分泌到培養(yǎng)基中6.不含有特異性的病毒，不產(chǎn)內(nèi)毒素9傳統(tǒng)酵母轉(zhuǎn)化系統(tǒng)

7、先使纖維素酶基因與表達載體相結(jié)合，再將重組體轉(zhuǎn)入酵母細胞內(nèi)形成轉(zhuǎn)化子，表達目的基因，從而產(chǎn)生纖維素酶蛋白，這是傳統(tǒng)酵母轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。目前有 2種方法可以使酵母細胞攝取外源 DNA ，即原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化和完整細胞轉(zhuǎn)化?，F(xiàn)在采用較多的是完整細胞轉(zhuǎn)化的方法，該方法是1983年發(fā)展起來的。此方法雖然要用Li離子處理細胞，但和原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法相比，則比較簡單，在篩選轉(zhuǎn)化子時，不必進行細胞壁再生，而且Li離子處理完整酵母細胞的轉(zhuǎn)化率比原生質(zhì)體的高。但必須用聚乙二醇處理轉(zhuǎn)化細胞，否則轉(zhuǎn)化率會大幅度下降。11酵母表面展示系統(tǒng)酵母表面展示系統(tǒng)的類型目前，最常見的酵母表面展示表達系統(tǒng)包括: 凝集素展示表達凝集素展示表達和

8、絮凝素絮凝素展示表達展示表達。凝集素展示表達系統(tǒng)是將外源基因與酵母編碼凝集素C端編碼序列(含GPI錨定信號序列)連接后插入質(zhì)粒載體的信號肽下游， 融合蛋白誘導表達后， 信號肽引導嵌合蛋白向細胞外分泌， 由于融合蛋白C末端存在含GPI錨定信號的凝集素多肽序列，可將蛋白錨定在酵母細胞壁中，從而將蛋白分子展示表達在酵母細胞表面。絮凝素展示表達系統(tǒng)利用絮凝素基因與外源蛋白融合，并將融合蛋白展露表達在細胞表面，此系統(tǒng)又包括兩個子系統(tǒng): GPI錨定系統(tǒng)和絮凝結(jié)構(gòu)域錨定系統(tǒng)。GPI錨定系統(tǒng)是利用絮凝素Flo1p的C末端含有的GPI信號錨定外源蛋白，此系統(tǒng)與凝集素展示相似; 絮凝結(jié)構(gòu)域錨定系統(tǒng)是利用Flo1p

9、的中間絮凝功能結(jié)構(gòu)域與外源蛋白融合，通過絮凝功能結(jié)構(gòu)域識別酵母細胞壁中的甘露聚糖鏈并非共價作用誘導細胞粘附、聚集成可逆性絮狀物。酵母表面展示與酶技術(shù)酶的固定化是指借助物理或者化學方法將酶固定于特殊的相，使得酶與整體流體分開，但是仍然能夠進行底物和效應物分子交換并發(fā)揮其催化效能的一種技術(shù)。與游離酶相比，固定化酶提高了酶的穩(wěn)定性，并使酶能夠反復回收利用。但是，傳統(tǒng)的固定化方法也會產(chǎn)生一些不利因素，例如由于增加固定化操作，導致酶固定化過程中的活性收率損失；另外由于固定化操作需用載體，因而增加了載體成本費和固定化操作費用。酵母表面展示與酶技術(shù)利用表面展示技術(shù)將具有催化活性的酶展示于酵母等微生物細胞表面

10、就形成了全細胞催化劑，與傳統(tǒng)的細胞內(nèi)酶和外分泌酶不同，表面展示的酶以共價或非共價方式固定于細胞外表面，這種獨特的空間定位使其相對自由酶而言有許多優(yōu)良的特性，如溫度、有機溶劑穩(wěn)定性、可多次重復使用等，這些特點與傳統(tǒng)的固定化酶技術(shù)相似，但無需額外的蛋白純化和固定的操作，有著良好的應用前景。Katsumi利用凝集素系統(tǒng)將來源于產(chǎn)黃菌屬的 OPH 展示于酵母細胞表面，細胞熒光強度測量表明每個細胞表面可以展示 1.410 4 個 OPH 分子，酵母展示系統(tǒng)OPH酶活性較大腸桿菌冰晶核蛋白展示的酶活性更高，為有機磷化合物的脫毒提供了一種有效的生物催化劑。表面展示與酒精發(fā)酵傳統(tǒng)的酒精發(fā)酵是以淀粉質(zhì)谷物或糖蜜

11、為原料。隨著燃料酒精需求的日益增長，以天然纖維素類資源生產(chǎn)酒精的研究也日益受到人們重視。由于纖維素類物質(zhì)是自然界中一種潛在的可再生資源，對解決未來能源問題有著巨大的潛力，因此，天然纖維素酒精發(fā)酵具有重要意義。Fujita 等成功地將三種纖維素水解酶同時展示在釀酒酵母表面，從而構(gòu)建了能夠增效和按順序降解纖維素的全細胞生物催化劑。酵母表面展示系統(tǒng)與新藥篩選 將未知功能的目的基因產(chǎn)物或特定病理過程相關(guān)蛋白產(chǎn)物展示在酵母表面，對cDNA 表達文庫或突變體庫進行篩選，能發(fā)現(xiàn)與這些未知功能的基因產(chǎn)物或病理過程相關(guān)產(chǎn)物發(fā)生相互作用的物質(zhì)，有助于對未知基因功能的研究，并能發(fā)現(xiàn)一些藥物作用的新靶點，或篩選到治療

12、疾病的新藥先導化合物。Visintin 等將酵母表面展示技術(shù)與酵母雙雜交技術(shù)相結(jié)合，將抗體的scFv 片斷連接到轉(zhuǎn)錄因子VP16 的激活結(jié)構(gòu)域( AD) 上， 將抗原連接到LexA的結(jié)合結(jié)構(gòu)域( DB) 上，以His3和LacZ 為報告基因， 建立抗原抗體相互作用的展示方法。當抗原- 抗體發(fā)生相互作用時，AD 和DB 的結(jié)合將啟動報告基因的表達，可通過營養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基進行檢測。這種方法從scFv 突變體展示庫中將有可能篩選到抗原特異的抗體，為疫苗及抗體類藥物的研制提供良好的平臺。酵母細胞表面展示與生物吸附環(huán)境污染物的生物修復是以酶促降解或生物吸附為基礎的，例如微生物對重金屬的吸附就包括兩種途徑:

13、 ( 1) 與細胞表面復合物結(jié)合，( 2) 逐漸吸收在細胞內(nèi)進行消化。然而通過胞內(nèi)消化降解有毒物質(zhì)必須使細胞內(nèi)酶，蛋白質(zhì)或污染物跨越細胞膜這一屏障，比較緩慢及效率低而且不可重復利用利用表面展示技術(shù)能較好地解決這一問題，吸附蛋白直接展示在細胞表面，不僅使吸附過程快捷高效還可以利用回復劑如EDTA 對其進行處理使之不斷重復利用。蘇云金芽孢桿菌蘇云金芽孢桿菌殺蟲原理產(chǎn)生芽孢時產(chǎn)生伴孢晶體由幾種晶體蛋白即-2內(nèi)毒素組成-2內(nèi)毒素分為Cry和Cyt兩類：Cry活體條件下只對雙翅目幼蟲有毒,離體條件下具廣譜性;Cry分為4種,CryI對鱗翅目幼蟲有毒, CryII對鱗翅目和雙翅目均有毒,CryIII對鞘翅

14、目有毒,CryIV對雙翅目有毒。20蘇云金芽孢桿菌基因改造作物優(yōu)點蘇云金芽孢桿菌基因改造作物有如下優(yōu)點：殺蟲毒素釋放量大，足以殺滅害蟲植物產(chǎn)生的毒素不會釋放到外界，只有植食害蟲才會進食死亡產(chǎn)生毒素可由組織特異性啟動子調(diào)控抗蟲性是依據(jù)孟德爾的遺傳規(guī)律進行穩(wěn)定遺傳毒素基因可裝載在葉綠體基因中，因此排除了通過花粉傳播的途徑天然蘇云金芽孢桿菌作為殺蟲菌的缺陷蘇云金芽孢桿菌存在的殺蟲譜窄、持效期短等缺陷。嚴重影響了蘇云金芽孢桿菌的實際應用。但與轉(zhuǎn)基因植物相比，基因重組微生物具有研究快速、生產(chǎn)方便、應用靈活、害蟲不易產(chǎn)生抗性等諸多優(yōu)點。從自然界篩選新的蘇云金芽孢桿菌菌株利用分子生物學的技術(shù)鑒定和克隆具有新殺蟲特性的殺蟲晶體蛋白基因利用基因重組結(jié)合轉(zhuǎn)移等基因工程的手段構(gòu)建新的或具有多重殺蟲功效的蘇云金芽孢桿菌工程菌目前國內(nèi)外對蘇云金芽孢桿菌工程菌的改造主要集中在：擴大殺蟲范圍增強持效性植物內(nèi)生性在水體中提高活性改善土壤中的活性提高毒力等23農(nóng)藥真菌24真菌能作為昆蟲農(nóng)藥的理論依據(jù)真菌是昆蟲病原微生物中最大的一個類群，已發(fā)現(xiàn)約有1000 種自然條件下全部病死昆蟲中約60% 因真菌致病而亡與病毒、細菌通過胃毒殺蟲的途徑不同, 真菌主要通過昆蟲體壁侵染昆蟲, 可侵染刺吸式口器的昆蟲和處于非取食期的昆蟲卵和蛹等真菌侵染和致病機制復