實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)病毒核酸方法學(xué)性能驗(yàn)證程

1、實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)病毒核酸方法學(xué)性能驗(yàn)證程序的探討蔣玲麗王雪亮王華梁肖艷群 摘要 目的 探討實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（pcr）檢測(cè)病毒核酸的方法學(xué)性能驗(yàn)證程序。方法 參考美國(guó)國(guó)家臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（clsi ）頒布的相關(guān)文件對(duì)實(shí)驗(yàn)室開展pcr檢測(cè)病毒核酸進(jìn)行方法學(xué)性能驗(yàn)證； 通過稀釋標(biāo)本直至低于檢測(cè)下限進(jìn)行定量檢出限驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。結(jié)果 乙型肝炎病毒核酸（hbv-dna ）檢測(cè)的批內(nèi)精密度（cv批內(nèi)）分別為 4.28% 和 2.08%； 總精密度（cv總）為 4.14% 和 2.69%；與比對(duì)方法回歸方程為y=1.1082x-0.5225；線性相關(guān)系數(shù)為0.9976， 回歸方程為y=0.977

2、1x-0.0062 ， 線性范圍為 1.08e31.05e8； 定量檢出限為 500 iu/ml 。 丙型肝炎病毒核酸（ hcv-rna ）檢測(cè)的 cv批內(nèi)分別為 4.11%和 2.63%；cv總為 5.15% 和 3.41%；與比對(duì)方法回歸方程為y=1.0075x-0.0662； 線性相關(guān)系數(shù)為0.9974， 回歸方程為y=1.0479x-0.2594， 線性范圍為1.50e32.53e7； 定量檢出限為1000 iu/ml 。 結(jié)論 實(shí)驗(yàn)室開展pcr 檢測(cè)項(xiàng)目前有必要進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，根據(jù)實(shí)際情況選擇實(shí)驗(yàn)方案和統(tǒng)計(jì)方法可減少人力和財(cái)力。 關(guān)鍵詞 精密度； 正確度；性能驗(yàn)證discussion

3、 of the performance verification procedures of the real-time quantitative polymerase chain reaction for determination of virus nucleic acid jiang lingli ，wang xueliang ，wang hualiang ，xiao yanqun(shanghai center for clinical laboratory, shanghai 200126, china)abstract objective to discuss the reason

4、able performance veri?cation procedures of real-time quantitative ?uorescent polymerase chain reaction for determination of virus nucleic acid.methods the performance veri?cation procedures were applied according to the related documents published by clinical and laboratory standards institute(clsi)

5、. the limits of quanti?cation were veri ?ed by diluting the samples to which can not be tested. results the within-run coef ?cient of variation( cv ) of hbv-dna were 4.28% and 2.08%, the total cv were 4.14% and 2.69% and the regression equation was y=1.1082x-0.5225; the correlation of linearity was

6、0.9976, the regression equation was y=0.9771x-0.0062, the linearity range was 1.05e31.05e8 and the limit of quantitation was 500 iu/ml. the within-run cv of hcv-rna were 4.11% and 2.63%, the total cv were 5.15% and 3.41%, the regression equation was y=1.0075x-0.0662; the correlation of linearity was

7、 0.9974， the regression equation was y=1.0479x-0.2594， the linearity range was 1.50e32.53e7 and the limit of quantitation was 1000 iu/ml.conclusion it is necessary to run the performance veri?cation procedures before using new tests in clinical laboratory. the performance veri?cation procedures of q

8、uantitative pcr for testing nucleic virus and the statistics methods are selected on the basis of practical situations.key words precision; correctness; performance veri?cation作者單位： 上海市臨床檢驗(yàn)中心， 上海 200126通訊作者：肖艷群，e-mail ：檢測(cè)系統(tǒng)或方法學(xué)的分析性能評(píng)價(jià)是臨床檢驗(yàn)質(zhì)量管理的重要內(nèi)容。根據(jù)美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室改進(jìn) 法 案 修 正 案 （ clinical laboratory improve

9、ment amendment 88，clia88 ）規(guī) 定，美 國(guó) 病 理 家 學(xué) 會(huì)（college of american pathologists， cap）認(rèn)可的實(shí)驗(yàn)室在開展某一檢測(cè)項(xiàng)目前需提供并保留相關(guān)的方法?論 著 ?321分子診斷與治療雜志2012 年 9 月第 4 卷第 5 期 j mol diagn ther, september 2012, vol. 4 no. 5學(xué)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)1。 醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量和能力認(rèn)可準(zhǔn)則 （iso15189 2007）指出實(shí)驗(yàn)室應(yīng)評(píng)估工作所選用的方法和程序2。 iso15189 是國(guó)際醫(yī)學(xué)界普遍承認(rèn)并遵照?qǐng)?zhí)行的關(guān)于醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量和能力方面要求的國(guó)際

10、標(biāo)準(zhǔn)， 其技術(shù)要素5.3.2 中指出應(yīng)確定設(shè)備（在安裝時(shí)及常規(guī)使用中）能夠達(dá)到所要求的性能標(biāo)準(zhǔn)。畢波等3指出不同的檢測(cè)項(xiàng)目和檢測(cè)系統(tǒng)需選擇不同的方法學(xué)驗(yàn)證程序。pcr 定量檢測(cè)病毒核酸實(shí)驗(yàn)程序繁瑣， 涉及手工操作步驟多，并且由于其檢測(cè)成本高及某些特殊項(xiàng)目的陽性標(biāo)本稀缺，其方法學(xué)驗(yàn)證程序和統(tǒng)計(jì)方法常困擾檢驗(yàn)人員。筆者于本實(shí)驗(yàn)室對(duì)定量pcr 檢測(cè) hbv-dna和 hcv-rna 的方法學(xué)驗(yàn)證過程進(jìn)行探討。1材料與方法1.1 材料1.1.1 標(biāo)本來源hbv-dna標(biāo)本來自上海東方醫(yī)院，hcv-rna標(biāo)本來自上海仁濟(jì)醫(yī)院東院。所有標(biāo)本在分離血清后當(dāng)天收集并于-20保存?zhèn)溆谩?.1.2 儀器roche

11、 lightcyclerii熒光定量檢測(cè)儀、 hb-100 型恒溫金屬浴、 biofuge-fresc o 高速冷凍離心機(jī)。1.1.3 試劑hbv-dna 、 hcv-rna 均為上?？迫A生物工程股份有限公司生產(chǎn)， 批號(hào)分別為20111212 和 20111210。2方法2.1 精密度評(píng)價(jià)參照 ep15-a 文件4。每天分析1 個(gè)批次，2 個(gè)濃度樣本， 每個(gè)樣本重復(fù)測(cè)定4 次， 連續(xù)檢測(cè)5 天。hbv-dna樣本為高低兩個(gè)濃度質(zhì)控品；hcv-rna低濃度樣本為質(zhì)控品，高濃度樣本為臨床收集標(biāo)本。質(zhì)控品均為本中心產(chǎn)品，批號(hào)為1101。參照文獻(xiàn)5計(jì)算批內(nèi)精密度 （cv批內(nèi)）和總精密度 （cv總）2.

12、2正確度評(píng)價(jià)采用 ep9-a2 文件6。從已通過臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)驗(yàn)收的實(shí)驗(yàn)室中收集臨床標(biāo)本各40例， 標(biāo)本濃度盡量涵蓋線性范圍。收集后的標(biāo)本在一周內(nèi)集中檢測(cè)， 每個(gè)標(biāo)本重復(fù)檢測(cè)2 次。取均值與醫(yī)院檢測(cè)系統(tǒng)結(jié)果進(jìn)行比對(duì)。計(jì)算兩者線性相關(guān)系數(shù) （r） ， 并進(jìn)一步計(jì)算兩個(gè)項(xiàng)目各自的回歸曲線。根據(jù) westgard 7提出的計(jì)算方法，分別計(jì)算當(dāng)檢測(cè)值log10=3、 4 、 5 、 6、 7 時(shí) 的 允 許 總 誤 差 （total error，te） 。計(jì)算 te = 偏倚（bias）+3cv（這里的cv采用精密度性能評(píng)估中兩個(gè)濃度的精密度均值）， 與目標(biāo) te 比較 （目標(biāo) te 為廠

13、商允許的總誤差10%） ，te0.05， 表明兩個(gè)項(xiàng)目與比較系統(tǒng)的檢測(cè)結(jié)果無顯著性差異。3.2.2 計(jì)算hbv-dna和 hcv-rna 兩個(gè)項(xiàng)目與比較系統(tǒng)的回歸曲線，結(jié)果見圖1。3.2.3 并計(jì)算理論值在3、 4、 5、 6、 7 時(shí)的 te 與目標(biāo)te 比較。 計(jì)算 te 的結(jié)果見表3。3.3 線性范圍驗(yàn)證結(jié)果見圖2。3.4 定量檢出限驗(yàn)證結(jié)果見表4。hbv-dnahcv-rnar 值0.96850.9564廠商聲明(與標(biāo)準(zhǔn)品 )0.970.97一致性檢驗(yàn)p=0.3104p=0.6379表 2與比較系統(tǒng)相關(guān)性評(píng)價(jià)結(jié)果table 2the correlation results betwee

14、n testing methods and comparative methods理論值 (log10=)hbv-dnahcv-rna計(jì)算 te=bias+3cv計(jì)算 te=bias+3cv313.44%10.02%49.08%9.46%56.47%9.13%64.73%8.91%73.48%8.76%表 3te 的計(jì)算結(jié)果table 3the results of calculating te與目標(biāo) te（10%） 比較，0.05， 實(shí)驗(yàn)方法與比對(duì)方法之間的檢測(cè)結(jié)果沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。根據(jù)westgard 7提出的方法進(jìn)一步通過回歸曲線計(jì)算， 同時(shí)將理論值為37 的值代入后計(jì)算總誤差。從表3 可

15、以看出，除了理論值為3 時(shí)兩個(gè)項(xiàng)目的允許總誤差超過了廠方聲明的10% 的指標(biāo)外， 其余均在10% 以內(nèi)。因?yàn)閺S方聲明的允許總誤差給出的是一個(gè)平均值，并未告知具體的濃度水平，且低濃度標(biāo)本的允許誤差本身就大于高濃度水平，所以， 當(dāng)理論濃度為3 時(shí)兩個(gè)項(xiàng)目的允許誤差分別為13.44% 和 10.02%， 仍被認(rèn)為可以接受。用于線性范圍驗(yàn)證的樣本應(yīng)覆蓋檢測(cè)系統(tǒng)的整個(gè)范圍。從圖2 可以看出，兩個(gè)檢測(cè)項(xiàng)目的線性符合廠家聲明。但也有文獻(xiàn)指出，對(duì)于多點(diǎn)校準(zhǔn)的檢測(cè)項(xiàng)目， 一般不需要進(jìn)行分析測(cè)量范圍來評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)13。對(duì)于新開展的檢測(cè)系統(tǒng)含有多點(diǎn)校準(zhǔn)時(shí)是否需要線性范圍的方法學(xué)驗(yàn)證仍有待探討。定量檢出限是指能可靠檢出分

16、析物的最低實(shí)際濃度，其驗(yàn)證對(duì)于pcr 檢測(cè)項(xiàng)目非常重要。ep-17a文件指出， 驗(yàn)證廠家聲明的定量檢出限至少需25 個(gè)重復(fù)測(cè)量，每個(gè)樣品的重復(fù)檢測(cè)結(jié)果與該樣品的參考值和誤差目標(biāo)進(jìn)行比較，超過該誤差目標(biāo)的結(jié)果數(shù)是該水平方法是否合適的度量。由于許多pcr 檢測(cè)項(xiàng)目缺乏相應(yīng)的參考物質(zhì)，即使有，價(jià)格也非常昂貴， 在實(shí)際工作中， 這個(gè)驗(yàn)證方案難以實(shí)施。我們?cè)谶M(jìn)行定量檢出限驗(yàn)證時(shí)采用臨床標(biāo)本，在基于精密度、 正確度和線性范圍驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)接受的情況下，對(duì) 45 濃度的標(biāo)本進(jìn)行稀釋至有低于檢測(cè)下限的結(jié)果出現(xiàn)，以全部大于檢出限且cv在或接近廠方允許的范圍時(shí)的濃度為可接受的定量檢出限。在我們的實(shí)驗(yàn)中，hbv-dna

17、項(xiàng)目在 500 iu/ml 時(shí)全部檢出， 并且cv為 4%，因此認(rèn)為其定量檢出限和廠家聲明一致；而 hcv-rna 項(xiàng)目在500 iu/ml 時(shí)有 7 個(gè)低于檢測(cè)下限，在1000 iu/ml 時(shí)則全部檢出， 并且cv為 11%， 故認(rèn)為hcv-rna 的定量檢出限與廠家聲明的500 iu/ml 不一致， 應(yīng)為 1000 iu/ml 。綜上所述， 根據(jù)分子生物學(xué)專業(yè)的特點(diǎn)，在開展pcr 檢測(cè)項(xiàng)目前， 需對(duì)精密度、 正確度、線性范圍、 定量檢出限等方法學(xué)性能進(jìn)行驗(yàn)證，使用初始濃度值qdna轉(zhuǎn)化為對(duì)數(shù)lgq 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，同時(shí)可根據(jù)檢測(cè)項(xiàng)目的類別、是否有參考物質(zhì)等實(shí)際情況選擇驗(yàn)證方案分子診斷與治療雜志2

18、012 年 9 月第 4 卷第 5 期 j mol diagn ther, september 2012, vol. 4 no. 5324和統(tǒng)計(jì)方法， 即能滿足實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)質(zhì)量的要求，又能減少人力和財(cái)力。參考文獻(xiàn)1 department of health and human service, centers for medicare&medicaid services. clinical laboratory improvement amendments of 1988: ?nal rules. fed register, 2003: 3704.2 cnas-cl 02, 醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)

19、量和能力認(rèn)可準(zhǔn)則(iso15189) s. 2007: 22.3 畢波 , 呂元 . 定量檢測(cè)方法學(xué)性能驗(yàn)證的系統(tǒng)設(shè)計(jì)j. 中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志 , 2007, 30(2): 9-11.4 clinical and laboratory standards institute. user veri?cation of performance for precision and trueness： approved guideline-second editions. ep15-a2, clsi, 2005.5 王薇 , 王治國(guó) , 李少男 . 臨床實(shí)驗(yàn)室對(duì)廠家聲明的精密度和真實(shí)度的性能驗(yàn)證要求j.

20、 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué) , 2010, 25(12): 1001-1005.6 nccls ep9-a2. method comparison and bias estimation using patient samples; approved guideline-second editions. wayne, pa: nccls, 2002.7 westgard j o, barry p l, quam e f. basic method validation 3rd editionp: training in analytical quality management for healthcare

21、laboratoriesm. westgard quality corporation. 1999: 131.8 nccls. evaluation of the linearity of quantitative measurement procedures: a statistical approach. approved guideline nccls document ep6-as. wayne, pa: nccls, 2003.9 余男 , 甘明 , 詹希美 , 等. 乙型肝炎病毒核酸定量檢測(cè)中不確定度的研究 j. 熱帶醫(yī)學(xué)雜志 , 2007, 7(4): 310-314.10 zacher b j, moriconi f, bowden s, et al. multicenter evaluation of the elecsys hepatitis b surface an