年產(chǎn)400t中性淀粉酶的生產(chǎn)工藝設計

1、年產(chǎn)400噸中性淀粉酶生產(chǎn)工藝設計摘要：a -淀粉酶廣泛分布于動物、植物和微生物中，能水解淀粉產(chǎn)生糊精、麥芽糖、低聚 糖和葡萄糖等，是工業(yè)生產(chǎn)中應用最為廣泛的酶制劑之一。目前，a-淀粉酶已廣泛應用于變性淀粉及淀粉糖、焙烤工業(yè)、啤酒釀造、酒精工業(yè)、發(fā)酵以及紡織等許多行業(yè)。本次設計 的淀粉酶發(fā)酵廠，分別以玉米粉為碳源，以豆餅為氮源，以BF-7658枯草芽孢桿菌為生產(chǎn)菌種，采用深層發(fā)酵法，提取工藝采用鹽析法，年產(chǎn)400噸淀粉酶。做出了生產(chǎn)工藝流程圖，進展了物料衡算，設計了發(fā)酵罐和種子罐的尺寸和車間的布置和構(gòu)造，同時繪制了該廠區(qū)的總平面布置圖、帶控制點的工藝流程圖、工藝管道及儀表流程圖圖例。關鍵詞：a

2、 -淀粉酶；生產(chǎn)工藝設計；深層發(fā)酵法 1緒論1.1淀粉酶簡述淀粉酶廣泛存在于動物、植物和微生物中，在食品、發(fā)酵、紡織和造紙等工業(yè)中均有應用，尤其在淀粉加工業(yè)中，微生物淀粉酶更是應用廣泛并已成功取代了化學降解法；同時， 它們也可以應用于制藥和精細化工等行業(yè)。a -淀粉酶是淀粉及以淀粉為材料的工業(yè)生產(chǎn)中最重要的一種水解酶?，F(xiàn)在，a-淀粉酶已廣泛應用于食品、清潔劑、啤酒釀造、酒精工業(yè)、紡織退漿和造紙工業(yè)，對縮短生產(chǎn)周期， 提高產(chǎn)品得率和原料的利用率，提高產(chǎn)品質(zhì)量和節(jié)約糧食資源，都有著極其重要的作用。a-淀粉酶來源廣泛，主要存在發(fā)芽谷物的糊粉細胞中，當然，從微生物到高等動、植物均可 別離到，是一種重要

3、的淀粉水解酶，也是工業(yè)生產(chǎn)中應用最為廣泛的酶制劑之一。它可以由微生物發(fā)酵制備，也可以從動植物中提取。不同來源的a-淀粉酶的性質(zhì)有一定的區(qū)別，工業(yè)中主要應用的是真菌和細菌a-淀粉酶。目前，a-淀粉酶已廣泛應用于變性淀粉及淀粉糖、焙烤工業(yè)、啤酒釀造、酒精工業(yè)、發(fā)酵以及紡織等許多行業(yè)，是一種重要工業(yè)用酶。有 報道說明，a -淀粉酶可以幫助改善糖尿病患者的耐糖量。這一領域研究自20世紀8O年代和90年代十分活潑，但目前a -淀粉酶抑制劑的研究工作仍處于根底階段，至今仍未得到有效合理的開發(fā)應用。但是隨著科技的開展、研究的深入，a-淀粉酶將會得到更加廣泛的應用。2 a -淀粉酶的性質(zhì)2.1 a -淀粉酶的

4、構(gòu)造目前，已對很多不同種類和來源的a-淀粉酶黑曲霉、米根霉、人和豬胰腺、人唾液腺、大麥種子和地衣芽孢桿菌 ）的晶體構(gòu)造進展了 X身寸線衍射研究，并得到了高分辨率的晶 體構(gòu)造圖。研究說明所有a-淀粉酶均為分子量在 50ku左右的單體，由經(jīng)典的三個區(qū)域 （A、B、C）組成：中心區(qū)域 A由一個（3 / a ）8圓筒構(gòu)成；區(qū)域 B由一個小的B -折疊突出于B 3和 a 3之間構(gòu)成；而 C-末端球型區(qū)域 C那么由一個Greek-key基序組成，為該酶的活性部位， 負責正確識別底物并與之結(jié)合。為保持a-淀粉酶的構(gòu)造完整性和活性，至少需要一個能與之嚴密結(jié)合的Ca2+,而Cl-往往是a -淀粉酶的變構(gòu)激活因子

5、，并且在所有Cl-依賴性的a -淀粉酶中，組成催化三聯(lián)體的殘基都是嚴格保守的10。2.2 a -淀粉酶的性質(zhì)早在1967年，Jones和Varner就對小麥中a -淀粉酶的活性進展了研究11。不同來源的 a -淀粉酶的酶學和理化性質(zhì)有一定的區(qū)別，它們的性質(zhì)對在其工業(yè)應用中的應用影響也較 大，在工業(yè)生產(chǎn)中要根據(jù)需要使用適宜來源的酶，因此對淀粉酶性質(zhì)的研究也顯得比擬重要。底物特異性a -淀粉酶和其它酶類一樣，具有反響底物特異性，不同來源的淀粉酶反響底物也各不 一樣，通常a -淀粉酶顯示出對淀粉及其衍生物有最高的特異性，這些淀粉及衍生物包括支 鏈淀粉、直鏈淀粉、環(huán)糊精、糖原質(zhì)和麥芽三糖等。最適pH和

6、最適溫度反響溫度和pH對酶活力影響較大，不同來源的a-淀粉酶有各自的最適作用pH和最適作用溫度，通常在最適作用pH和最適作用溫度條件下酶相比照擬穩(wěn)定，在此條件下進展反響能最大程度地發(fā)揮酶活力，提高酶反響效率。因此，在工業(yè)應用中應了解不同的酶最適 pH和最適溫度，確定反響的最正確條件，最大限度地提高酶的使用效率是很重要的。通常情況下a -淀粉酶的最適作用 pH 一般在2到12之間變化。真菌和細菌類a -淀粉酶 的最適pH在酸性和中性圍，如芽孢桿菌a -淀粉酶的最適pH為3，堿性a -淀粉酶的最適pH 在912。另外，溫度和鈣離子對一些a-淀粉酶的最適pH有一定的影響，會改變其最適作用圍。不同微生

7、物來源的a-淀粉酶的最適作用溫度存在著較大差異，其中最適作用溫度最低的只有25 C30C，而最高的能到達 100C130C。另外，鈣離子和鈉離子對一些酶的 最適作用溫度也有一定的影響 血。金屬離子a -淀粉酶是金屬酶，很多金屬離子，特別是重金屬離子對其有抑制作用；另外，巰基，N-溴琥珀酸亞胺，p-羥基汞苯甲酸，碘乙酸，BSA EDTA和EGTA等 對a -淀粉酶也有抑制作用。a -淀粉酶中至少包含一個 Ca2+, Ca2+使酶分子保持適當?shù)臉?gòu)象，從而維持其最大的活 性和穩(wěn)定性。Ca2+對a -淀粉酶的親和能力比其它離子強，其結(jié)合鈣的數(shù)量在1到10之間。結(jié)晶頂峰淀粉酶 A(TAA包含10個Ca2

8、+,但只有一個結(jié)合很結(jié)實。通常情況下結(jié)合一個 Ca2+就足以使a -淀粉酶很穩(wěn)定。用 EDTA透析或者用電滲析可以將Ca2+從淀粉酶中除去，參加Ca2+可以激活鈣游離酶。用 Sr2+和 Mg2+代替TAA中的Ca2+在Sr2+和 Mg2+過量的情況下 也能使其結(jié)晶。參加 Sr2+、Mg2+和Ba2+離子可以激活用 EDTA失活的TAA。通常情況下， 有Ca2+存在淀粉酶的穩(wěn)定性比沒有時要好，但也有報道a -淀粉酶在Ca2+存在時會失活，而經(jīng)EDTA處理后卻保存活性，另外，有報道稱Ca2+對a -淀粉酶沒有影響。電場強度實驗結(jié)果說明，不同強度電場導致酶活性增加的效應不同，并且呈非單調(diào)性變化。 我

9、們認為，不同強度電場對酶蛋白分子的構(gòu)象產(chǎn)生了不同影響，處理酶所用的電場能量雖然缺乏以改變酶蛋白氨基酸序列，但可以改變酶蛋白的構(gòu)象占全等13用不同強度電場處理a-淀粉酶5min，處理后分別在第1天與第1O天測定電場對a -淀粉酶活性的影響。第 1天測 定結(jié)果說明，電場對酶產(chǎn)生明顯影響，而且不同強度電場對a -淀粉酶活性的影響程度不同，在0.56.0kV/ cm圍，酶活性隨場強增加呈非單調(diào)性變化，與對照組相比，變化幅度在 5.5%26.2%之間。第1O天測定，酶活性變化幅度在0.2%16.3%之間，說明電場對酶產(chǎn)生的影響經(jīng)過一定時間后趨于消失。3工藝流程設計3.1菌種的選育菌種的選育及制備菌種選擇

10、性別離的步驟一般是：含微生物材料采集標本材料的預處理菌種的別離富集培養(yǎng)菌種初選菌種復選一一性能鑒定一一菌種保藏。1含微生物材料的選擇土壤是微生物聚集最豐富的場所，菜園和農(nóng)田耕作層土壤含有豐富的有機物常以細菌和放線菌居多，由于枯草芽孢桿菌生活在中性的環(huán)境中，可以采集中性的土壤。采土時先用小鏟除去表土，取 515 c血深處的土樣，選好 35點，每點取土 10g混在一起裝入滅過菌的 牛皮紙袋，并記錄時間、地點、植被等情況。2預處理在培養(yǎng)過程中以淀粉作為唯一或主要碳源，控制pH在6.77.2。那些在所采用的條件下最適用于淀粉代的微生物最終將占優(yōu)勢，并可在淀粉瓊脂糖平板上別離到產(chǎn)生中性淀粉酶的菌株。3所

11、需菌種的純化和別離可用平板劃線法進展菌種別離。方法如下：用接種管蘸取少量經(jīng)增殖培養(yǎng)后的菌液，在含無菌固體培養(yǎng)基的平板外表上進展規(guī)那么劃線，操作時由右向左輕輕劃線，劃線時平板面與接種環(huán)成30。40°以手腕力量在平板外表輕巧滑動劃線，線條要平行密集，使兩線不能重疊，充分利用外表積，劃線時接種環(huán)不要嵌入板劃破培養(yǎng)基，密集的含菌樣品，經(jīng)過多劃線稀釋，使菌體在平板培養(yǎng)基上逐漸別離成單個菌株，經(jīng)培養(yǎng)繁殖成單個菌落， 反復進展幾次平板劃線別離，可得枯草芽孢桿菌野生菌株。4丨菌株的培養(yǎng)常用培養(yǎng)基配方：1L蒸餾水+10g蛋白胨+3g牛肉膏+1520g瓊脂+5gNaCI。本課題以麩 皮、豆餅粉作為天然培

12、養(yǎng)基，在37C保溫箱中培養(yǎng)，至培養(yǎng)基中局部出現(xiàn)成熟顏色即可進展保藏。5丨菌落的選擇初篩采用透明圈法，方法為在培養(yǎng)基里接入淀粉天青，接入含菌樣品后，可在菌落周圍 清晰地觀察到淡藍色暈環(huán)，初篩選出的微生物經(jīng)過菌株性狀試驗后已確定具有一定生產(chǎn)能力 的菌株還要進展復篩。方法：將初篩后的少數(shù)菌株接種于40 ml錐形瓶的液體培養(yǎng)基中，110次/min往復式搖床式震蕩培養(yǎng)，得到搖瓶種子。誘變育種誘變育種可以利用物理、化學因素誘導遺傳特性發(fā)生變異，再從變異群體中選擇符合人 們某種要求如高產(chǎn)的個體，進而培育成新的品種或種質(zhì)。誘變育種操作程序如下：出發(fā)菌株T純化T培養(yǎng)液T細胞或孢子懸液 T誘變劑處理T中間培養(yǎng)T平

13、板別離T初篩 T復篩T生產(chǎn)性能實驗T菌種保藏。1出發(fā)菌株的選擇由于野生型菌株生產(chǎn)性能較差，通常采用經(jīng)歷過生產(chǎn)條件考驗的菌株， 即經(jīng)過液體培養(yǎng) 的搖瓶種子，這類菌株一定的生產(chǎn)性狀， 對生產(chǎn)環(huán)境有較好的適應性， 正突變的可能性也很 大。2菌懸液的制備細菌一般要求處于對數(shù)生長中期的菌，用玻璃珠振蕩5 min，使細胞均一分散，然后用滅菌脫脂棉過濾，得到分散菌株。菌懸液的細胞濃度不宜過高，本課題中的枯草芽胞桿菌，宜將其濃度控制在108個/ml。菌懸液介質(zhì)一般用生理鹽水。3誘變劑的處理誘變劑包括物理、化學、生物誘變，在微生物誘變育種中，可用物理化學復合誘變因素處理菌種，這樣可以擴大培養(yǎng)幅度，提高誘變效果獲

14、得中性淀粉酶高產(chǎn)突變株。方法及步驟如下：吸取制備好的枯草芽孢桿菌懸液5 ml于直徑為6 cm的無菌培養(yǎng)皿中， 然后用0.5%1%的二乙酯處理30 min，處理時采用pH 7.0的磷酸緩沖液，再將磁力攪拌器于紫外燈下距 離30 cm1 min，接著在紅燈下吸取經(jīng)處理的菌液0.5 ml，稀釋至10-6，取10-610-1稀釋液滴一滴于6個平板中，10-610-1依次涂布均勻，再置暗箱與 37C培養(yǎng)48 h。注意：一般化學誘變劑均有毒性，多數(shù)還具有致癌作用， 故操作時切忌用口吸取并勿與皮膚直接接觸，做好平安工作。4突變菌株的篩選包括：瓊脂塊透明圈法初篩。方法：倒入選擇培養(yǎng)基6皿，取其中較厚的2皿，用

15、打孔器或玻璃打制圓形培養(yǎng)基 t平 移瓊脂塊至一個選擇平板上，再用接種針挑取單菌落的少量菌體分別接種于瓊脂塊中心并與 一瓊脂塊接入出發(fā)菌株作為對照t正置于37C培養(yǎng)45小時t于培養(yǎng)好的選擇平板中滴加幾滴淀粉天青，觀察到透明圈的直徑t選擇透明圈大的菌落接入斜面?zhèn)鋸秃Y用。搖瓶發(fā)酵復篩：將經(jīng)初篩處的菌株分別接入增殖培養(yǎng)基中，培養(yǎng)13小時t分別接種于錐形瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中 t置37C搖床上發(fā)酵40小時t選出酶活力較高者進一步復篩直至選出中性淀粉酶高產(chǎn)突變株。菌種的保藏菌種是從事微生物學以及生命科學研究的根本材料，特別是利用微生物進展有關生產(chǎn)， 如氨基酸、抗生素、釀造等工業(yè)，更離不開菌種。所以菌種保藏是進展微

16、生物學研究和微生物育 種工作的重要組成局部。 其任務是使菌種不死亡，同時還要盡可能設法把菌種的優(yōu)良特性保持下來而不致向壞的方面轉(zhuǎn)化。菌種保藏主要是根據(jù)菌種的生理生化特點，人工創(chuàng)造條件，使孢子或菌體的生長代活動盡量降低，以減少其變異。一般可通過保持培養(yǎng)基營養(yǎng)成分在最低水平、缺氧狀態(tài)、枯燥和低溫，使菌種處于 休眠狀態(tài)，抑制其繁殖能力。常用的菌種寶藏方法有：斜面冰箱寶 藏法、沙土管寶藏法、菌絲速凍法、石蠟油封存法、真空冷凍枯燥保藏法、液氮超低溫保藏 法。在這里我們采用沙土保藏法。方法：將需保藏的菌種經(jīng)斜面培養(yǎng)后用無菌水制成孢子 懸液，參加經(jīng)滅菌處理的沙和土的混合物或純沙亦可作為載體，減壓抽去水分，這

17、些吸 附有孢子的枯燥沙土載體，在低溫下保存。操作步驟：斜面孢子先加滅菌蒸餾水22.5ml，沿斜面輕刮孢子后，再吸0.20.3 ml到滅菌備用的沙土管中，在真空度100 Pa以下進展枯燥，直至沙土管外貌呈松散狀態(tài)，然后低溫4C保存。經(jīng)真空枯燥后的沙土管，最好放在密閉容器，容器可放入吸潮劑CaC2或硅膠等，保藏期間整個容器置于冰箱。一般保存期為一年左右。3.2培養(yǎng)基的配制培養(yǎng)基的類型培養(yǎng)基的種類很多， 可以根據(jù)組成、狀態(tài)和用途等進展分類， 按照用途可以分成孢子培 養(yǎng)基，種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基。微生物大規(guī)模發(fā)酵設計主要用到孢子，種子和發(fā)酵培養(yǎng)基這三種類型。1孢子培養(yǎng)基孢子培養(yǎng)基配制的目的是供菌體繁殖

18、孢子的，常采用的是固體培養(yǎng)基， 對這類培養(yǎng)基的要能使菌體生長快速， 產(chǎn)生數(shù)量多而優(yōu)質(zhì)的孢子， 并且不會引起菌體變異。 對孢子培養(yǎng)基的 要求：營養(yǎng)不要太豐富；所用無機鹽的濃度要適量；注意培養(yǎng)基的pH和濕度。淀粉酶的孢子培養(yǎng)基配置如下：將麩皮5%、豆餅粉3%、蛋白胨0.25%、瓊脂2%pH7.1丨制成斜面培養(yǎng)基，在 0.1MPa蒸汽滅菌20 min。2種子培養(yǎng)基種子培養(yǎng)基是供孢子發(fā)芽、生長和大量繁殖菌絲體，并使菌絲體長得粗壯成為活力強的 種子。對于種子培養(yǎng)基的營養(yǎng)要求比擬豐富和完全，氮源和維生素的含量也比擬高些，濃度以稀薄為好，可以到達較高的溶解氧，供大量菌體生長和繁殖。a -淀粉酶的種子培養(yǎng)基的

19、配置：將豆餅1%、蛋白胨和酵母膏各 0.4%、氯化鈉0.05%配置成種子培養(yǎng)基（pH 7.17.2），在O.IMPa蒸汽滅菌20 min。3發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)基的要營養(yǎng)要適當豐富和完全適合于菌種的生理特性和要求，使菌種迅速生 長、強健，能在比擬短的周期充分發(fā)揮產(chǎn)生菌合成發(fā)酵產(chǎn)物的能力，但要注意本錢和能耗。a -淀粉酶的發(fā)酵培養(yǎng)基配方是：麩皮70%、小米糠20%、木薯粉10%、燒堿0.5%,加水使水量達60%，常壓蒸汽滅菌1h。3.2.2 培 養(yǎng)基 的營養(yǎng)要求培養(yǎng)基的成分大致分為碳源、氮源、無機鹽、微量元素、特殊生長因子、促進劑、前體和水等幾大類。對不同的微生物，微生物不同的生長階段，不同的發(fā)酵

20、產(chǎn)物以及不同發(fā)酵工藝條件等，所使用的培養(yǎng)基都是不同的，這些也都是培養(yǎng)基配制需要考慮的因素。1水水是所有培養(yǎng)基的主要成分，也是微生物機體的重要組成成分。水是良好的溶劑，又是活細胞中一切代反響的媒介物，還可以維持細胞中的滲透壓，同時水又是熱的良好導體，有利于散熱，可調(diào)節(jié)細胞溫度。在中性淀粉酶的發(fā)酵生產(chǎn)中，為了防止水質(zhì)變化給生產(chǎn)帶來不良影響，發(fā)酵用水采用深井水，并定期檢查水質(zhì)，要求：pH 6.87.2，電導率 500 1500/cm總硬度 100 230 mmol/L。2）碳源碳源的主要為微生物細胞的生長繁殖提供能源。目前生產(chǎn)中性淀粉酶的菌種為異養(yǎng)型微生物，所以只能利用有機碳；大量的農(nóng)副產(chǎn)品是主要的

21、有機碳源，如山芋、麩皮、玉米、米糠、馬鈴薯、木薯、土茯苓等淀粉質(zhì)原料，這里用到的碳源是麩皮、馬鈴薯、木薯。3）氮源氮源是組成蛋白質(zhì)和核酸的主要元素，酶自身即為蛋白質(zhì)。因此，氮源是必不可少的重要原料。常用的有機氮源油花生餅粉、豆餅粉、棉籽餅粉、玉米漿、玉米蛋白粉、蛋白胨、 酵母粉等。我們用到的氮源是豆餅粉劑和蛋白胨。常用的無機氮源有銨鹽、硝酸鹽和氨水等。4）無機鹽類及微量元素酶在生長和繁殖生長過程中，需要某些無機鹽及微量元素如磷、鎂、硫、鉀、鈉、鈣、鐵、錳、鋅等。鈉離子具有控制細胞和培養(yǎng)基之間的滲透壓的作用，從而促進產(chǎn)酶，添加適量亞硝酸鈉可提高酶活力；鈣對淀粉酶有穩(wěn)定和活化作用。中性淀粉酶生產(chǎn)常

22、以氯化鈣提供鈣離子。5）生長因子和產(chǎn)酶促進劑酶的生產(chǎn)中所需的生長因子大多由天然原料提供。玉米漿、麥芽汁、豆芽汁等，都含有豐富的生長因子。 產(chǎn)酶促進劑一般是該酶的底物和底物類似物，對于中性淀粉酶，可添加適量濃度的淀粉瓊脂糖作為誘導劑。3.3工藝滅菌培養(yǎng)基的滅菌生物化學反響過程中，特別是細胞培養(yǎng)過程，往往要求在沒有雜菌污染的情況下進展，這是由于生物反響系統(tǒng)常含有比擬豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，因而很容易受到雜菌污染， 進而產(chǎn)生各種不良后果：1由于雜菌的污染，使生物化學反響的基質(zhì)或產(chǎn)物消耗，造成產(chǎn)率下降；2由于雜菌所產(chǎn)生的某些代產(chǎn)物，或染菌后發(fā)酵液的某些理化性質(zhì)的改變，使產(chǎn)物的提取變得困難，造成收得率降低或使產(chǎn)

23、品質(zhì)量下降；3污染的雜菌可能會分解產(chǎn)物而使生產(chǎn)失敗；4污染的雜菌大量繁殖， 會改變反響介質(zhì)的 pH,從而使生物化學反響發(fā)生異常變化；5發(fā)生噬菌體污染，微生物細胞被破裂而使生產(chǎn)失敗等。1）滅菌方法所謂滅菌，就是指用物理或化學方法殺滅或去除物料或設備中一切有生命物質(zhì)的過程。常用的滅菌方法有：化學滅菌、射線滅菌、干熱滅菌、濕熱滅菌和過濾滅菌等。本實驗采用濕熱滅菌。2）培養(yǎng)基的濕熱滅菌條件為在121 C表壓約O.IMPa維持30分鐘。濕熱滅菌即利用飽和水蒸氣進展滅菌，是工業(yè)中最重要的滅菌方法。在同樣的溫度下，溫熱的殺菌效果比干熱好，其原因有：蛋白質(zhì)凝固所需的溫度與其含水量有關，含水量愈大，發(fā)生凝固所需

24、的溫度愈低。濕熱滅菌中菌體蛋白質(zhì)吸收水分，較同一溫度的干熱空氣中易于凝固而殺滅各種微生物。溫熱滅菌過程中蒸氣放出大量潛熱，加速提高溫度。因而濕熱滅菌比干熱所要溫度低。如在同一溫度下，那么濕熱滅菌所需時間比干熱短。濕熱的穿透力比干熱大，使深部也能到達滅菌溫度，故濕熱比干熱收效好。一.影響滅菌效果的因素微生物的種類和數(shù)量；培養(yǎng)基性質(zhì)、濃度、成分；滅菌的溫度、時間。二熱阻：微生物對熱的阻抗能力。三.滅菌原理對數(shù)殘留定律：經(jīng)加工滅菌，死亡微生物速度和存在的微生物數(shù)量成正比。332空氣滅菌此課題為好氧發(fā)酵， 以空氣作為氧源。根據(jù)國家藥品質(zhì)量管理規(guī)的要求，生物制品、藥 品的生產(chǎn)場地業(yè)需要符合空氣干凈度的要

25、求。獲得無菌空氣的方法有：輻射滅菌、化學滅菌、加熱滅菌、靜電除菌、過濾介質(zhì)除菌等。過濾介質(zhì)除菌是目前發(fā)酵工業(yè)中空氣除菌的主要手段，其介質(zhì)有棉花過濾器、 超細玻璃纖維紙、石棉濾板、金屬燒結(jié)管等。1過濾除菌流程及設備流程如下：采風塔t空氣粗過濾器t空氣壓縮機t儲氣罐t冷卻器t旋風別離器t冷卻 器t絲網(wǎng)除沫器t空氣加熱器t總空氣過濾器。設備如下：1采風塔：采風塔建在工廠的上風頭，高至少10 m,氣流速度8 m/s。2粗過濾器：主要作用是攔截空氣中較大的灰塵以保護空氣壓縮機，同時起一定的除菌 作用，減輕總過濾器的負擔。3空氣壓縮機：作用是提供動力，以克制隨后各設備的阻力。4空氣儲罐：作用是消除壓縮空氣

26、的脈動。要求：H/B=2 2.5 V= 0.1 0.2V1其中，H為罐高；B為罐直徑；V1為空壓機每分鐘排氣量20 C, 1 X 105Pa狀況下。5. 旋風別離器：是利用離心力進展氣-固或氣-液沉降別離的設備。作用是別離空氣中被 冷卻成霧狀的較大的水霧和油霧粒子。6. 冷卻器：空壓機出口溫度氣溫在120 C左右，必須冷卻。另外在潮濕的地域和季節(jié)還 可以到達降濕的目的。7. 絲網(wǎng)除沫器：可以除去空氣中絕大多數(shù)的20 g以上的液滴和1 g以上的霧滴，一 般采用規(guī)格為直徑 0.25伽X 40孔且高度為150伽的不銹鋼絲網(wǎng)。8. 空氣加熱器：列管走空氣，管外走蒸汽?？蓪⒖諝鉂穸扔?00%降低到70%

27、以下。9. 總過濾器：填充物按下面順序安裝：孔板T鐵絲網(wǎng)T麻布T活性炭T麻布T棉花T麻布T鐵絲網(wǎng)T孔板。介質(zhì)要嚴密均勻，壓緊一致，上下棉花層厚度為總過濾層厚度的1/4 ,中間活性炭層為1/3。2無菌空氣的檢查現(xiàn)在采用的無菌檢查實驗方法有肉湯培養(yǎng)法、斜面培養(yǎng)法和雙碟培養(yǎng)法。這里采用斜面培養(yǎng)法來檢查。具體方法如下：500ml三角瓶裝斜面培養(yǎng)基50m1 ,其組成為麥芽糖6 %、豆粕水解液6 %、 Na2HPO4 12H2O 0.8%、（NH4）2SO40. 4%、CaCI2 0.2%、NH4C1 0.15%, pH 6.57.0，接種后置旋轉(zhuǎn)式搖床亡，（37土 1）C下培養(yǎng)28h左右備用。發(fā)酵罐的滅

28、菌發(fā)酵罐的滅菌可采用空罐滅菌和實罐滅菌，此處采用空罐滅菌。空罐滅菌是將所有的通氣口都稍微翻開，然后通入熱水蒸汽，讓水蒸汽盡量通過每一個菌落到達滅菌效果。具體方法是：在121 C滅菌30分鐘。3.4種子擴大培養(yǎng)本發(fā)酵屬于一級種子罐擴大培養(yǎng)，二級發(fā)酵。設計流程如下：孢子-錐形瓶-種子罐-發(fā)酵罐孢子制備將保存在淀粉瓊脂斜面上的枯草芽孢桿菌孢子用無菌水洗下，接種到錐形瓶中，在35 C靜置培養(yǎng)24天，待長出大量孢子后作為接種用的種子。種子制備將保藏的菌種接種到馬鈴薯茄子瓶斜面20%馬鈴薯煎出汁加 MgSO4 7H2O 5 mg/L ,瓊脂2%, pH 6.77.0，37C培養(yǎng)3天。然后接入到20L種子罐

29、，37C攪拌，通風培養(yǎng)12 14小時。此時菌種進入對數(shù)生長期鏡檢細胞密集，粗壯整齊，大多數(shù)細胞單獨存在，少 數(shù)呈鏈狀，發(fā)酵液 pH 6.36.8,酶活510U/mL，再接種到發(fā)酵罐。發(fā)酵罐培養(yǎng)培養(yǎng)基的配制：用麥芽糖液配置成含麥芽糖6 %、豆粕水解液6 %7 %、 Na2HPO4 12H2O 0.8%、（NH4）2SO4 0.4%、CaCI2 0.2%、NH4CI0.15%、豆油 1kg、深井水 20L,調(diào) pH 至 6.57.0。發(fā)酵罐培養(yǎng)基經(jīng)消毒滅菌冷卻后接入3%5%種子培養(yǎng)成熟液。培養(yǎng)條件為：溫度37 ± 1C,罐壓 0.5kg/ cm2，風量 1 20h 為 1： 0.48vv

30、m , 20 h 后 1: 0.67vvm，培養(yǎng)時間為 28 36 h。3.5發(fā)酵過程的工藝控制1發(fā)酵過程的補料策略中間補料是在發(fā)酵過程中補充某些營養(yǎng)物料、水或產(chǎn)酶促進劑，以滿足微生物的代活動和產(chǎn)酶的需要。a -淀粉酶生產(chǎn)中要經(jīng)常補料，用3倍年度濃度碳源的培養(yǎng)基補料，體積相當根底料的1/2，從培養(yǎng)12h開場，每小時1次，分30余次補加完畢。延長了發(fā)酵時間，提 高了酶活力和單罐產(chǎn)量。2發(fā)酵過程pH值的控制各種微生物需要在一定的 pH環(huán)境中方能正常生長繁殖。培養(yǎng)基中C/N比值高，發(fā)酵液傾向于酸性，pH偏低；C/N比值低，發(fā)酵液傾向于中性或堿性，pH偏高。a -淀粉酶最適 pH為6.87.2。因此，

31、在發(fā)酵過程中，可通過添加適量 的尿素或碳酸鈣等來調(diào)節(jié) pH上升或下降。3發(fā)酵過程溫度的控制溫度對微生物的生長、產(chǎn)物的合成和代調(diào)節(jié)有重要作用。 溫度變化一方面影響各種酶反 響的速率和蛋白的性質(zhì)，另一方面影響發(fā)酵液的物理性質(zhì)。不同的菌種有著不同的最適溫度。 枯草桿菌發(fā)酵溫度控制在 35 C37 C最適宜。4溶氧的控制a -淀粉酶發(fā)酵是需氧發(fā)酵，無論是基質(zhì)的氧化，菌體的生長還是產(chǎn)物的合成均需大量 的氧氣。假設發(fā)酵液中氧氣缺乏，可通過加大通氣量，適當降低溫度，提高罐壓，補水，提高攪拌速度來控制。a-淀粉酶發(fā)酵過程中，012 h通氣量為1 : 0.67 vvm , 12 h至發(fā)酵完畢通氣量為1: 1.0

32、1.33 vvm 攪拌轉(zhuǎn)速200r/min。 罐壓0.5kg/cm2。5染菌的控制在工業(yè)發(fā)酵中，染菌輕那么影響產(chǎn)品的質(zhì)和量、重那么倒罐或停產(chǎn)、影響工廠效益。因 此要嚴格無菌操作，種子滅菌要徹底，凈化空氣設備，操作要慎重，設備滅菌要徹底。假設 在前期染菌，應重新滅菌；中期染菌，應偏離雜菌生長條件；后期染菌，可提前或及時放罐?？赡艹霈F(xiàn)的異常發(fā)酵現(xiàn)象：1培養(yǎng)基變?。嚎赡苁鞘删w污染或營養(yǎng)成分缺乏；2培養(yǎng)基過濃：會抑制微生物的生長，考慮可能是污水污染；3耗糖較慢：可能原因是種子生長能力降低，檢測種子是否衰退，發(fā)酵條件是否適宜，以及營養(yǎng)成分是否全面，尤其注意缺磷；4. pH值不正常： 用緩沖對來調(diào)節(jié)，檢

33、查是否染雜菌，碳氮比是否適宜；5. 生長緩慢：最可能的原因就是營養(yǎng)成分缺乏。3.6下游加工下游加工過程是生物工程的一個組成局部，是生物化工產(chǎn)品通過微生物發(fā)酵過程、酶反響過程或動植物細胞大量培養(yǎng)獲得，以上述發(fā)酵、反響液或培養(yǎng)液別離、精制有關產(chǎn)品的過程。下游加工過程的一般工藝流程為：固體t細胞破碎t別離I發(fā)酵液預處理固液別離 品加工1發(fā)酵液的過濾和預處理預處理就是除去高價離子和蛋白質(zhì)，對高價離子的去除可以采用草酸或磷酸，草酸它與鈣離子生成的草酸鈣， 還能促使蛋白質(zhì)沉淀，加磷酸既能降低鈣離子也能降低鎂離子。對于蛋白質(zhì)的沉淀可以參加絮凝劑，調(diào)節(jié)pH值或加熱。過濾：采用鼓式真空過濾器，過濾前加去乳化劑并

34、降溫。2提取a -淀粉酶常用的提取方法有：鹽析法、乙醇淀粉吸附法和噴霧枯燥法，這里用鹽析法。具體方法：發(fā)酵液經(jīng)熱處理，冷卻到40 C,參加硅藻土為助濾劑過濾。 濾餅加2.5倍水洗滌， 洗液同發(fā)酵液合并后，在45 C真空濃縮數(shù)倍后，加（NH4）2SO4至40%飽和度。鹽析沉淀物加硅藻土后過濾，濾餅于 40 C烘干磨粉即成粗酶制品。由酶液到粉狀制酶劑的收率為70%。成品固體酶制劑的枯燥方法有烘房、氣流枯燥、噴霧枯燥、沸騰枯燥、振動枯燥和真空冷凍枯燥。由于噴霧枯燥生產(chǎn)能力大，維修保養(yǎng)簡單，因此生產(chǎn)中常采用這種方法。3純化a -淀粉酶的純化方法可采用凝膠過濾法，就是以特定的凝膠物質(zhì)為分子篩裝入層析柱，

35、再通過別離溶液時大于凝膠孔徑的分子會被排阻在膠粒外，因此它們將“繞道通過；小于該孔徑的分子，由于可以自由出入膠粒外，因此將沿著膠粒縫隙而直接流出。通過一段程度的凝膠層析柱后，大小分子將依次先后流出。4、枯草芽孢桿菌生產(chǎn)發(fā)酵a -淀粉酶工藝總流程圖孢子斜面孢子懸浮液種子罐發(fā)酵罐-補料罐熱處理粗濾鹽析壓濾JJ枯燥噴霧枯燥粉碎Jj填充劑混粉5.1發(fā)酵罐的設計發(fā)酵罐的構(gòu)造通用發(fā)酵罐的主要組成部件有：1罐體：是發(fā)酵罐的主要構(gòu)造，其壁有擋板，作用是防止液中心產(chǎn)生漩渦，一般用35塊擋板。2攪拌裝置：主要功能是使罐物料混合均勻，攪拌器葉輪多米用攪拌渦輪式，攪拌軸要與罐體密封嚴實，防止漏液和染菌。攪拌轉(zhuǎn)速為20

36、0r/mi n.3傳熱裝置：有夾套，列管等，這里米用外夾套。4通氣局部：通過空氣分布器將通入的無菌空氣均勻分布到發(fā)酵液中，發(fā)酵罐通風量012 h為1 : 0.67vvm ,12 h至發(fā)酵完畢通風量為 1 : 1.01.33vvm。分布器有單管式和環(huán)形管式。5消泡裝置：用于消除產(chǎn)生的泡沫，最簡單實用的消泡裝置是耙式消泡器，直接裝在攪拌軸上。6進出料口：罐頂設有進料口，罐底有出料口。其他附屬設備還包括試鏡、 人孔手孔、取樣管等，用以觀測和檢修。發(fā)酵罐的工藝尺寸常用的機械通風發(fā)酵罐的構(gòu)造和主要幾何尺寸標準化設計見附圖其幾何尺寸比例如下：Ho/D=1.7 3.5H/D=2 5 d/D=1/31/2 W

37、/D=1/12 1/8 B/D=0.8 1.0 (S/d)2=1 2 (2 表示攪拌器擋數(shù))h/D=1/4單位全部為m發(fā)酵罐大小用公稱體積表示，Vo=nD2X H+0.15D3其中：Ho-發(fā)酵罐圓柱形筒身高度D-發(fā)酵罐徑H-罐頂?shù)焦薜椎母叨萪-攪拌器直徑W-擋板寬度B-下攪拌器距罐底的距離S攪拌器間距h-底封頭或頂封頭高度計算：年產(chǎn)量為400噸，中性淀粉酶產(chǎn)量為 35g/L, 年有300個工作日 發(fā)酵周期為48小時， 即2天，清理發(fā)酵罐1天，對淀粉的轉(zhuǎn)化率為 42%，預處理收率85%，提取率為70%,發(fā)酵 罐個數(shù)為3個，裝料系數(shù)為0.75, V。是公稱容積，指筒身容積與底封頭容積之和，那么：

38、發(fā)酵罐體積為：V0=400 X 10005/ 300/3/42%x 85%X 70%0.75=203.3m3可以取V0=200m3由：V0=nD2X h4+0.15D3=H3D3/4+0.15 D3=200m3H=3D得：D=4.31 m那么：H0=2.5D=2.5 X 4.31=10.78mH=3D=3X 4.31=12.93md=D/2=0.5 X 4.31 =2.16mW=D/12=4.31/12=0.36mB=0.9D=0.9 X 4.31 =3.88 m S=2D=2X 4.31 =8.62 m h=D/4=4.31 /4=1.08m液面高度 HL=0.75(H+h)=0.75X (

39、12.93+1.08)=10.51 m物料衡算本系統(tǒng)采用3個發(fā)酵罐，每個為200m3,中性淀粉酶產(chǎn)量為35g/L,對糖的轉(zhuǎn)化率為42%, 提取率為70%,裝料系數(shù)為0.75，那么： 每個發(fā)酵罐在一個發(fā)酵周期中性淀粉酶產(chǎn)量為：200 X 35 X 42%X 70%X 0.75 =154対那么3個發(fā)酵罐1年的總產(chǎn)量為：1543.5 X 3003X 3 = 463050 kg= 463.05 噸故符合年產(chǎn)量為400噸的生產(chǎn)要求。發(fā)酵罐攪拌器的設計機械攪拌通風發(fā)酵罐的攪拌渦輪有三種型式，可根據(jù)發(fā)酵特點、基質(zhì)及菌體特征選用。 由于淀粉酶發(fā)酵過程中有中間補料操作，對混合要求比擬高，因此選用六彎葉渦輪攪拌器

40、。該攪拌器的各部尺寸與罐徑D有一定比例關系：攪拌器葉徑=1.45m 取 d=1.5m葉寬 B=0.2d=0.2X 1.5=0.3m弧長 l=0.375d=0.56m底距=1.5m盤徑 di=0.75d=0.75 X 1.5=1.13m葉弦長 L=0.25d=0.25 X 1.5=0.38m葉距 Y=D=4.31m彎葉板厚3 =12mm取兩板攪拌，攪拌轉(zhuǎn)速N2可根據(jù)50m3罐，攪拌器直徑1.05m，轉(zhuǎn)速Ni=ii0r/min，以等P0/V為基準放大求得：=87r/ min5.2種子罐的設計二級種子罐數(shù)量和尺寸確實定1種子罐與發(fā)酵罐對應上料，發(fā)酵罐平均每天上2罐，所以需要二級種子罐2個。種子培養(yǎng)1

41、4h左右，輔助操作時間6h,生產(chǎn)周期大約為 20h，所以2個二級種子罐能滿足實際生產(chǎn)需求。2種子罐尺寸確實定按接種量5%計，每日所需的種子液量為：200 X 3%=6.0m3所需種子罐的容積為 6.0十0.75十2=4.0m3所以選擇公稱容積為 5m3的通風攪拌橢圓蓋發(fā)酵罐。取徑高比為H:D=2:1，那么種子罐的總?cè)莘e為V全=2筒+2V封V 全=5.0D=1.4m取 D=1.5m，那么 H=2D=3m查表可得，封頭高H 封=ha+hb=375+25=400mm封頭容積V封=0.487m3全容積V全=6.27m3設計符合要求5.2.2 一級種子罐數(shù)量和尺寸確實定125.3設備一覽表通過設備工藝流程和設計計算，可列出淀粉酶生產(chǎn)所需所有設備如表5-1表5-1 1000t/a淀粉酶生產(chǎn)發(fā)酵車間設備一覽表序號設備名稱臺數(shù)規(guī)格與型號1發(fā)酵罐3公稱容積 200 m3, 0 4310mm2二級種子罐2公稱容積5 m3, 0 1500mm3種子罐分過濾器20 40mm4發(fā)酵罐分過濾器30 300mm5連消塔10 350 X 2600mm6維持塔1V=4 m37噴淋冷卻器1F=171.9 m28螺旋板換熱器1F=20 m29預處理罐