二氧化氮與缺血性腦中風(fēng)和血管性癡呆的相關(guān)性及其分子機(jī)制研究

1、二氧化氮與缺血性腦中風(fēng)和血管性癡呆的相關(guān)性及其分子機(jī)制研究【摘要】：NO2作為NOx的主要成分,是目前世界各國尤其是發(fā)達(dá)地區(qū)的主要大氣污染物,和TSP、PM10、SO2等一同被列為各國大氣環(huán)境質(zhì)量監(jiān)測和控制的重要對象。室外大氣NO2主要來源于煤炭燃燒和汽車尾氣排放,室內(nèi)NO2主要來源于燃煤灶、燃?xì)庠钍褂煤统闊煹?許多職業(yè)場所包括用乙炔吹管焊接、電鍍、會屬清洗、采礦、染料制造、油漆以及公共場所如車庫、渡輪和滑雪場中也可接觸到高濃度N02。室外交通擁擠路段N02濃度一般不超過0.2ppm,室內(nèi)則可高達(dá)2ppm,在職業(yè)暴露場所甚至?xí)_(dá)到4ppm。因此,N02所引發(fā)的健康問題成為了國際共同關(guān)注的焦點(diǎn)話

2、題。文獻(xiàn)提示,NO2由口鼻進(jìn)入體內(nèi)時(shí)可通過腐蝕和刺激作用損害呼吸道深部細(xì)支氣管及肺泡,故而,人們對NO2污染誘導(dǎo)呼吸系統(tǒng)損傷進(jìn)而誘發(fā)相關(guān)疾病的效應(yīng)給予了大量的關(guān)注,卻忽視了它對其它組織系統(tǒng)的影響。近年來,關(guān)于NO2誘導(dǎo)各類疾病病死率上升的流行病學(xué)數(shù)據(jù)大量涌現(xiàn),特別是有學(xué)者指出,NO2會影響心腦血管系統(tǒng)和神經(jīng)功能,并提示肺和支氣管不是NO2毒性作用的唯一靶器官。因此在第一部分實(shí)驗(yàn)中,我們首先對正常大鼠進(jìn)行了不同濃度(O、5、10和20mg/m3)NO2的吸入染毒處理,進(jìn)而從氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)和細(xì)胞凋亡等多個(gè)角度考察了NO2對心腦組織的毒性作用。其中,組織病理損傷采用常規(guī)HE染色技術(shù),而細(xì)胞凋亡則

3、通過TUNEL標(biāo)記法進(jìn)行定量檢測；抗氧化酶Cu/Zn-SOD、Mn-SOD和GPx的活性及NO和氧化產(chǎn)物MDA含量檢測采用試劑盒法,PCO含量檢測采用DNPH比色法；炎性因子TNF-和IL-1水平檢測采用Elisa試劑盒法；即早和凋亡相關(guān)基因mRNA的表達(dá)檢測采用實(shí)時(shí)定量RT-PCR技術(shù)。結(jié)果,在心肌組織中發(fā)現(xiàn),NO2吸入可引起心肌組織的輕度病理學(xué)損傷,表現(xiàn)為心肌纖維排列紊亂,間隙變寬,心肌細(xì)胞收縮,染色質(zhì)崩解團(tuán)塊,細(xì)胞核腫脹或收縮,并伴隨濃度依賴性的炎性浸潤。NO2吸入可促進(jìn)或抑制抗氧化物酶的活性,促進(jìn)氧化產(chǎn)物的形成；上調(diào)炎性因子TNF-和IL-1p的表達(dá)與活性；上調(diào)凋亡相關(guān)基因p53的表達(dá)

4、及bax與bcl-2的比值,導(dǎo)致細(xì)胞凋亡數(shù)目增加。與此同時(shí),在大腦組織中檢測到了與心肌組織中相類似的毒性損傷表現(xiàn),包括組織病理損傷、細(xì)胞凋亡數(shù)量增加、抗氧化系統(tǒng)失調(diào)(Cu/Zn-SOD、Mn-SOD、GPx和NO活性及PCO含量)、即早基因(c-fos、c-jun)和凋亡基因(p53、bax和bcl-2)表達(dá)改變等多個(gè)方面。以上研究充分說明NO2吸入暴露可引起心肌和大腦毒性損傷,這可能會導(dǎo)致心腦血.管系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)疾病易感性的增加。缺血性中風(fēng)是當(dāng)今社會導(dǎo)致人類死亡的第二大疾病,也是世界上致殘性最強(qiáng)的疾病,其發(fā)病率極高,每年影響大約0.2%的人群的生命健康。在中國,缺血性中風(fēng)每年以約9%的速度在

5、增長。在美國,缺血性中風(fēng)趨于年輕化,近十年5-44歲之間人群該病的發(fā)病率增長了近3倍之多。令人擔(dān)憂的是,到目前為止,關(guān)于誘導(dǎo)缺血性中風(fēng)發(fā)生的致病因子還未被完全揭示,也尚未找到對該疾病病死率進(jìn)行控制的有效措施。近十年來,越來越多的流行病學(xué)調(diào)查報(bào)道,戶外大氣污染與中風(fēng)的病死率相關(guān),其效應(yīng)污染物主要包括NO2、SO2、O3、CO和PM10等。不僅如此,更有學(xué)者發(fā)現(xiàn)N02可影響缺血性中風(fēng)的發(fā)展結(jié)局,導(dǎo)致患者的早期死亡。然而,流行病學(xué)結(jié)果受樣本量、調(diào)查范圍和評定方法等方面的局限,且混雜因素較多,使得其結(jié)果可靠性較低,無法給出定性而統(tǒng)一的結(jié)論,更不能闡明相關(guān)分子機(jī)制。因此,在上一部分內(nèi)容的基礎(chǔ)上,我們重點(diǎn)

6、探討了N02與缺血性中風(fēng)發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性。血液流變學(xué)指標(biāo)的檢測采用宏潤達(dá)YDA-IV全自動(dòng)血液流變儀和旋轉(zhuǎn)粘度儀進(jìn)行測定；缺血性中風(fēng)模型制備采用可逆性大腦中動(dòng)脈閉塞(MCAO)線栓法；神經(jīng)功能檢測采用癥狀評分法；缺血局灶采用TTC染色法；組織病理和細(xì)胞凋亡分別采用HE和TUNEL法。結(jié)果發(fā)現(xiàn),N02長期低濃度(5mg/m3)吸入可引起健康大鼠血液黏度,紅細(xì)胞聚集指數(shù)、電泳指數(shù)和剛性指數(shù)等指標(biāo)的上升,這一現(xiàn)象類似于缺血性中風(fēng)患者的血液流變學(xué)特征。與此同時(shí),我們建立了大鼠缺血中風(fēng)模型并對其進(jìn)行相同濃度的N02暴露,為期一周,結(jié)果發(fā)現(xiàn),N02可時(shí)間依賴性地抑制MCAO大鼠神經(jīng)結(jié)構(gòu)和功能的恢復(fù),加重M

7、CAO引起的組織病理損傷和細(xì)胞凋亡。通過以上研究,我們證實(shí)了N02暴露誘導(dǎo)缺血性中風(fēng)發(fā)生發(fā)展的效應(yīng)。內(nèi)皮和炎性反應(yīng)是缺血性中風(fēng)發(fā)生發(fā)展過程中的兩大主要病理機(jī)制。為了進(jìn)一步闡明N02暴露誘導(dǎo)缺血性中風(fēng)發(fā)生發(fā)展的具體分子機(jī)制,我們對Wistar大鼠進(jìn)行了不同濃度N02的吸入染毒處理并考察了中風(fēng)相關(guān)內(nèi)皮和炎癥因子的表達(dá)情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn),N02吸入可誘導(dǎo)大腦皮層內(nèi)皮收縮因子ET-1、誘生型一氧化氮合酶iNOS、環(huán)氧化酶COX-2和細(xì)胞間黏附分子ICAM-1等因子mRNA和蛋白的表達(dá)而抑制內(nèi)皮型一氧化氮合酶eNOS和腦型一氧化氮合酶nNOS的表達(dá)。在此基礎(chǔ)上,我們又考察和比對了MCAO中風(fēng)模型大鼠N02暴

8、露前后大腦皮層以上因子的表達(dá)變化情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)MCAO處理同樣引起了大鼠大腦皮層的內(nèi)皮功能失調(diào)和炎癥反應(yīng),而N02暴露會進(jìn)一步加劇該損傷過程。本部分內(nèi)容中中風(fēng)相關(guān)因子mRNA和蛋白的表達(dá)分別采用了RT-PCR和Westernblot技術(shù),研究結(jié)果提示N02吸入通過內(nèi)皮和炎性機(jī)制誘導(dǎo)了缺血性中風(fēng)的發(fā)生發(fā)展,即：一方面打破內(nèi)皮收縮因子的拮抗平衡,引起腦部血流減少,進(jìn)而造成缺血損傷；另一方面誘導(dǎo)I1-1p、TNF-的釋放和iNOS、COX-2、ICAM-1的過表達(dá),促進(jìn)血液中炎性細(xì)胞的黏附和浸潤,進(jìn)而引起血液凝固,促進(jìn)血栓形成,最終影響腦部血液供應(yīng),造成神經(jīng)元凋亡和壞死。為了驗(yàn)證以上結(jié)果,我們又對健

9、康大鼠進(jìn)行了長時(shí)間的暴露染毒,發(fā)現(xiàn)eNOS、COX-2和ICAM-1在長期暴露后表達(dá)趨勢與短期暴露結(jié)果相吻合,提示其可作為指示N02誘導(dǎo)缺血性中風(fēng)效應(yīng)發(fā)生的生物標(biāo)記。血管性癡呆是指因各種腦血管疾病,尤其是腦缺血等引起的腦功能障礙而造成的獲得性智能障礙綜合征,是缺血性中風(fēng)的主要并發(fā)癥或后遺癥。我們的研究發(fā)現(xiàn),N02吸入暴露引起了中風(fēng)模型大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)的推遲,在一定程度上提示N02可能會增加血管性癡呆發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。然而,到目前為止,該效應(yīng)還未被闡明,相關(guān)分子機(jī)制則更不清楚。由于突觸可塑性是大腦進(jìn)行正常功能活動(dòng)的分子細(xì)胞學(xué)機(jī)制和神經(jīng)系統(tǒng)生長發(fā)育、神經(jīng)損傷修復(fù)以及學(xué)習(xí)記憶的神經(jīng)生物學(xué)基礎(chǔ),因此在本研究

10、中將突觸可塑性變化作為切入點(diǎn)來研究N02增加血管性癡呆患病風(fēng)險(xiǎn)的效應(yīng)及其可能的分子機(jī)制。電鏡觀察結(jié)果顯示,5mg/m3的N02吸入暴露不僅會加重缺血性中風(fēng)模型大鼠大腦海馬區(qū)神經(jīng)元和突觸的超微結(jié)構(gòu)損傷,同時(shí)會誘導(dǎo)健康大鼠的神經(jīng)元損傷效應(yīng)。與此同時(shí)的WesternBlot實(shí)驗(yàn)證明,N02吸入抑制了中風(fēng)模型大鼠突觸結(jié)構(gòu)可塑性標(biāo)記分子SYP和PSD-95的表達(dá),以及突觸功能可塑性LTP過程中關(guān)鍵調(diào)控因子蛋白的表達(dá)。與此相反,在健康大鼠中N02吸入?yún)s誘導(dǎo)了以上絕大部分蛋白的表達(dá)上調(diào),并呈現(xiàn)出一定的濃度依賴性。以上結(jié)果提示,NO2吸入暴露會通過誘導(dǎo)健康大鼠的神經(jīng)興奮性毒性和降低中風(fēng)模型大鼠的突觸可塑性增加

11、血管性癡呆發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。本課題實(shí)驗(yàn)結(jié)果揭示了N02對心臟和大腦組織的損傷效應(yīng),其分子機(jī)制與NO2對組織細(xì)胞的氧化作用有關(guān),通過刺激炎癥反應(yīng)最終導(dǎo)致細(xì)胞的大量死亡,為肺以外其它組織中N02的毒性效應(yīng)研究提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)；闡明了N02與缺血性中風(fēng)發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性及其分子機(jī)制,建立了進(jìn)行檢測和危險(xiǎn)度評價(jià)的生物標(biāo)記；探討了NO2與血管性癡呆發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性及其突觸機(jī)制,為污染事件發(fā)生時(shí)的臨床治療提供理論依據(jù)?！娟P(guān)鍵詞】：二氧化氮(NO_2)缺血性腦中風(fēng)血管性癡呆氧化應(yīng)激炎癥反應(yīng)細(xì)胞凋亡內(nèi)皮損傷突觸可塑性興奮性毒性【學(xué)位授予單位】：山西大學(xué)【學(xué)位級別】：博士【學(xué)位授予年份】：2013【分類號】：R74

12、1.02;X511【目錄】：中文摘要12-15ABSTRACT15-20第一章文獻(xiàn)綜述20-391.1二氧化氮(NO_2)污染現(xiàn)狀及健康效應(yīng)研究進(jìn)展20-271.1.1大氣NO_2的污染現(xiàn)狀20-221.1.2NO_2暴露與呼吸系統(tǒng)疾病的相關(guān)性及其毒理學(xué)效應(yīng)22-241.1.3NO_2暴露與心腦血管系統(tǒng)疾病的相關(guān)性及其毒理學(xué)效應(yīng)24-261.1.4NO_2暴露誘導(dǎo)神經(jīng)功能損傷的效應(yīng)研究26-271.2心肌和大腦組織損傷的常見病理生理機(jī)制27-351.2.1自由基與氧化應(yīng)激27-281.2.2炎癥反應(yīng)28-301.2.3細(xì)胞凋亡30-321.2.4內(nèi)皮損傷321.2.5興奮性毒性32-331.2

13、.6突觸可塑性33-351.3缺血性腦中風(fēng)和血管性癡呆的病理特征及其分子調(diào)控機(jī)制35-361.3.1缺血性腦中風(fēng)351.3.2血管性癡呆35-361.4課題的提出及意義36-39第二章NO_2對大鼠心腦系統(tǒng)損傷的效應(yīng)39-572.1前言392.2材料與方法39-442.2.1主要試劑與儀器40-412.2.2實(shí)驗(yàn)大鼠NO_2動(dòng)態(tài)吸入染毒處理412.2.3組織病理學(xué)HE檢測412.2.4生化因子SOD、GSH-PX、MDA和NO檢測412.2.5蛋白羰基PCO含量測定41-422.2.6炎性因子的ELISA檢測422.2.7基因mRNA表達(dá)水平的測定42-442.2.8免疫組化測定神經(jīng)元凋亡44

14、2.2.9統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)分析442.3結(jié)果44-542.3.1NO_2吸入對心肌組織的損傷效應(yīng)44-492.3.2NO_2吸入對大腦組織的損傷效應(yīng)49-542.4討論與結(jié)論54-57第三章NO_2與缺血性腦中風(fēng)發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性57-663.1前言573.2材料與方法57-613.2.1主要試劑與儀器57-583.2.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物NO_2動(dòng)態(tài)吸入染毒處理583.2.3血液流變學(xué)檢測583.2.4局灶性腦缺血再灌注模型(MCAO)制備58-593.2.5神經(jīng)功能缺失體征評分59-603.2.6缺血局灶體積測定603.2.7HE和TUNEL檢測603.2.8統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)處理60-613.3結(jié)果與分析61-6

15、43.3.1NO_2吸入暴露對健康大鼠血液流變學(xué)的影響61-623.3.2NO_2吸入暴露對缺血中風(fēng)模型大鼠大腦壞死局灶和神經(jīng)功能恢復(fù)的影響62-633.3.3NO_2吸入暴露對缺血中風(fēng)模型大鼠大腦皮層病理損傷和細(xì)胞凋亡的影響63-643.4討論與結(jié)論64-66第四章NO_2誘導(dǎo)缺血性腦中風(fēng)發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制66-804.1前言664.2材料與方法66-704.2.1主要試劑與儀器66-684.2.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物NO_2動(dòng)態(tài)吸入染毒處理684.2.3局灶性腦缺血再灌注模型(MCAO)制備684.2.4實(shí)時(shí)定量RT-PCR測定mRNA表達(dá)水平68-694.2.5Westernblot方法測定目的蛋白

16、的表達(dá)69-704.2.6統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)處理704.3結(jié)果與分析70-754.3.1NO_2吸入暴露對健康大鼠心肌組織中缺血性中風(fēng)相關(guān)因子表達(dá)的影響70-714.3.2NO_2吸入暴露對健康大鼠大腦組織中缺血性中風(fēng)相關(guān)因子表達(dá)的影響71-754.3.3NO_2吸入暴露對缺血中風(fēng)模型大鼠大腦組織中缺血性中風(fēng)相關(guān)因子表達(dá)的影響754.3.4NO_2誘導(dǎo)缺血性中風(fēng)發(fā)生發(fā)展的分子標(biāo)記754.4討論與結(jié)論75-80第五章NO_2吸入暴露與血管性癡呆的相關(guān)性及其分子機(jī)制80-905.1前言805.2材料與方法80-825.2.1主要試劑與儀器80-815.2.2局灶性腦缺血再灌注模型(MCAO)制備815.2.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物NO_2動(dòng)態(tài)吸入染毒處理815.2.4突觸超微結(jié)構(gòu)觀察81-825.2.5Westernblot方法測定目的蛋白的表達(dá)825.2.6統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)處理825.3結(jié)果與分析82-875.3.1NO_2吸入對健康成年大鼠和缺血性中風(fēng)大鼠海馬組織超微結(jié)構(gòu)的影響82-845.3.2NO_2吸入對健康成年大鼠和缺血性中風(fēng)大鼠海馬突觸結(jié)構(gòu)可塑性的影響845.3.3NO_2吸入對健康成年大鼠和缺血性中風(fēng)大鼠海馬突觸功能可塑性的影響84