駱丹電子版PPT課件

1、 空白組1 UVA1 UVA組 8-MOP+UVA8-MOP+UVA組空白組 UVA 8-MOP+UVA UVA 8-MOP+UVA 8-MOP+UVA 第1頁/共25頁8-MOP+UVA組細(xì)胞出現(xiàn)了明顯的細(xì)胞衰老改變組細(xì)胞出現(xiàn)了明顯的細(xì)胞衰老改變: :胞漿中可見較多空泡，細(xì)胞核中可見較多胞漿中可見較多空泡，細(xì)胞核中可見較多絮狀物絮狀物, ,核仁不清晰，局部出現(xiàn)核膜內(nèi)褶核仁不清晰，局部出現(xiàn)核膜內(nèi)褶, ,核內(nèi)染色質(zhì)凝集且分布不均。線粒體腫脹、粗面核內(nèi)染色質(zhì)凝集且分布不均。線粒體腫脹、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張, ,脫顆粒，可見較多次級溶酶體脫顆粒，可見較多次級溶酶體。 第2頁/共25頁光老化中紫外

2、線引起的基因的氧化應(yīng)激損傷，大部分情光老化中紫外線引起的基因的氧化應(yīng)激損傷，大部分情況下發(fā)生在鳥嘌呤殘基；端粒的重復(fù)序列況下發(fā)生在鳥嘌呤殘基；端粒的重復(fù)序列TTAGGG二二分之一是鳥嘌呤殘基且分之一是鳥嘌呤殘基且3 3末端也富含鳥嘌呤。末端也富含鳥嘌呤。第3頁/共25頁臨床上光療法（治銀屑病、臨床上光療法（治銀屑病、白癜風(fēng)）的主要副作用之一是皮膚易出現(xiàn)光老化外觀白癜風(fēng)）的主要副作用之一是皮膚易出現(xiàn)光老化外觀已聯(lián)合利用已聯(lián)合利用8-MOP+ UVA建立小鼠皮膚建立小鼠皮膚光老化模型，光老化模型， 在此基礎(chǔ)上利用人皮膚成纖維細(xì)胞經(jīng)相同處在此基礎(chǔ)上利用人皮膚成纖維細(xì)胞經(jīng)相同處理建立體外光老化模型理建

3、立體外光老化模型參與紫外線輻射引起的光老化？參與紫外線輻射引起的光老化？.光老化進程中光損傷是如何加快端?？s短的？光老化進程中光損傷是如何加快端?？s短的？第4頁/共25頁MTT法檢測法檢測細(xì)胞活性繪制細(xì)胞活性繪制細(xì)胞生長抑制細(xì)胞生長抑制曲線曲線流式細(xì)胞術(shù)流式細(xì)胞術(shù)檢測檢測細(xì)胞細(xì)胞周期分布周期分布透射電鏡透射電鏡觀察細(xì)胞觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)超微結(jié)構(gòu)細(xì)胞化學(xué)酶細(xì)胞化學(xué)酶法檢測法檢測-半半乳糖苷酶乳糖苷酶 處理后24h，48h, 72h, 7d分光光度法分光光度法檢測細(xì)胞內(nèi)檢測細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激損傷氧化應(yīng)激損傷水平水平 ：MDA,SOD及T-AOC免疫熒光檢測免疫熒光檢測細(xì)胞內(nèi)氧化細(xì)胞內(nèi)氧化光產(chǎn)物光產(chǎn)物8-

4、oxo-dGReal-Time PCR檢測端檢測端粒的相對長粒的相對長度：度：T/SWestern Blot檢測細(xì)胞老化檢測細(xì)胞老化相關(guān)蛋白相關(guān)蛋白P53, P21WAF-1及及 P16INK-4a 第5頁/共25頁 對照組對照組 8-MOP組組 UVA組組 8-MOP+UVA組組照光后照光后24h24h、48h48h、72h72h及及7d7d后后8-MOP+UVA聯(lián)合處理組聯(lián)合處理組SA-Gal陽性細(xì)胞比例較對照組均明顯增高（陽性細(xì)胞比例較對照組均明顯增高（* *P0.01P0.01），），且隨時間積累而逐漸增高（且隨時間積累而逐漸增高（r r=0.988)=0.988)。結(jié)論： 8-MOP

5、+UVA聯(lián)合作用可使皮膚FB出現(xiàn)光老化生物學(xué)特性改變SA-Gal第6頁/共25頁 *8-MOP+UVA組組8-oxo-dG陽性陽性細(xì)胞核比例明顯高于對照組細(xì)胞核比例明顯高于對照組（*P0.01 ）；UVA組組8-oxo-dG陽性細(xì)胞核比例也明顯陽性細(xì)胞核比例也明顯高于對照組高于對照組（*P0.05 ） 第7頁/共25頁8-MOP+UVA聯(lián)合處理組端粒相對長度明顯短于對照組聯(lián)合處理組端粒相對長度明顯短于對照組（2.570.05 vs 6.630.12，P0.01）UVA照射組照射組（4.590.07 vs 6.630.12, ）8-MOP+UVA聯(lián)合聯(lián)合處理組處理組（2.570.05 vs 4.

6、590.07）端粒相對長度端粒相對長度經(jīng)經(jīng)t t檢驗比較檢驗比較均均短于對照組（短于對照組（P0.05） *第8頁/共25頁各組老化相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較 8-MOP+UVA聯(lián)合處理組聯(lián)合處理組P53, P21WAF-1 及及 P16INK-4a蛋白蛋白表達(dá)水平明顯高于對照組（表達(dá)水平明顯高于對照組（P P值均值均0.010.01），而），而UVAUVA輻射組相關(guān)輻射組相關(guān)蛋白水平也有明顯增高（蛋白水平也有明顯增高（P P值均值均0.050.05），），8-MOP+UVA聯(lián)合處聯(lián)合處理組及理組及UVA照射組兩組間經(jīng)照射組兩組間經(jīng)t t檢驗比較，前者相應(yīng)蛋白表達(dá)水檢驗比較，前者相應(yīng)蛋白表達(dá)水平均高

7、于后者（平均高于后者（P P值均值均0.050.05）。）。第9頁/共25頁在在UVA照射下，外源性光敏劑照射下，外源性光敏劑8-MOP使細(xì)胞的基因氧化應(yīng)激損使細(xì)胞的基因氧化應(yīng)激損傷顯著加重，產(chǎn)生大量氧化光產(chǎn)物傷顯著加重，產(chǎn)生大量氧化光產(chǎn)物8-oxo-dG ；oxodeoxyguanosine 8-MOP+UVA聯(lián)合作用后，細(xì)胞端粒結(jié)構(gòu)上由于較多氧化光產(chǎn)聯(lián)合作用后，細(xì)胞端粒結(jié)構(gòu)上由于較多氧化光產(chǎn)物的產(chǎn)生，使其端?？s加速，提前到達(dá)臨界長度；物的產(chǎn)生，使其端?？s加速，提前到達(dá)臨界長度； 8-MOP+UVA聯(lián)合作用后由于端?？s短加速，提前激活聯(lián)合作用后由于端?？s短加速，提前激活P53P53老老化檢查

8、點，并依次激活下游信號蛋白化檢查點，并依次激活下游信號蛋白- -細(xì)胞周期激酶抑制劑細(xì)胞周期激酶抑制劑P21WAF-1 及 P16INK-4a蛋白，相應(yīng)蛋白表達(dá)水平明顯增高；蛋白，相應(yīng)蛋白表達(dá)水平明顯增高； 綜上所述：綜上所述： 8-MOP+UVA聯(lián)合作用可導(dǎo)致基因的氧化應(yīng)激損聯(lián)合作用可導(dǎo)致基因的氧化應(yīng)激損傷，端粒受損嚴(yán)重，縮短加速，并激活老化相關(guān)蛋白表達(dá)。傷，端粒受損嚴(yán)重，縮短加速，并激活老化相關(guān)蛋白表達(dá)。第10頁/共25頁第11頁/共25頁 GS-Rg1各濃度干預(yù)組基因氧各濃度干預(yù)組基因氧化產(chǎn)物化產(chǎn)物8-oxo-dG及及SA-Gal陽陽性率均明顯低于光老化模型組性率均明顯低于光老化模型組（P

9、0.05）且與藥物劑量負(fù)相且與藥物劑量負(fù)相關(guān)關(guān)（r值依次為0.968, 0.943）。 *第12頁/共25頁各組細(xì)胞于照光后第各組細(xì)胞于照光后第7 7日端粒長度比較日端粒長度比較 GS-Rg1各濃度干預(yù)組端粒相對長度各濃度干預(yù)組端粒相對長度（2.570.05）明顯長于明顯長于8-MOP+UVA聯(lián)合處理組聯(lián)合處理組（6.630.12，P0.01），且各濃度組之間端粒相對長度與且各濃度組之間端粒相對長度與GS-Rg1GS-Rg1濃度有明顯的正相關(guān)，濃度有明顯的正相關(guān)，表現(xiàn)出一定的劑量依賴性表現(xiàn)出一定的劑量依賴性（P0.05） *第13頁/共25頁 照光后第7日老化相關(guān)蛋白表達(dá)水平 GS-Rg1各濃

10、度干預(yù)組老化相關(guān)蛋白各濃度干預(yù)組老化相關(guān)蛋白P53, P21WAF-1 及 P16INK-4a的表達(dá)的表達(dá)水平明顯低于水平明顯低于8-MOP+UVA組組（P P值均值均0.010.01），且各濃度組之間），且各濃度組之間蛋白表達(dá)水平與蛋白表達(dá)水平與GS-Rg1GS-Rg1藥物濃度有藥物濃度有明顯的負(fù)相關(guān)明顯的負(fù)相關(guān)(r1=0.981，r2=0.916，r3=0.914)。 第14頁/共25頁GS-Rg1預(yù)處理的人真皮成纖維細(xì)胞顯示出較強的氧化應(yīng)激耐預(yù)處理的人真皮成纖維細(xì)胞顯示出較強的氧化應(yīng)激耐受性，細(xì)胞內(nèi)基因氧化產(chǎn)物受性，細(xì)胞內(nèi)基因氧化產(chǎn)物8-oxo-dG產(chǎn)生明顯減少； GS-Rg1預(yù)處理的細(xì)

11、胞預(yù)處理的細(xì)胞端粒結(jié)構(gòu)中相應(yīng)堿基損傷較光老化模型端粒結(jié)構(gòu)中相應(yīng)堿基損傷較光老化模型組明顯減弱，端粒結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性加強，端?？s短減緩；組明顯減弱，端粒結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性加強，端?？s短減緩； GS-Rg1預(yù)處理的細(xì)胞預(yù)處理的細(xì)胞由于端?？s短減緩，其對老化檢查點的由于端粒縮短減緩，其對老化檢查點的激活受抑制，老化相關(guān)蛋白表達(dá)水平明顯降低；激活受抑制，老化相關(guān)蛋白表達(dá)水平明顯降低； 綜上所述：綜上所述：GS-Rg1預(yù)處理可阻止基因損傷后對細(xì)胞老化預(yù)處理可阻止基因損傷后對細(xì)胞老化P53檢查點的激活，抑制其后細(xì)胞周期激酶抑制劑檢查點的激活，抑制其后細(xì)胞周期激酶抑制劑P21WAF-1 及及 P16INK-4a的表達(dá)，減

12、弱兩者對細(xì)胞周期激酶的表達(dá)，減弱兩者對細(xì)胞周期激酶CDK的抑制作用，的抑制作用，使得使得CDK得以和核因子得以和核因子Rb蛋白結(jié)合，蛋白結(jié)合，Rb蛋白磷酸后促進細(xì)胞蛋白磷酸后促進細(xì)胞生長周期相關(guān)基因進行轉(zhuǎn)錄，使得細(xì)胞恢復(fù)分裂活性。生長周期相關(guān)基因進行轉(zhuǎn)錄，使得細(xì)胞恢復(fù)分裂活性。 第15頁/共25頁 第16頁/共25頁對照黃芩苷UVAUVA+黃芩苷01234#端粒長 度端粒長 度第17頁/共25頁對照黃芩苷UVAUVA+黃芩苷01234#p53對照黃芩苷UVAUVA+黃芩苷0.00.51.01.52.02.5#p16對照黃芩苷UVAUVA+黃芩苷0.00.51.01.5#c-mycp53p16c-myc第18頁/共25頁對照黃芩苷UVAUVA+黃芩苷02468#p16蛋白表達(dá) 水 平對照黃芩苷UVAUVA+黃芩苷0.00.51.01.5#c-myc蛋白表達(dá) 水 平第19頁/共25頁第20頁/共25頁“Tra