電泳技術(shù)昆明醫(yī)科大學(xué)PPT課件

1、一、電泳的概念一、電泳的概念 電泳（electrophoresis）是指在電解質(zhì)溶液中，帶電顆粒在外加電場的作用下，以不同的速度向著與其電荷相反的電極移動的現(xiàn)象。 許多重要的生物分子，如氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、核苷酸、核酸等都具有可電離基團，它們在某個特定的pH值下可以帶正電荷或負電荷。利用電泳現(xiàn)象對某些化學(xué)或生物物質(zhì)進行分離、分析或提純的方法和技術(shù)叫電泳技術(shù)。第1頁/共37頁 COO- COO- COOH + H+ + H+ Pr Pr Pr + OH- + OH- NH2 NH3+ NH3+PHPI PH=PI PH4.0時，帶凈的負電荷。第3頁/共37頁2、帶電顆粒在電場作用下所受的力：電

2、場力 F = qE 阻力 Ff = f q 帶電顆粒所帶的有效電荷； E 電場強度； 帶電顆粒在電場中的遷移速度； f 平動摩擦系數(shù) 第4頁/共37頁F =FfqE = f 對于一個球形帶電顆粒，服從Stoke定律，即： f = 6 r r 為帶電顆粒的表觀液態(tài)動力學(xué)半徑， 為介質(zhì)粘滯系數(shù)。當(dāng)電泳達到平衡時，帶電顆粒勻速運動: = qE 6 r = qE f 帶電顆粒在電場中的差速遷移是電泳分離的基礎(chǔ)。第5頁/共37頁3.影響電泳速度的因素： 樣品本身：帶電量，分子大小，形狀 電場強度： 緩沖液：成分， pH ，離子強度 支持介質(zhì)的篩孔大小 ： 支持介質(zhì)：電滲作用，吸附作用 電滲 = qE f

3、 = qE 6 r 第6頁/共37頁三、電泳裝置三、電泳裝置Electrophoresis apparatus第7頁/共37頁)第8頁/共37頁1.1. 按支持介質(zhì)種類不同分為：惰性介質(zhì)：起支持作用，減少對流，介質(zhì)本身不參與電泳分離 紙電泳、醋酸纖維薄膜電泳、硅膠電泳、氫氧化鋁電泳凝膠介質(zhì)起支持作用，減少對流，介質(zhì)本身參與電泳分離瓊脂糖凝膠電泳、淀粉凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳2. 按支持介質(zhì)形狀不同分為: : 薄層電泳 、 板電泳 、 柱電泳第9頁/共37頁3. 按電泳槽方向不同分為： 水平電泳、垂直電泳4. 按用途不同分為： 分析電泳、 制備電泳5. 按所用電壓不同分為： 低壓電泳（100

4、V500V ）、高壓電泳（1000V5000V）6. 按分離原理不同分為： 移動界面電泳（自由界面電泳）、區(qū)帶電泳、等速電泳、 等電聚焦電泳、免疫電泳 第10頁/共37頁7. 按樣品是否經(jīng)過還原劑處理分為： 還原電泳、非還原電泳8. 按凝膠介質(zhì)中是否加入變性劑分為： 變性電泳、非變性電泳9. 按電泳系統(tǒng)的均一性分為： 連續(xù)電泳、不連續(xù)電泳10. 按樣品被分離時凝膠介質(zhì)的pHpH不同分為： 酸性電泳（pH=4.3）、堿性電泳（pH=8.8）第11頁/共37頁瓊脂糖凝膠電泳(Agarose gel electrophorsis of DNA)第12頁/共37頁一、瓊脂糖凝膠電泳的特點一、瓊脂糖凝膠

5、電泳的特點瓊脂糖是從瓊脂中提純出來的，主要是由瓊脂糖是從瓊脂中提純出來的，主要是由D D半乳糖和半乳糖和3,63,6脫水脫水L L半乳糖連接而成的一種線性多糖。將瓊脂糖懸浮于半乳糖連接而成的一種線性多糖。將瓊脂糖懸浮于緩沖液，加熱溶解，冷卻后即成瓊脂糖凝膠。該凝膠具有剛緩沖液，加熱溶解，冷卻后即成瓊脂糖凝膠。該凝膠具有剛性的凝膠孔，凝膠孔徑的大小決定于瓊脂糖的濃度性的凝膠孔，凝膠孔徑的大小決定于瓊脂糖的濃度。 DNA分子帶負電荷，在外加電場作用下向正極泳動。分子帶負電荷，在外加電場作用下向正極泳動。DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動時，有電荷效應(yīng)與分子篩效分子在瓊脂糖凝膠中泳動時，有電荷效應(yīng)與分子篩

6、效應(yīng)。不同應(yīng)。不同DNA的分子量大小及構(gòu)型不同，所帶凈電荷的多的分子量大小及構(gòu)型不同，所帶凈電荷的多少不同少不同,電泳時的泳動率就不同，從而分出不同的區(qū)帶。電泳時的泳動率就不同，從而分出不同的區(qū)帶。第13頁/共37頁分子篩效應(yīng)（Molecular sieve effect）：分子量或分子大小和形狀不同的帶電顆粒通過一定孔徑的凝膠時，因受阻滯的程度不同而表現(xiàn)出不同的遷移率，這就是分子篩效應(yīng)。分子量小，阻力小，移動快；分子量大，阻力大，移動慢。電荷效應(yīng)（Charge effect）：帶電顆粒由于所帶電荷量不同，而在電泳中表現(xiàn)出不同的遷移率，這就是電荷效應(yīng)。第14頁/共37頁第15頁/共37頁EB顯

7、帶（EB banding）電泳后電泳后EBEB染色染色EBEB加入凝加入凝膠中電泳膠中電泳經(jīng)EB染色后，電泳結(jié)果在波長為254 nm的紫外燈下觀察。注意 在分子量相當(dāng)?shù)那闆r下，DNA的電泳遷移率依次為：超螺旋環(huán)狀DNA線狀DNA缺口環(huán)狀DNA第16頁/共37頁 瓊脂糖凝膠電泳由于其所分級分離的生物大瓊脂糖凝膠電泳由于其所分級分離的生物大分分子比聚丙烯酰胺凝膠電泳大，因此適合于分離核子比聚丙烯酰胺凝膠電泳大，因此適合于分離核酸酸（DNADNA和和RNARNA）和蛋白。）和蛋白。 三、電泳的應(yīng)用三、電泳的應(yīng)用第17頁/共37頁聚丙烯酰胺凝膠電泳(Polyacrylamide gel electro

8、phorsis, PAGE)第18頁/共37頁 聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺( (簡稱簡稱Acr)Acr)和交聯(lián)劑和交聯(lián)劑N,N-N,N-甲叉雙丙烯酰胺甲叉雙丙烯酰胺( (簡稱簡稱Bis)Bis)在加速劑在加速劑N N，N N，N N ，N N - -四甲基乙二胺四甲基乙二胺( (簡稱簡稱TEMED)TEMED)和催化劑過和催化劑過硫酸銨硫酸銨( (簡稱簡稱AP)AP)或核黃素或核黃素(V(VB2B2) )的作用下聚合交聯(lián)的作用下聚合交聯(lián)成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠。該凝膠具有剛性的凝膠成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠。該凝膠具有剛性的凝膠孔，凝膠孔徑的大小主要決定于丙烯酰胺的濃度

9、孔，凝膠孔徑的大小主要決定于丙烯酰胺的濃度。一、聚丙烯酰胺凝膠的特點一、聚丙烯酰胺凝膠的特點(Poly propylene ethylene amines gel characteristics)化學(xué)聚合光聚合 第19頁/共37頁聚丙烯酰胺凝膠具有如下聚丙烯酰胺凝膠具有如下優(yōu)點優(yōu)點(the advantages (the advantages of poly propylene ethylene amines gel)of poly propylene ethylene amines gel)：一定濃度下，凝膠透明，有彈性，機械性能好一定濃度下，凝膠透明，有彈性，機械性能好化學(xué)惰性好，在范圍較

10、大的化學(xué)惰性好，在范圍較大的pHpH、溫度和離子強度等條、溫度和離子強度等條件下穩(wěn)定；幾乎無電滲作用件下穩(wěn)定；幾乎無電滲作用由于可以制得高純度的單體原料由于可以制得高純度的單體原料 ，樣品分離重復(fù)性較，樣品分離重復(fù)性較好好樣品在凝膠中不易擴散，樣品分離靈敏度高，可達樣品在凝膠中不易擴散，樣品分離靈敏度高，可達10106 6g g容易制備出孔徑范圍很寬的凝膠，以適應(yīng)不同的需要容易制備出孔徑范圍很寬的凝膠，以適應(yīng)不同的需要無紫外吸收，不染色就可以用于紫外波長的凝膠掃描無紫外吸收，不染色就可以用于紫外波長的凝膠掃描作定量分析作定量分析 第20頁/共37頁凝膠濃度的選擇與被分離物質(zhì)分子量密切相關(guān)第21

11、頁/共37頁第22頁/共37頁第23頁/共37頁二、電泳的二、電泳的原理原理1. 聚丙烯酰胺凝膠電泳（聚丙烯酰胺凝膠電泳（nativePAGE）生物大分子在生物大分子在聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝膠中泳動時，有電荷效應(yīng)與凝膠中泳動時，有電荷效應(yīng)與分子篩效應(yīng)。不同的核酸或蛋白質(zhì)，它們的分子量大小分子篩效應(yīng)。不同的核酸或蛋白質(zhì)，它們的分子量大小及構(gòu)型不同，所帶凈電荷的多少不同。電泳時的泳動率及構(gòu)型不同，所帶凈電荷的多少不同。電泳時的泳動率就不同，從而分出不同的區(qū)帶。在電泳分離后能保持蛋就不同，從而分出不同的區(qū)帶。在電泳分離后能保持蛋白質(zhì)和酶等生物大分子的生物活性。白質(zhì)和酶等生物大分子的生物活性。第24頁

12、/共37頁分子篩效應(yīng)(Effect of molecular sieve)：分子量或分子大小和形狀不同的帶電顆粒通過一定孔徑的凝膠時，因受阻滯的程度不同而表現(xiàn)出不同的遷移率，這就是分子篩效應(yīng)。分子量小，阻力小，移動快；分子量大，阻力大，移動慢。電荷效應(yīng)(Effect of electric charge)：帶電顆粒由于所帶電荷量不同，而在電泳中表現(xiàn)出不同的遷移率，這就是電荷效應(yīng)。第25頁/共37頁4.染色聚丙烯酰胺凝膠的常用染色方法有兩種：考馬斯亮藍染色法：利用蛋白質(zhì)染料結(jié)合的原理，靈敏度高，可以檢測低至810 ng的蛋白質(zhì)。線性范圍是20倍。但染料會對蛋白質(zhì)進行修飾而影響質(zhì)譜分析。銀染法：銀

13、染是利用甲醛將銀離子（Ag+）在蛋白質(zhì)或者核酸上還原成黑色的單質(zhì)銀，來指示條帶。銀染的靈敏度比考馬斯亮藍染色高100倍，可以檢測低至1 ng的蛋白質(zhì)。線性范圍是40倍。但對某些蛋白質(zhì)染色效果差，且影響其后的蛋白質(zhì)測序和質(zhì)譜分析。第26頁/共37頁聚丙烯凝膠電泳分析蛋白質(zhì)（考馬斯亮藍染色）聚丙烯凝膠電泳分析蛋白質(zhì)（考馬斯亮藍染色）第27頁/共37頁 聚丙烯凝膠電泳分析核苷酸多態(tài)性（銀染）聚丙烯凝膠電泳分析核苷酸多態(tài)性（銀染）第28頁/共37頁 常規(guī)的聚丙烯酰胺凝膠電泳適合于核苷酸多態(tài)性常規(guī)的聚丙烯酰胺凝膠電泳適合于核苷酸多態(tài)性和蛋白質(zhì)的分析、分離。和蛋白質(zhì)的分析、分離。 SDS-PAGE則常用于則常用于測定蛋白質(zhì)的分子量和蛋白測定蛋白質(zhì)的分子量和蛋白質(zhì)的亞基數(shù)。目前質(zhì)的亞基數(shù)。目前已發(fā)現(xiàn)有些蛋白質(zhì)不能用已發(fā)現(xiàn)有些蛋白質(zhì)不能用SDS-PAGE測定分子量。如電荷異?；驑?gòu)象異常的蛋白質(zhì)，帶有較測定分子量。如電荷異?；驑?gòu)象異常的蛋白質(zhì)，帶有較大輔基的蛋白質(zhì)