水處理微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)書

1、市 政 與 環(huán) 境 工 程 系MUNICIPLE AND ENVIRONMENTAL ENGINEERING DEPARTMENT水處理微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)書班 級(jí) 姓 名學(xué) 號(hào)市政與環(huán)境工程學(xué)院年 月目 錄實(shí)驗(yàn)一 顯微鏡、測微尺的使用及生物相的觀察 實(shí)驗(yàn)二 革蘭氏染色技術(shù) 實(shí)驗(yàn)三 培養(yǎng)基的配制和滅菌 實(shí)驗(yàn)四 水中細(xì)菌總數(shù)的測定 實(shí)驗(yàn)一 顯微鏡、測微尺的使用及生物相的觀察一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c要求（1） 了解普通光學(xué)顯微鏡的構(gòu)造與功能，學(xué)習(xí)與掌握顯微鏡觀察微生物的方法。（2） 觀察細(xì)菌、放線菌和藍(lán)細(xì)菌的個(gè)體形態(tài)，學(xué)會(huì)繪制微生物的形態(tài)結(jié)構(gòu)圖。二、顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)和功能普通光學(xué)顯微鏡是一種精密的光學(xué)儀器。以往

2、最簡單的顯微鏡僅由幾塊透鏡組成，而當(dāng)前使用的顯微鏡由一套透鏡組成。普通光學(xué)顯微鏡通常能將物體放大15002000倍。（一）顯微鏡的構(gòu)造普通光學(xué)顯微鏡的構(gòu)造可分為兩大部分：一為機(jī)械裝置，一為光學(xué)系統(tǒng)，這兩部分很好的配合，才能發(fā)揮顯微鏡的作用。1、顯微鏡的機(jī)械裝置顯微鏡的機(jī)械裝置包括鏡座、鏡筒、物鏡轉(zhuǎn)換器、載物臺(tái)、推動(dòng)器、粗動(dòng)螺旋、微動(dòng)螺旋等部件。（1）鏡座  鏡座是顯微鏡的基本支架，它由底座和鏡臂兩部分組成。在它上面連接有載物臺(tái)和鏡筒，它是用來安裝光學(xué)放大系統(tǒng)部件的基礎(chǔ)。（2）鏡筒  鏡筒上接接目鏡，下接轉(zhuǎn)換器，形成接目鏡與接物鏡（裝在轉(zhuǎn)換器下）間的暗室。從物鏡的后緣到鏡筒尾

3、端的距離稱為機(jī)械筒長。因?yàn)槲镧R的放大率是對(duì)一定的鏡筒長度而言的。鏡筒長度的變化，不僅放大倍率隨之變化，而且成像質(zhì)量也受到影響。因此，使用顯微鏡時(shí)，不能任意改變鏡筒長度。國際上將顯微鏡的標(biāo)準(zhǔn)筒長定為160mm，此數(shù)字標(biāo)在物鏡的外殼上。（3）物鏡轉(zhuǎn)換器  物鏡轉(zhuǎn)換器上可安裝34個(gè)接物鏡，一般是三個(gè)接物鏡（低倍、高倍、油鏡）。Nikon顯微鏡裝有四個(gè)物鏡。轉(zhuǎn)動(dòng)轉(zhuǎn)換器，可以按需要將其中的任何一個(gè)接物鏡和鏡筒接通，與鏡筒上面的接目鏡構(gòu)成一個(gè)放大系統(tǒng)。（4）載物臺(tái)  載物臺(tái)中央有一孔，為光線通路。在臺(tái)上裝有彈簧標(biāo)本夾和推動(dòng)器，其作用為固定或移動(dòng)標(biāo)本的位置，使得鏡檢對(duì)象恰好位于視野中心。

4、（5）推動(dòng)器  是移動(dòng)標(biāo)本的機(jī)械裝置，它是由一橫一縱兩個(gè)推進(jìn)齒軸的金屬架構(gòu)成的，好的顯微鏡在縱橫架桿上刻有刻度標(biāo)尺，構(gòu)成很精密的平面座標(biāo)系。如果我們須重復(fù)觀察已檢查標(biāo)本的某一部分，在第一次檢查時(shí)，可記下縱橫標(biāo)尺的數(shù)值，以后按數(shù)值移動(dòng)推動(dòng)器，就可以找到原來標(biāo)本的位置。（6）粗動(dòng)螺旋  粗動(dòng)螺旋是移動(dòng)鏡筒調(diào)節(jié)接物鏡和標(biāo)本間距離的機(jī)件，老式顯微鏡粗螺旋向前扭，鏡頭下降接近標(biāo)本。新近出產(chǎn)的顯微鏡（如Nikon顯微鏡）鏡檢時(shí)，右手向前扭載物臺(tái)上升，讓標(biāo)本接近物鏡，反之則下降，標(biāo)本脫離物鏡。（7）微動(dòng)螺旋  用粗動(dòng)螺旋只可以粗放的調(diào)節(jié)焦距，要得到最清晰的物象，需要用微動(dòng)螺旋做

5、進(jìn)一步調(diào)節(jié)。微動(dòng)螺旋每轉(zhuǎn)一圈鏡筒移動(dòng)0.1毫米（100微米）。新近出產(chǎn)的較高檔次的顯微鏡的粗動(dòng)螺旋和微動(dòng)螺旋是共軸的。2、顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)由反光鏡，聚光器，接物鏡，接目鏡等組成，光學(xué)系統(tǒng)使物體放大，形成物體放大像 。（1）反光鏡  較早的普通光學(xué)顯微鏡是用自然光檢視物體，在鏡座上裝有反光鏡。反光鏡是由一平面和另一凹面的鏡子組成，可以將投射在它上面的光線反射到聚光器透鏡的中央，照明標(biāo)本。不用聚光器時(shí)用凹面鏡，凹面鏡能起會(huì)聚光線的作用。用聚光器時(shí)，一般都用平面鏡。新近出產(chǎn)的較高檔次的顯微鏡鏡座上裝有光源，并有電流調(diào)節(jié)螺旋，可通過調(diào)節(jié)電流大小調(diào)節(jié)光照強(qiáng)度。（2）聚光器 &#

6、160;聚光器在載物臺(tái)下面，它是由聚光透鏡、虹彩光圈和升降螺旋組成的。聚光器可分為明視場聚光器和暗視場聚光器。普通光學(xué)顯微鏡配置的都是明視場聚光器，明視場聚光器有阿貝聚光器、齊明聚光器和搖出聚光器。阿貝聚光器在物鏡數(shù)值孔徑高于0.6時(shí)會(huì)顯示出色差和球差。齊明聚光器對(duì)色差、球差和慧差的校正程度很高，是明視場鏡檢中質(zhì)量最好的聚光器，但它不適于4倍以下的物鏡。搖出聚光器能將聚光器上透鏡從光路中搖出滿足低倍物鏡（4×）大視場照明的需要。聚光器安裝在載物臺(tái)下，其作用是將光源經(jīng)反光鏡反射來的光線聚焦于樣品上，以得到最強(qiáng)的照明，使物象獲得明亮清晰的效果。聚光器的高低可以調(diào)節(jié)，使焦點(diǎn)落在被檢物體上，

7、以得到最大亮度。一般聚光器的焦點(diǎn)在其上方1.25mm處，而其上升限度為載物臺(tái)平面下方0.1mm。因此，要求使用的載玻片厚度應(yīng)在0.81.2mm之間，否則被檢樣品不在焦點(diǎn)上，影響鏡檢效果。聚光器前透鏡組前面還裝有虹彩光圈，它可以開大和縮小，影響著成像的分辨力和反差，若將虹彩光圈開放過大，超過物鏡的數(shù)值孔徑時(shí)，便產(chǎn)生光斑；若收縮虹彩光圈過小，分辨力下降，反差增大。因此，在觀察時(shí)，通過虹彩光圈的調(diào)節(jié)再把視場光闌（帶有視場光闌的顯微鏡）開啟到視場周緣的外切處，使不在視場內(nèi)的物體得不到任何光線的照明，以避免散射光的干擾。（3）物鏡  安裝在鏡筒前端轉(zhuǎn)換器上的接物透鏡利用光線使被檢物體第一次造像

8、，物鏡成像的質(zhì)量，對(duì)分辨力有著決定性的影響。物鏡的性能取決于物鏡的數(shù)值孔徑（numerical apeature簡寫為NA），每個(gè)物鏡的數(shù)值孔徑都標(biāo)在物鏡的外殼上，數(shù)值孔徑越大，物鏡的性能越好。物鏡的種類很多，可從不同角度來分類：根據(jù)物鏡前透鏡與被檢物體之間的介質(zhì)不同，可分為：干燥系物鏡  以空氣為介質(zhì)，如常用的40×以下的物鏡，數(shù)值孔徑均小于1。油浸系物鏡  常以香柏油為介質(zhì)，此物鏡又叫油鏡頭，其放大率為90×100×，數(shù)值孔值大于1。根據(jù)物鏡放大率的高低，可分為：低倍物鏡  指1×6×，NA值為0.040.15

9、；中倍物鏡  指6×25×，NA值為0.15 0.40；高倍物鏡  指25×63×，NA值為0.350.95；油浸物鏡  指90×100×，NA值為1.251.40。根據(jù)物鏡像差校正的程度來分類可分為：消色差物鏡  是最常用的物鏡，外殼上標(biāo)有“Ach”字樣，該物鏡可以除紅光和青光形成的色差。鏡檢時(shí)通常與惠更斯目鏡配合使用。復(fù)消色差物鏡  物鏡外殼上標(biāo)有“Apo”字樣，除能校正紅、藍(lán)、綠三色光的色差外，還能校正黃色光造成的相差，通常與補(bǔ)償目鏡配合使用。特種物鏡  在上述物鏡基礎(chǔ)

10、上，為達(dá)到某些特定觀察效果而制造的物鏡。如：帶校正環(huán)物鏡，帶視場光闌物鏡，相差物鏡，熒光物鏡，無應(yīng)變物鏡，無罩物鏡，長工作距離物鏡等。目前在研究中常用的物鏡還有：半復(fù)消色差物鏡（FL），平場物鏡(Plan)，平場復(fù)消色差物鏡（Plan Apo）,超平場物鏡（Splan，超平場復(fù)消色差物鏡（Splan Apo）等。（4）目鏡  目鏡的作用是把物鏡放大了的實(shí)像再放大一次，并把物像映入觀察者的眼中。目鏡的結(jié)構(gòu)較物鏡簡單，普通光學(xué)顯微鏡的目鏡通常由兩塊透鏡組成，上端的一塊透鏡稱“接目鏡”，下端的透鏡稱“場鏡”。上下透鏡之間或在兩個(gè)透鏡的下方，裝有由金屬制的環(huán)狀光闌或叫“視場光闌”，物鏡放大后

11、的中間像就落在視場光闌平面處，所以其上可安置目鏡測微尺。普通光學(xué)顯微鏡常用的目鏡為惠更斯目鏡（Huygens eyepiece），如要進(jìn)行研究用時(shí)，一般選用性能更好的目鏡，如補(bǔ)償目鏡（K）、平場目鏡（P）、廣視場目鏡（WF）。照相時(shí)選用照相目鏡（NFK）。（二）光學(xué)顯微鏡的成像原理顯微鏡的放大是通過透鏡來完成的，單透鏡成像具有像差，影響像質(zhì)。由單透鏡組合而成的透鏡組相當(dāng)于一個(gè)凸透鏡，放大作用更好。 （三）顯微鏡的性能顯微鏡分辨能力的高低決定于光學(xué)系統(tǒng)的各種條件。被觀察的物體必須放大率高，而且清晰，物體放大后，能否呈現(xiàn)清晰的細(xì)微結(jié)構(gòu)，首先取決于物鏡的性能，其次為目鏡和聚光鏡的性能。 1、數(shù)值孔徑

12、 也叫做鏡口率（或開口率），簡寫為N.A，在物鏡和聚光器上都標(biāo)有它們的數(shù)值孔徑，數(shù)值孔徑是物鏡和聚光器的主要參數(shù)，也是判斷它們性能的最重要指標(biāo)。數(shù)值孔徑和顯微鏡的各種性能有密切的關(guān)系，它與顯微鏡的分辨力成正比，與焦深成反比，與鏡象亮度的平方根成正比。數(shù)值孔徑可用下式表示：N.A=n.sin2式中：n物鏡與標(biāo)本之間的介質(zhì)析射率物鏡的鏡口角所謂鏡口角是指從物鏡光軸上的物點(diǎn)發(fā)出的光線與物鏡前透鏡有效直徑的邊緣所張的角度。鏡口角總是小于180°。因?yàn)榭諝獾恼凵渎蕿?，所以干燥物鏡的數(shù)值孔徑總是小于1，一般為0.050.95；油浸物鏡如用香柏油（折射率為1.515）浸沒，則數(shù)值孔徑最大可接近1

13、.5。雖然理論上數(shù)值孔徑的極限等于所用浸沒介質(zhì)的折射率，但實(shí)際上從透鏡的制造技術(shù)看，是不可能達(dá)到這一極限的。通常在實(shí)用范圍內(nèi)，高級(jí)油浸物鏡的最大數(shù)值孔徑是1.4。幾種物質(zhì)的介質(zhì)的折射率如下：空氣為1.0，水為1.33，玻璃為1.5，甘油為1.47，香柏油為1.52。2、分辨力D可用下式表示：D=/2N.A.可見光的波長為0.40.7微米，平均波長為0.55微米。若用數(shù)值孔為0.65的物鏡，則D=0.55微米/2×0.65=0.42微米。這表示被檢物體在0.42微米以上時(shí)可被觀察到，若小于0.42微米就不能視見。如果使用數(shù)值孔徑為1.25的物鏡，則D=2.20微米。凡被檢物體長度大于這

14、個(gè)數(shù)值，均能視見。由此可見，D值愈小，分辨力愈高，物象愈清楚。根據(jù)上式，可通過：（1）減低波長；（2）增大折射率；（3）加大鏡口角來提高分辨力。紫外線作光源的顯微鏡和電子顯微鏡就是利用短光波來提高分辨力以檢視較小的物體的。物鏡分辨力的高低與造象是否清楚有密切的關(guān)系。目鏡沒有這種性能。目鏡只放大物鏡所造的象。 3、放大率：顯微鏡放大物體，首先經(jīng)過物鏡第一次放大造象，目鏡在明視距離造成第二次放大象。放大率就是最后的象和原物體兩者體積大小之比例。因此，顯微鏡的放大率（V）等于物鏡放大率（V1）和目鏡放大率（V2）的乘積，即：V=V1×V2比較精確的計(jì)算方法，可從下列公式求得M=×

15、DF1F2F1=接物鏡焦距，F(xiàn)2=接目鏡焦距  =光學(xué)筒長，D=明視距離（=250毫米）=接物鏡的放大倍數(shù)D=接目鏡放大倍數(shù)M=顯微鏡放大倍數(shù)F1F2設(shè)=160毫米   F1=4毫米  D=250毫米  F2=150毫米則M=×D=160×250=40×16.7=668倍F1F24154、焦深：在顯微鏡下觀察一個(gè)標(biāo)本時(shí)，焦點(diǎn)對(duì)在某一象面時(shí)，物象最清晰，這象面為目的面。在視野內(nèi)除目的面外，還能在目的面的上面和下面看見模糊的物象，這兩個(gè)面之間的距離稱為焦深。物鏡的焦深和數(shù)值孔徑及放大率成反比：即數(shù)值孔徑和放大率愈大，焦

16、深愈小。因此調(diào)節(jié)油鏡比調(diào)節(jié)低倍鏡要更加仔細(xì)，否則容易使物象滑過而找不到。三、實(shí)驗(yàn)器材1. 顯微鏡、擦鏡紙等2. 標(biāo)本片3. 香柏油、二甲苯四、顯微鏡的使用操作及注意事項(xiàng)顯微鏡結(jié)構(gòu)精密，使用時(shí)必須細(xì)心，要按下述操作步驟進(jìn)行。（一）觀察前的準(zhǔn)備1、顯微鏡從顯微鏡柜或鏡箱內(nèi)拿出時(shí)，要用右手緊握鏡臂，左手托住鏡座，平穩(wěn)地將顯微鏡搬運(yùn)到實(shí)驗(yàn)桌上。2、將顯微鏡放在自己身體的左前方，離桌子邊緣約10cm左右，右側(cè)可放記錄本或繪圖紙。3、調(diào)節(jié)光照 不帶光源的顯微鏡，可利用燈光或自然光通過反光鏡來調(diào)節(jié)光照，但不能用直射陽光，直射陽光會(huì)影響物像的清晰并刺激眼睛。將10×物鏡轉(zhuǎn)入光孔，將聚光器上的虹彩光圈

17、打開到最大位置，用左眼觀察目鏡中視野的亮度，轉(zhuǎn)動(dòng)反光鏡，使視野的光照達(dá)到最明亮最均勻?yàn)橹?。光線較強(qiáng)時(shí)，用平面反光鏡，光線較弱時(shí)，用凹面反光鏡。自帶光源的顯微鏡，可通過調(diào)節(jié)電流旋鈕來調(diào)節(jié)光照強(qiáng)弱。4、調(diào)節(jié)光軸中心 顯微鏡在觀察時(shí)，其光學(xué)系統(tǒng)中的光源、聚光器、物鏡和目鏡的光軸及光闌的中心必須跟顯微鏡的光軸同在一直線上。帶視場光闌的顯微鏡，先將光闌縮小，用10×物鏡觀察，在視場內(nèi)可見到視場光闌圓球多邊形的輪廓像，如此像不在視場中央，可利用聚光器外側(cè)的兩個(gè)調(diào)整旋鈕將其調(diào)到中央，然后緩慢地將視場光闌打開，能看到光束向視場周緣均勻展開直至視場光闌的輪廓像完全與視場邊緣內(nèi)接，說明光線已經(jīng)合軸。切忌

18、用單手拎提；且不論使用單筒顯微鏡或雙筒顯微鏡均應(yīng)雙眼同時(shí)睜開觀察，以減少眼睛疲勞，也便于邊觀察邊繪圖或記錄。（二）低倍鏡觀察  鏡檢任何標(biāo)本都要養(yǎng)成必須先用低倍鏡觀察的習(xí)慣。因?yàn)榈捅剁R視野較大，易于發(fā)現(xiàn)目標(biāo)和確定檢查的位置。將標(biāo)本片放置在載物臺(tái)上，用標(biāo)本夾夾住，移動(dòng)推動(dòng)器，使被觀察的標(biāo)本處在物鏡正下方，轉(zhuǎn)動(dòng)粗調(diào)節(jié)旋鈕，使物鏡調(diào)至接近標(biāo)本處，用目鏡觀察并同時(shí)用粗調(diào)節(jié)旋鈕慢慢升起鏡筒（或下降載物臺(tái)），直至物像出現(xiàn)，再用細(xì)調(diào)節(jié)旋鈕使物像清晰為止。用推動(dòng)器移動(dòng)標(biāo)本片，找到合適的目的像并將它移到視野中央進(jìn)行觀察。在任何時(shí)候使用粗調(diào)節(jié)器聚焦物像時(shí)，必需養(yǎng)成先從側(cè)面注視小心調(diào)節(jié)物鏡靠近標(biāo)本，然后用

19、目鏡觀察，慢慢調(diào)節(jié)物鏡離開標(biāo)本進(jìn)行準(zhǔn)焦的習(xí)慣，以免因一時(shí)的誤操作而損壞鏡頭及玻片。（三）高倍鏡觀察  在低倍物鏡觀察的基礎(chǔ)上轉(zhuǎn)換高倍物鏡。較好的顯微鏡，低倍、高倍鏡頭是同焦的，在正常情況下，高倍物鏡的轉(zhuǎn)換不應(yīng)碰到載玻片或其上的蓋玻片。若使用不同型號(hào)的物鏡，在轉(zhuǎn)換物鏡時(shí)要從側(cè)面觀察，避免鏡頭與玻片相撞。然后從目鏡觀察，調(diào)節(jié)光照，使亮度適中，緩慢調(diào)節(jié)粗調(diào)節(jié)旋鈕，使載物臺(tái)上升（或鏡筒下降），直至物像出現(xiàn)，再用細(xì)調(diào)節(jié)旋鈕調(diào)至物像清晰為止，找到需觀察的部位，并移至視野中央進(jìn)行觀察。在一般情況下，當(dāng)物像在一種物鏡中已清晰聚焦后，轉(zhuǎn)動(dòng)物鏡轉(zhuǎn)換器將其他物鏡轉(zhuǎn)到工作位置進(jìn)行觀察時(shí)，物像將保持基本準(zhǔn)焦的

20、狀態(tài)，這種現(xiàn)象稱為物鏡的同焦。利用這種同焦現(xiàn)象，可以保證在使用高倍鏡或油鏡等放大倍數(shù)高、工作距離短的物鏡時(shí)僅用細(xì)調(diào)節(jié)器即可對(duì)物像清晰聚焦，從而避免由于使用粗調(diào)節(jié)器時(shí)可能的誤操作而損壞鏡頭或載玻片。（四）油鏡觀察  油浸物鏡的工作距離（指物鏡前透鏡的表面到被檢物體之間的距離）很短，一般在0.2mm以內(nèi)，再加上一般光學(xué)顯微鏡的油浸物鏡沒有“彈簧裝置”，因此使用油浸物鏡時(shí)要特別細(xì)心，避免由于“調(diào)焦”不慎而壓碎標(biāo)本片并使物鏡受損。使用油鏡按下列步驟操作：1、先用粗調(diào)節(jié)旋鈕將鏡筒提升（或?qū)⑤d物臺(tái)下降）約2cm，并將高倍鏡轉(zhuǎn)出。2、在玻片標(biāo)本的鏡檢部位滴上一滴香柏油。3、從側(cè)面注視，用粗調(diào)節(jié)旋鈕

21、將載物臺(tái)緩緩地上升，（或鏡筒下降），使油浸物鏡浸入香柏油中，使鏡頭幾乎與標(biāo)本接觸。4、從接目鏡內(nèi)觀察，放大視場光闌及聚光鏡上的虹彩光圈（帶視場光闌油鏡開大視場光闌），上調(diào)聚光器，使光線充分照明。用粗調(diào)節(jié)旋鈕將載物臺(tái)徐徐下降（或鏡筒上升），當(dāng)出現(xiàn)物像一閃后改用細(xì)調(diào)節(jié)旋鈕調(diào)至最清晰為止。如油鏡已離開油面而仍未見到物象，必須再從側(cè)面觀察，重復(fù)上述操作。有時(shí)按上述操作還找不到目的物，則可能是由于油鏡頭下降還未到位，或因油鏡上升太快。以至眼睛捕捉不到一閃而過的物像。遇此情況，應(yīng)重新操作。另外應(yīng)特別注意不要因在下降鏡頭時(shí)用力過猛，或調(diào)焦時(shí)誤將粗調(diào)節(jié)器向反方向轉(zhuǎn)動(dòng)而損壞鏡頭及載玻片。5、觀察完畢，下降載物臺(tái)

22、，將油鏡頭轉(zhuǎn)出，先用擦鏡紙擦去鏡頭上的油，再用擦鏡紙蘸少許乙醚酒精混合液（乙醚2份，純酒精3份）或二甲苯，擦去鏡頭上殘留油跡，最后再用擦鏡紙擦拭23下即可，（注意向一個(gè)方向擦拭）。6、將各部分還原，轉(zhuǎn)動(dòng)物鏡轉(zhuǎn)換器，使物鏡頭不與載物臺(tái)通光孔相對(duì)，而是成八字形位置，再將鏡筒下降至最低，降下聚光器，反光鏡與聚光器垂直，用一個(gè)干凈手帕將接目鏡罩好，以免目鏡頭沾污灰塵。最后用柔軟紗布清潔載物臺(tái)等機(jī)械部分，然后將顯微鏡放回柜內(nèi)或鏡箱中。7、有菌的玻片置消毒缸中，清洗、晾干后備用。五、微生物大小測定微生物細(xì)胞的大小，是微生物重要的形態(tài)特征之一，也是分類鑒定的依據(jù)之一。由于菌體很小、只能在顯微鏡下來測量。用于

23、測量微生物細(xì)胞大小的工具有目鏡測微尺和鏡臺(tái)測微尺。目鏡測微尺（圖20-1）是一塊圓形玻片，在玻片中央把5mm長度刻成50等分，或把10 mm長度刻成100等分。測量時(shí)，將其放在接目鏡中的隔板上(此處正好與物鏡放大的中間像重疊)來測量經(jīng)顯微鏡放大后的細(xì)胞物象。由于不同目鏡、物鏡組合的放大倍數(shù)不相同，目鏡測微尺每格實(shí)際表示的長度也不一樣，因此目鏡測微尺測量微生物大小時(shí)須先用置于鏡臺(tái)上的鏡臺(tái)測微尺校正，以求出在一定放大倍數(shù)下，目鏡測微尺每小格所代表的相對(duì)長度。鏡臺(tái)測微尺（圖20-2）是中央部分刻有精確等分線的載玻片，一般將lmm等分為100格，每格長l0m（即0.0lmm），是專門用來校正目鏡測微尺

24、的。校正時(shí)，將鏡臺(tái)測微尺放在載物臺(tái)上。    圖 20-1目鏡測微尺由于鏡臺(tái)測微尺與細(xì)胞標(biāo)本是處于同一位置，都要經(jīng)過物鏡和目鏡的兩次放大成象進(jìn)入視野，即鏡臺(tái)測微尺隨著顯微鏡總放大倍數(shù)的放大而放大，因此從鏡臺(tái)測微尺上得到的讀數(shù)就是細(xì)胞的真實(shí)大小，所以用鏡臺(tái)測微尺的已知長度在一定放大倍數(shù)下校正目鏡測微尺，即可求出目鏡測微尺每格所代表的長度，然后移去鏡臺(tái)測微尺，換上待測標(biāo)本片，用校正好的目鏡測微尺在同樣放大倍數(shù)下測量微生物大小。 六、實(shí)驗(yàn)報(bào)告 1、結(jié)果 分別繪出你在低倍鏡、高倍鏡和油鏡下觀察到的標(biāo)本片的形態(tài)，包括在三種情況下視野中的變化，同時(shí)注明物鏡放大倍數(shù)和總放大率。 2、思考

25、題 (1)用油鏡觀察時(shí)應(yīng)注意哪些問題?在載玻片和鏡頭之間加滴什么油?起什么作用? (2)試列表比較低倍鏡、高倍鏡及油鏡各方面的差異。為什么在使用高倍鏡及油鏡時(shí)應(yīng)特別注意避免粗調(diào)節(jié)器的誤操作? (3)什么是物鏡的同焦現(xiàn)象?它在顯微鏡觀察中有什么意義? (4)影響顯微鏡分辨率的因素有哪些？ (5)根據(jù)你的實(shí)驗(yàn)體會(huì)，談?wù)剳?yīng)如何根據(jù)所觀察微生物的大小，選擇不同的物鏡進(jìn)行有效的觀察。實(shí)驗(yàn)二 革蘭氏染色技術(shù)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)微生物染色的基本技術(shù)，掌握微生物的革蘭氏染色方法。二、實(shí)驗(yàn)原理革蘭氏染色是細(xì)菌學(xué)中極為重要的鑒別染色法。其原理主要是因?yàn)榧?xì)菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的差異，導(dǎo)致對(duì)結(jié)晶紫碘復(fù)合物的滲透性不同，產(chǎn)生革蘭氏

26、反應(yīng)呈現(xiàn)出陰性或陽性。由此通過革蘭氏染色可將細(xì)菌鑒別為革蘭氏陽性菌（G）和革蘭氏陰性菌（G）兩個(gè)類。若菌體被結(jié)晶紫初染時(shí)，染上的紫色不被酒精脫色者為G菌；若被酒精脫色，而復(fù)染上紅色者為G菌。通過該染色法也可以觀察細(xì)菌個(gè)體形狀、排列、芽孢有無及其形狀、大小和著色位置等。三、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1.染色劑赫克爾氏結(jié)晶紫液 甲液：結(jié)晶紫 2g 乙液：草酸銨 0.8g 乙醇（95%） 20ml 蒸餾水 80ml將甲、乙兩液混合，靜置48小時(shí)后使用。該染液較穩(wěn)定，在不透氣的棕色瓶中可儲(chǔ)存數(shù)月。盧哥氏碘液 碘片：1.0g 碘化鉀：2.0 g 蒸餾水：300ml先將碘化鉀溶于少量蒸餾水中，再放入碘片，待碘片全溶后，加水

27、至300 ml。此液穩(wěn)定，在不透氣的棕色瓶中可存數(shù)月。脫色液：95%的乙醇。復(fù)染液：即0.5%番紅水溶液。番紅(safranine，又稱沙黃O)2.5g, 95%乙醇100mL取2.5%番紅（又稱沙黃）的酒精溶液20 ml，蒸餾水80 ml。2.操作步驟涂片。取適宜的細(xì)菌涂片，涂片時(shí)要使菌體薄而均勻，否則菌體群集會(huì)呈現(xiàn)假陽性。干燥和固定。自然風(fēng)干或微熱促其干燥，然后在火焰上通過12次，以固定涂片。初染。滴加結(jié)晶紫液，覆蓋約1分鐘。用水沖凈結(jié)晶紫液。媒染。滴加碘液沖去殘水，并覆蓋約1分鐘。用水沖去碘液，將載玻片上水甩凈或用濾紙吸干。脫色。將載玻片傾斜，并襯以白背景，流滴95%乙醇約2030秒，立

28、即用水沖凈乙醇。復(fù)染。用番紅液12分鐘，使已脫色的細(xì)胞重新著色，便于鑒別觀察。水洗、待干，鏡檢。鏡檢。用油鏡觀察單獨(dú)分散的菌體，菌體呈藍(lán)紫者為G，紅色者為G-。四、結(jié)論實(shí)驗(yàn)是否成功，結(jié)果如何？不成功原因是什么？五、問題1.革蘭氏染色的基本原理是什么？2.大腸桿菌和枯草芽孢桿菌經(jīng)革蘭氏染色后各有什么結(jié)果？3.結(jié)晶紫染色時(shí)間不夠或染色時(shí)間過久會(huì)對(duì)結(jié)果有何影響？4.革蘭氏染色在微生物學(xué)中有何實(shí)踐意義？實(shí)驗(yàn)三 培養(yǎng)基的配制和滅菌一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c要求：（1） 熟悉玻璃器皿的洗滌包裝和滅菌前的準(zhǔn)備工作。（2） 學(xué)習(xí)微生物培養(yǎng)基和無菌水的制備，了解培養(yǎng)基配方中各成分的作用、制備流程及各環(huán)節(jié)的操作技術(shù)與應(yīng)用。（

29、3） 學(xué)習(xí)并掌握培養(yǎng)基的高壓蒸氣滅菌原理、操作關(guān)鍵技術(shù)和滅菌技術(shù)。二、實(shí)驗(yàn)原理培養(yǎng)基的制備原理培養(yǎng)基是按照微生物生長發(fā)育的需要，用不同組分的營養(yǎng)物質(zhì)調(diào)制而成的營養(yǎng)基質(zhì)。人工制備培養(yǎng)基的目的，在于給微生物創(chuàng)造一個(gè)良好的營養(yǎng)條件。把一定的培養(yǎng)基放入一定的器皿中，就提供了人工繁殖微生物的環(huán)境和場所。自然界中，微生物種類繁多，由于微生物具有不同的營養(yǎng)類型，對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的要求也各不相同，加之實(shí)驗(yàn)和研究上的目的不同，所以培養(yǎng)基在組成原料上也各有差異。但是，不同種類和不同組成的培養(yǎng)基中，均應(yīng)含有滿足微生物生長發(fā)育的水分、碳源、氮源、無機(jī)鹽和生長素以及某些特需的微量元素等。此外，培養(yǎng)基還應(yīng)具有適宜的酸堿度(pH

30、值)和一定緩沖能力及一定的氧化還原電位和合適的滲透壓。根據(jù)制備培養(yǎng)基對(duì)所選用的營養(yǎng)物質(zhì)的來源，可將培養(yǎng)基分為天然培養(yǎng)基、半合成培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基三類。按照培養(yǎng)基的形態(tài)可將培養(yǎng)基分為液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基。根據(jù)培養(yǎng)基使用目的，可將培養(yǎng)基分為選擇培養(yǎng)基、加富培養(yǎng)基及鑒別培養(yǎng)基等。培養(yǎng)基的類型和種類是多種多樣的，必須根據(jù)不同的微生物和不同的目的進(jìn)行選擇配制，本實(shí)驗(yàn)分別配制常用培養(yǎng)細(xì)菌、放線菌和真菌的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、高氏一號(hào)合成培養(yǎng)基和馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基等固體培養(yǎng)基。固體培養(yǎng)基是在液體培養(yǎng)基中添加凝固劑制成的，常用的凝固劑有瓊脂、明膠和硅酸鈉，其中以瓊脂最為常用，其主要成份為多糖類物質(zhì)，性質(zhì)較穩(wěn)定，

31、一般微生物不能分解，故用凝固劑而不致引起化學(xué)成份變化。瓊脂在95的熱水中才開始融化，融化后的瓊脂冷卻到45才重新凝固。因此用瓊脂制成的固體培養(yǎng)基在一般微生物的培養(yǎng)溫度范圍內(nèi)(25-37)不會(huì)融化而保持固體狀態(tài)。高壓蒸氣滅菌原理高壓蒸汽滅菌是將待滅菌的物品放在一個(gè)密閉的加壓滅菌鍋內(nèi)，通過加熱，使滅菌鍋隔套間的水沸騰而產(chǎn)生蒸汽。待水蒸汽急劇地將鍋內(nèi)的冷空氣從排氣閥中驅(qū)盡，然后關(guān)閉排氣閥，繼續(xù)加熱，此時(shí)由于蒸汽不能溢出，而增加了滅菌器內(nèi)的壓力，從而使沸點(diǎn)增高，得到高于100的溫度。導(dǎo)致菌體蛋白質(zhì)凝固變性而達(dá)到滅菌的目的。 在同一溫度下，濕熱的殺菌效力比干熱大，其原因有三：一是濕熱中細(xì)菌菌體吸收水分，

32、蛋白質(zhì)較易凝固，因蛋白質(zhì)含水量增加，所需凝固溫度降低(表-2)，二是濕熱的穿透力比干熱大(表-3)；三是濕熱的蒸汽有潛熱存在，每1克水在100時(shí)，由氣態(tài)變?yōu)橐簯B(tài)時(shí)可放出2.26kJ(千焦)的熱量。這種潛熱，能迅速提高被滅菌物體的溫度，從而增加滅菌效力表-2 蛋白質(zhì)含水量與凝固所需溫度的關(guān)系 卵自蛋白含水量(%) 30分鐘內(nèi)凝固所需溫度() 50 25 18 6 0 56 74-80 80-90 145 160-170表-3 干熱與濕熱穿透力及滅菌效果比較溫 度 ()時(shí)間(小時(shí))透過布層的溫度()滅 菌20層40層100層干熱 130-1404867270.5不完全濕熱 105.3310l10l

33、10l完 全 在使用高壓蒸汽滅菌鍋滅菌時(shí)，滅菌鍋內(nèi)冷空氣的排除是否完全極為重要，因?yàn)榭諝馀蛎泬捍笥谒羝呐蛎泬?，所以，?dāng)水蒸汽中含有空氣時(shí)，在同一壓力下，含空氣蒸汽的溫度低于飽和蒸汽的溫度。滅菌鍋內(nèi)留有不同分量空氣時(shí)，壓力與溫度的關(guān)系見表-4。一般培養(yǎng)基用1.05kg/cm2，121.3 15-30分鐘可達(dá)到徹底滅菌的目的。滅菌的溫度及維持的時(shí)間隨滅菌物品的性質(zhì)和容量等具體情況而有所改變。例如含糖培養(yǎng)基用0.56kg/cm2(8磅/英寸2)，112.6滅菌15分鐘，但為了保證效果，可將其他成分先行121.3，20分鐘滅菌，然后以無菌操作手續(xù)加入滅菌的糖溶液。又如盛于試管內(nèi)的培養(yǎng)基以1.05k

34、g/cm2，121.3滅菌20分鐘即可，而盛于大瓶內(nèi)的培養(yǎng)基最好以1.05kg/cm2滅菌30分鐘。表-4滅菌鍋內(nèi)留有不同分量空氣時(shí)，壓力與溫度的關(guān)系壓 力 數(shù)全部空氣排出時(shí)的溫度 ()2/3空氣排出時(shí)的溫度()l/2空氣排出時(shí)的溫度 ()1/3空氣排出時(shí)的溫度 ()空氣全不排出時(shí)的溫度 ()千克(公斤/ 厘米2)(kg/cm2)磅/英寸2(1b/in2)0.350.701.051.401.752.10 51015202530108.8115.6121.3126.2130.0134.61001091151211261309410511211812412890100109115121126729

35、0100109115121 蒸汽壓力所用單位為kg/cm2(千克/厘米2)，它與1b/in2(磅/英寸2)和溫度的換算關(guān)系見表-5。表-5 蒸汽壓力與蒸汽溫度換算關(guān)系 蒸汽壓力 大氣壓壓 力 表 讀 數(shù)蒸汽溫度kg/cm21b/in21.001.251.501.752.002.503.000.000.250.500.751.001.502.000.003.757.5011.2515.0022.5030.00100.0107.0112.0115.0121.0128.0134.5三、實(shí)驗(yàn)器材1、  藥品 瓊脂，10HCL,10% NaOH，牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配方藥品；2、 

36、材料 具刻度1000毫升塘瓷盅或小鋁鍋，電子稱，10×200mm試管，量筒，小燒杯，玻璃棒，骨匙，pH試紙，分裝漏斗，試管盒，紗布，棉花，報(bào)紙，麻繩，標(biāo)簽，培養(yǎng)皿。3、 設(shè)備 高壓蒸汽滅菌鍋、烘箱、冰箱、電爐等四、實(shí)驗(yàn)步驟1、 稱取藥品放在大燒杯中，加入蒸餾水用玻璃棒攪拌并加熱溶化，等藥品溶解后用pH試紙調(diào)節(jié)p H至7.4-7.6，如有沉淀應(yīng)過濾后分裝，每支試管約加入9ml。每組分裝30支，加上棉塞，包上牛皮紙，準(zhǔn)備滅菌。 裝入試管中的量不宜超過試管高度的1/5，裝入三角燒瓶中的量以燒瓶總體積的一半為限。在分裝過程中，應(yīng)注意勿使培養(yǎng)基沾污管口或瓶口、以免弄濕棉塞，造成污染。 2、無菌

37、水準(zhǔn)備 在試管或瓶內(nèi)先盛以適量的蒸餾水或生理鹽水O85NaCl)，蓋好棉塞，包上牛皮紙使其滅菌后，其水量恰為9ml。 每組準(zhǔn)備10支與牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基可放在同一試管架上，以一大張牛皮紙包扎寫上姓名。準(zhǔn)備滅菌。3、高壓滅菌 手提式高壓蒸汽滅菌鍋的使用操作步驟： （1）首先將內(nèi)層滅菌桶取出，再向外層鍋內(nèi)加入適量的水，使水面與三角擱架相平為宜。 （2）放回滅菌桶，并裝入待滅菌物品。注意不要裝得太擠，以免防礙蒸汽流通而影響滅菌效果。三角燒瓶與試管口端均不要與桶壁接觸，以免冷凝水淋濕包口的紙而透入棉塞。 （3）加蓋，并將蓋上的排氣軟管插入內(nèi)層滅菌桶的排氣槽內(nèi)。再以兩兩對(duì)稱的方式同時(shí)旋緊相對(duì)的兩個(gè)螺栓，

38、使螺栓松緊一致，勿使漏氣。 （4）用電爐或煤氣加熱，并同時(shí)打開排氣閥，使水沸騰以排除渦內(nèi)的冷空氣。待冷空氣完全排盡后，關(guān)上排氣閥，讓鍋內(nèi)的溫度隨蒸汽壓力增加而逐漸上升。當(dāng)鍋內(nèi)壓力升到所需壓力時(shí)，控制熱源，維持壓力至所需時(shí)間。本實(shí)驗(yàn)用1.05kg/cm2，121.3，20分鐘滅菌。 （5）滅菌所需時(shí)間到后，切斷電源或關(guān)閉煤氣，讓滅菌鍋內(nèi)溫度自然下降，當(dāng)壓力表的壓力降至0時(shí)，打開排氣閥，旋松螺栓，打開蓋子，取出滅菌物品。如果壓力未降到0時(shí)，打開排氣閥，就會(huì)因鍋內(nèi)壓力突然下降，使容器內(nèi)的培養(yǎng)基由于內(nèi)外壓力不平衡而沖出燒瓶口或試管口，造成棉塞沾染培養(yǎng)基而發(fā)生污染。 （6）將取出的滅菌培養(yǎng)基放入37溫箱

39、培養(yǎng)24小時(shí)，經(jīng)檢查若無雜菌生長，即可待用。五、思考題棉塞的作用？實(shí)驗(yàn)四 水中細(xì)菌總數(shù)的測定一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.學(xué)習(xí)水樣的采取方法和水樣細(xì)菌總數(shù)測定的方法。2.了解水源水的平板菌落計(jì)數(shù)的原理。二、實(shí)驗(yàn)原理本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用平板計(jì)數(shù)技術(shù)測定水中細(xì)菌總數(shù)。由于水中細(xì)菌種類繁多，它們對(duì)營養(yǎng)和其他生長條件的要求差別很大，不可能找到一種培養(yǎng)基在一種條件下，使水中所有的細(xì)菌均能生長繁殖，因此，以一定的培養(yǎng)基平板上生長出來的菌落，計(jì)算出來的水中細(xì)菌總數(shù)僅是一種近似值。目前一般是采用普通牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基。三、試劑與器材1.試劑 牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基，滅菌水牛肉膏 3g 蛋白胨10g NaCl 5g 瓊脂 15-20g 蒸餾水 1000ml（配置1/4量）2.器材 滅菌三角瓶，滅菌的帶玻璃塞瓶，滅菌培養(yǎng)皿，滅菌吸管，滅菌試管等。四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容細(xì)菌總數(shù)是指1ml或1g檢樣中所含細(xì)菌菌落的總數(shù)，所用的方法是稀釋平板計(jì)數(shù)法，由于計(jì)算的是平板上形成的菌落數(shù)，它反應(yīng)的是檢樣中的活菌的數(shù)量。用