基因與病毒復(fù)制的關(guān)系

1、3.1 引言本實(shí)驗(yàn)所研究的BP基因，選自本實(shí)驗(yàn)室博士所做的口蹄疫病毒急性感染BHK-21細(xì)胞和持續(xù)感染BHK-21細(xì)胞的基因芯片檢測結(jié)果。張虎博士已在他的畢業(yè)論文中初步驗(yàn)證了BP基因在口蹄疫病毒持續(xù)性感染（持感細(xì)胞）中下調(diào)，急性感染細(xì)胞（急感細(xì)胞）中上調(diào)，與芯片結(jié)果相符。我們選取BP基因做進(jìn)一步的深入研究，期望能通過檢測其在持感細(xì)胞不同代次中表達(dá)量隨病毒變化的情況，闡明口蹄疫病毒持續(xù)感染與細(xì)胞共存的關(guān)系，也希望得到該基因影響病毒的復(fù)制和持感穩(wěn)態(tài)的結(jié)果。單細(xì)胞實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)可以在單個(gè)細(xì)胞中檢測多個(gè)基因的表達(dá)情況，單細(xì)胞水平的檢測可以揭示在群體情況下被平均化掩蓋的關(guān)鍵現(xiàn)象，是目前用于細(xì)胞基

2、因轉(zhuǎn)錄譜分析的先進(jìn)技術(shù)。如有研究報(bào)道，通過單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄譜分析揭示人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的異質(zhì)性(Narsinh et al., 2011)，細(xì)胞所處的微環(huán)境決定了細(xì)胞在病毒感染過程中表現(xiàn)出的異質(zhì)性(Snijder et al., 2009)，這些關(guān)鍵現(xiàn)象都是在群體水平的研究中無法展現(xiàn)出來的問題。而單個(gè)細(xì)胞中基因表達(dá)量的絕對拷貝數(shù)更能真實(shí)的反應(yīng)群體細(xì)胞之間存在的差異性，而這種差異性在其與病毒或者環(huán)境的相互作用時(shí)，是否會提供進(jìn)化上的優(yōu)勢，也是我們研究持續(xù)感染時(shí)所感興趣的科學(xué)問題。3.2 材料和方法3.2.1 材料1病毒與細(xì)胞系O型口蹄疫病毒來自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所。敘利亞倉鼠腎細(xì)胞系（BHK-21

3、）來自中國典型培養(yǎng)物保藏中心。持續(xù)感染口蹄疫病毒的BHK-21細(xì)胞系（PI）由本實(shí)驗(yàn)室黃璇博士建立并保存。2試劑細(xì)胞培養(yǎng)基（MEM），胰酶和磷酸鹽緩沖液（PBS）均購自GIBCO公司。胎牛血清購自四季青公司。RNase-free H2O 購自TaKaRa公司。ReverTra Ace® qPCR RT Kit，THUNDERBIRD® SYBR®qPCR Mix，THUNDERBIRD® Probe qPCR Mix均購自TOYOBO公司。細(xì)胞總RNA裂解液Trizol購自Invitrogen公司。苯酚，氯仿和乙醇均購自國藥公司。引物，探針合成

4、自Life公司。3.儀器CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（2300型）購自Sheldon Manufacturing公司。生物安全柜（ClassBiohazad safty cabinet）購自ESCO公司。程控降溫儀KRYO 560-16購自Planer公司。超低溫-70冰箱和NanoDrop2000c均購自Thermo公司。普通冰箱購自伊萊克斯公司。臺式小型冷凍離心機(jī)購自Eppendorf公司。熒光定量PCR儀（CFX96）購自Bio-Rad公司。PCR儀（T-Gradient Thermoblock）購自Biometra公司。毛細(xì)管購自南京泉水教學(xué)實(shí)驗(yàn)器材廠。顯微操縱儀、顯微注射儀、拉針器和磨針儀是Na

5、rashige公司的產(chǎn)品。倒置光學(xué)顯微鏡購自O(shè)lympus公司。3.2.2 方法3.2.2.1 TCID50實(shí)驗(yàn)將BHK-21細(xì)胞接種于96孔板中，置于37 5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，匯合度至70%左右即可進(jìn)行病毒接種。將收集到的持感病毒進(jìn)行10倍梯度稀釋。棄去96孔板中的上清液，用PBS洗兩次，加入不同稀釋度的病毒液100L，每個(gè)稀釋度感染8個(gè)復(fù)孔。對照組用100L無血清的MEM代替病毒液，37 5%CO2培養(yǎng)箱孵育1h，然后補(bǔ)加新鮮的含5%FBS的MEM培養(yǎng)基100L。置于37 5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)72h后，用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞病變情況，并做記錄。最后，按照Reed-Muench公式計(jì)算

6、TCID50值。3.2.2.2 單細(xì)胞的挑取和裂解1.單細(xì)胞貯存液的制備在挑取單細(xì)胞前，需預(yù)先分好單細(xì)胞的儲存液，儲存液的配置比例為5%的RNase抑制劑和95%的RNase-free H2O。將混合好的儲存液分到RNase-free PCR管中，每管5L，一批32個(gè)PCR管，放入4冰箱待用。2. 單細(xì)胞的挑取所有被挑取的細(xì)胞均是在T25瓶中生長至傳代匯合度，去掉培養(yǎng)基加入1mL胰酶消化5min細(xì)胞變圓脫落后，向培養(yǎng)瓶中加入9mL10% FBS的新鮮MEM培養(yǎng)基中和，充分吹散細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為104-105個(gè)/mL，然后取1mL細(xì)胞懸液于直徑6cm的無菌培養(yǎng)皿中，進(jìn)行單細(xì)胞的挑取。用拉針器和

7、磨針儀制作精細(xì)的細(xì)胞挑針，通過與顯微注射儀連接的倒置顯微鏡可直接觀察到待分離的細(xì)胞并能隨時(shí)監(jiān)控整個(gè)分離挑取單細(xì)胞的過程，準(zhǔn)確快速地獲得所需的單細(xì)胞樣品。具體操作步驟是首先將細(xì)胞挑針與顯微操縱儀的右導(dǎo)管相連，調(diào)節(jié)顯微注射儀的平衡（balance）旋鈕使提供的平衡壓減?。幢憩F(xiàn)為毛細(xì)管向內(nèi)吸液），然后再將挑針前端伸入培養(yǎng)皿中至液面下，在顯微鏡下挑取單個(gè)細(xì)胞。吸入一個(gè)單細(xì)胞后，將帶有單細(xì)胞的挑針提起伸入RNase-free PCR管液面下，增大平衡壓，將細(xì)胞吹入盛有細(xì)胞儲存液的PCR管中，即完成一個(gè)細(xì)胞的挑取，當(dāng)完成一批32個(gè)細(xì)胞的挑取時(shí)，一輪單細(xì)胞的挑取即完成，需馬上進(jìn)行后續(xù)處理。3. 單細(xì)胞的裂

8、解一批32個(gè)細(xì)胞的挑取一般控制在30min內(nèi)完成，在此時(shí)間內(nèi)細(xì)胞能最大限度的維持原狀。首先，將單細(xì)胞樣品放入PCR儀中，進(jìn)行98熱變性處理，使細(xì)胞膜破裂，熱處理3min后再浸入液氮速凍3min。然后取出放入37水浴鍋中溶解1min,如此反復(fù)循環(huán)三次。得到的裂解好的單細(xì)胞樣品可暫時(shí)放置于-80冰箱保存，直至進(jìn)行后續(xù)熒光定量RT-PCR的檢測。3.2.2.3 單細(xì)胞技術(shù)運(yùn)用于群體細(xì)胞的挑取和裂解將單細(xì)胞技術(shù)運(yùn)用于群體細(xì)胞的挑取，將細(xì)胞貯存液體積等比例放大，即挑取10個(gè)細(xì)胞到50L貯存液，50個(gè)細(xì)胞到250L貯存液，貯存液的配置方法如前所述。群體細(xì)胞的裂解方法也與單細(xì)胞相同。3.2.2.4 群體細(xì)胞

9、的相對熒光定量RT-PCR檢測1.逆轉(zhuǎn)錄取1ugRNA加入無RNA酶的PCR管中，補(bǔ)RNase-free H2O至7L。放入PCR儀中，65反應(yīng)5min，然后置于冰上。該步驟可以破壞RNA的二級結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)逆轉(zhuǎn)錄酶的反應(yīng)效率。然后每管加入反應(yīng)體系：5 x RT Buffer 2L RT Enzyme Mix 0.5L Primer Mix 0.5L 總體積 10L然后混勻組分放入PCR儀中 37 °C 15 min 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，98 °C 5 min 滅活逆轉(zhuǎn)錄酶。最后將cDNA置于4 °C 或 20 °C保存。2.定量PCR檢測先將cDNA稀釋10倍。在

10、相對熒光定量PCR中，每個(gè)樣品的cDNA既要檢測內(nèi)參基因（GAPDH），還要檢測目的基因（BP）。相對定量不需要標(biāo)曲，只得到目的基因在不同細(xì)胞中表達(dá)量的相對變化情況。內(nèi)參基因的檢測是為了去除細(xì)胞量的影響，在這里需假設(shè)內(nèi)參基因在細(xì)胞量一致的情況下，表達(dá)量是相同的。不同基因反應(yīng)組分的配比和實(shí)驗(yàn)條件均是相同的。只是在PCR過程中，分別使用各自的引物即可。具體反應(yīng)體系如下：THUNDERBIRD® SYBR®qPCR Mix 12.5LForward Primer（25M）0.5LReverse Primer（25M）0.5L cDNA樣品5L RNase-free H20 6.5

11、L總體積 25LPCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 1min95 15s60 1min 讀取熒光值 39cycles60到95每增加0.5反應(yīng)0.05s然后讀取熒光信號。做相對熒光定量PCR時(shí)需繪制出每個(gè)樣品的溶解曲線來確定樣品是否被專一的擴(kuò)增。3.2.2.5 單細(xì)胞實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR本實(shí)驗(yàn)采取兩步法，首先將單細(xì)胞的RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，合成其cDNA鏈，然后將cDNA稀釋，分成三份分別檢測三個(gè)不同基因（GAPDH，BP，F(xiàn)MDV-3D）的表達(dá)水平。引入看家基因甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）作為對照基因以確保分離裂解單細(xì)胞過程的真實(shí)有效。GAPDH和FMDV-3D基因的單細(xì)胞熒光定量檢測方法是本實(shí)

12、驗(yàn)室已建立的成熟技術(shù)。檢測GAPDH的引物序列為：上游引物，F(xiàn)P-GAPDH:5-AAGGCCATCACCATCTTCCA-3下游引物，RT-GAPDH: 5-GCCAGTAGACTCCACAACATAC -3熒光探針序列為:Probe-GAPDH:5FAM-AGCGAGATCCCACCAACATCAAATGGG-BHQ1-3擴(kuò)增子的大小為87bp。檢測FMDV-3D的引物序列為：上游引物，F(xiàn)P-3D： 5-GAACACATTCTTTACACCAGGAT -3下游引物，RT-3D： 5-CATATCTTTGCCAATCAACATCAG -3熒光探針序列為：Probe-3D：5FAM-ACAAC

13、CTACCGCCGAGCCAATTC-TAMRA -3擴(kuò)增子的大小為121bp。BP基因的序列相關(guān)信息見2.2.2.4本實(shí)驗(yàn)的第一步逆轉(zhuǎn)錄過程，運(yùn)用ReverTra Ace® qPCR RT Kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒對細(xì)胞內(nèi)的所有RNA進(jìn)行無差別的逆轉(zhuǎn)錄。具體反應(yīng)體系和步驟如下：先將含有5L單細(xì)胞裂解液的PCR管放入PCR儀中，65反應(yīng)5min，然后置于冰上。該步驟可以破壞RNA的二級結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)逆轉(zhuǎn)錄酶的反應(yīng)效率。然后每管加入反應(yīng)體系：Nuclease-free H20 2L 5 x RT Buffer 2L RT Enzyme Mix 0.5L Primer Mix 0.5L

14、總體積 10L混勻組分放入PCR儀中， 37 °C 15 min 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，98 °C 5 min 滅活逆轉(zhuǎn)錄酶。最后將cDNA置于4 °C 或 20 °C保存。第二步qPCR過程是在Bio-Rad CFX96熒光定量PCR儀中進(jìn)行的。樣品cDNA先需加入5L Nuclease-free H20稀釋混勻，標(biāo)準(zhǔn)品為體外克隆得到的質(zhì)粒DNA。具體反應(yīng)體系如下：THUNDERBIRD® Probe qPCR Mix 12.5L Forward Primer（25M） 0.5LReverse Primer （25M） 0.5L Probe 0.25L

15、 cDNA樣品/標(biāo)準(zhǔn)品 5LRNase-free H20 6.25L總體積 25LqPCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 1min95 15s60 1min 讀取熒光值 39cycles3.3 結(jié)果與分析3.3.1 持感細(xì)胞胞外病毒的感染性實(shí)驗(yàn)將PI22、PI33、PI58代次持感細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)的上清液轉(zhuǎn)移至T25瓶BHK-21細(xì)胞中，12h后觀察持感細(xì)胞胞外病毒對正常BHK-21細(xì)胞的細(xì)胞致病變效應(yīng)（CPE）。如圖3-1，持續(xù)感染細(xì)胞上清液中有口蹄疫病毒感染性顆粒的釋放，該持感病毒可以使正常BHK-21發(fā)生CPE。圖3-1 持感細(xì)胞上清液感染正常BHK-21細(xì)胞照片(感染12h，×100)A：正常B

16、HK-21細(xì)胞，B：持感細(xì)胞PI22代次感染BHK-21細(xì)胞，C：持感細(xì)胞PI33代次感染BHK-21細(xì)胞，D：持感細(xì)胞PI58代次感染BHK-21細(xì)胞3.3.2持感細(xì)胞胞內(nèi)病毒載量的檢測然后，我們選取持感細(xì)胞PI32，PI48，PI63代次測定胞內(nèi)活病毒的載量。取匯合度達(dá)90%的三種細(xì)胞T25瓶，棄去上清液，加入6mL無血清新鮮MEM培養(yǎng)基，于-80冰箱冷凍過夜。裂解細(xì)胞，收集病毒液，分管保存在-80冰箱，取一只用于TCID50的檢測。結(jié)果如圖3-1，三個(gè)代次持感細(xì)胞胞內(nèi)均含有具有感染性的活病毒，其中PI32代次時(shí)胞內(nèi)病毒載量最低，為每毫升病毒原液含102.75個(gè)活病毒。PI48代次時(shí)病毒載

17、量最高，為每毫升病毒原液含103.6個(gè)活病毒。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果還證明了持感細(xì)胞胞內(nèi)的病毒具有感染正常BHK-21細(xì)胞的能力。圖3-2不同代次病毒持感細(xì)胞胞內(nèi)病毒載量(TCID50滴度)3.3.3單細(xì)胞與群體細(xì)胞數(shù)據(jù)平均化后的比較用單細(xì)胞技術(shù)挑取群體細(xì)胞10個(gè)和50個(gè)各三組，使用單細(xì)胞裂解方法獲得細(xì)胞RNA、逆轉(zhuǎn)錄、熒光定量PCR測定GAPDH基因和BP基因的表達(dá)量。將單細(xì)胞的值平均化與群體細(xì)胞平均值做對比，發(fā)現(xiàn)如圖3-3，單細(xì)胞的均值并不在群體細(xì)胞均值繪制的趨勢線上，單細(xì)胞數(shù)據(jù)具有相當(dāng)大的標(biāo)準(zhǔn)偏差，這是細(xì)胞異質(zhì)性的表現(xiàn)。群體細(xì)胞的平均值無法體現(xiàn)細(xì)胞的異質(zhì)性，單個(gè)細(xì)胞基因的表達(dá)是具有波動性的。對單個(gè)

18、細(xì)胞基因表達(dá)量的研究更能發(fā)現(xiàn)細(xì)胞與細(xì)胞之間的差異性，而這種差異往往被群體實(shí)驗(yàn)方法的隨意平均化所掩蓋。圖3-3單細(xì)胞和群體細(xì)胞的平均基因表達(dá)（單細(xì)胞：平均值±方差；10、50群體細(xì)胞：平均值±方差）3.3.4 正常BHK-21細(xì)胞與不同代次持感細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征挑選的正常細(xì)胞和持感細(xì)胞都是狀態(tài)良好，且具有代表意義的（圖3-4）。PI28代次是持續(xù)感染建立已經(jīng)穩(wěn)定的早中期，在初期持續(xù)感染的建立過程中，前10代次的傳代都是需要加入誘導(dǎo)持感形成的試劑NH4Cl的。故10代之后的細(xì)胞在很長一段時(shí)間的傳代時(shí)還需一個(gè)適應(yīng)的過程，即適應(yīng)沒有NH4Cl堿性選擇環(huán)境。因此，20代次前仍然是持感細(xì)

19、胞的不穩(wěn)定狀態(tài)，故選取早代次持感細(xì)胞時(shí)從PI28代次開始。持感細(xì)胞在傳代到末期時(shí)會發(fā)生兩種情況，一種是脫毒，這種情況并不是培養(yǎng)方式不當(dāng)產(chǎn)生的，Domingo實(shí)驗(yàn)室建立的C型口蹄疫持感細(xì)胞在傳代過程中也會發(fā)生脫毒現(xiàn)象，該現(xiàn)象被認(rèn)為是細(xì)胞進(jìn)化的結(jié)果，脫毒后的細(xì)胞與正常細(xì)胞相比對野生型病毒和持感病毒都表現(xiàn)出更強(qiáng)的抵抗力(de la Torre et al., 1985; Herrera et al., 2008)。第二種情況是，發(fā)生致細(xì)胞病變現(xiàn)象(CPE)。該現(xiàn)象產(chǎn)生的原因應(yīng)該是細(xì)胞與病毒共生的平衡被打破，細(xì)胞不再耐受病毒的持續(xù)感染，選擇了死亡的方式?；谏鲜鰞牲c(diǎn)的考慮，我們選取的持感晚代次在PI6

20、8代次。本實(shí)驗(yàn)對持感細(xì)胞的研究跨越40個(gè)代次，已包括持感細(xì)胞生活周期的所有典型時(shí)期，具有代表意義。圖3-4的形態(tài)學(xué)照片顯示，PI28細(xì)胞，PI38細(xì)胞，PI55細(xì)胞，PI68細(xì)胞與正常BHK-21細(xì)胞的形態(tài)無明顯差異，具備病毒持續(xù)感染細(xì)胞的基本特征。圖3-4. 正常BHK-21與持感細(xì)胞形態(tài)學(xué)照片(×100)A:正常BHK-21細(xì)胞，B:PI28細(xì)胞，C:PI38細(xì)胞，D:PI55細(xì)胞，E:PI68細(xì)胞3.3.5正常BHK-21細(xì)胞和不同代次的持感細(xì)胞中BP基因和病毒3D基因的表達(dá)量差異病毒持感細(xì)胞隨著傳代的進(jìn)行，病毒量在不同代次中會發(fā)生變化，本實(shí)驗(yàn)室黃璇博士論文中已有相關(guān)結(jié)果。首先

21、我們想知道在病毒持感群體水平，宿主細(xì)胞BP基因在不同代次之間的表達(dá)量和病毒量之間是什么關(guān)系。用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR的方法檢測了細(xì)胞BP基因和病毒3D蛋白的表達(dá)量，結(jié)果如圖3-4顯示，BP基因在PI55代次細(xì)胞中表達(dá)量最高，其次是PI38代，而PI68代次表達(dá)量最低。同時(shí)3D基因的表達(dá)與BP基因趨勢一致的有PI28代次和PI68代次，表達(dá)量都是BP基因低時(shí)，3D基因的表達(dá)量也低。在所有檢測的持感代次中，病毒量最高的代次是PI38代次，這與實(shí)驗(yàn)室黃璇博士畢業(yè)論文中所描述的持感PI36代時(shí)病毒量達(dá)到頂峰的結(jié)果相一致。這些代次的持感細(xì)胞在收取群體樣品時(shí)，分別進(jìn)行了單細(xì)胞的挑取。我們試圖用單細(xì)胞分析

22、技術(shù)窺探宿主BP基因與病毒3D基因的關(guān)系，初步探討B(tài)P基因與持感的建立和穩(wěn)定傳代之間的關(guān)系，揭示影響宿主與病毒共進(jìn)化進(jìn)程的內(nèi)在因素。AB圖3-5. 正常BHK-21細(xì)胞與持感不同代次群體細(xì)胞中BP基因和口蹄疫病毒3D基因的表達(dá)量A：正常BHK-21細(xì)胞與持感不同代次群體細(xì)胞中BP基因的表達(dá)量 B：正常BHK-21細(xì)胞與持感不同代次群體細(xì)胞中3D基因的表達(dá)量3.3.6 正常BHK-21細(xì)胞與傳代持感單細(xì)胞中BP基因和FMDV-3D基因的正態(tài)分布在2005年，Martin Bengtsson發(fā)表了一篇在單細(xì)胞領(lǐng)域造成深遠(yuǎn)影響的文章，指出來自拉格漢斯胰島（The pancreatic islets

23、of Langerhans）的單細(xì)胞基因表達(dá)譜揭示mRNA水平的對數(shù)分布特性(Bengtsson et al., 2005)。為了呈現(xiàn)單細(xì)胞群體的基因表達(dá)譜，我們繪制了正常細(xì)胞與各代次持感細(xì)胞BP基因和3D基因的正態(tài)分布圖(圖3-6)。在對數(shù)正態(tài)分布中，隨機(jī)獨(dú)立性是趨于增加的，同時(shí)它們是正常分布的附加產(chǎn)物。細(xì)菌不同克隆之間指數(shù)生長的細(xì)菌數(shù)呈現(xiàn)對數(shù)正態(tài)分布就是生物系統(tǒng)中的一個(gè)經(jīng)典例子(Limpert et al., 2001)。細(xì)胞中mRNA水平基因表達(dá)的這種變化反應(yīng)了真實(shí)的生物差異（biological variability）。如圖3-6，本實(shí)驗(yàn)研究的五組細(xì)胞兩種基因的表達(dá)也均符合正態(tài)分布，

24、單細(xì)胞數(shù)據(jù)真實(shí)有效，隨后對其進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與分析并繪制相互關(guān)系圖。符合對數(shù)分布的群體其峰值與幾何平均值相當(dāng)，即代表大部分細(xì)胞所分布的范圍。如圖3-6所示，在BP基因的正態(tài)分布圖中，只有PI28代次的峰值（Log2.3）在正常BHK-21（Log2）右側(cè)，說明PI28代次時(shí)陽性細(xì)胞中BP基因的表達(dá)量比正常細(xì)胞要高。在3D基因的正態(tài)分布圖中，PI38代次的峰值（Log2.6）最靠右，PI68代次的峰值（Log1.7）最靠左，幾乎相差了一個(gè)數(shù)量級，它們代表了口蹄疫病毒3D基因表達(dá)量最高和最低的兩個(gè)細(xì)胞代次。表3-1的數(shù)據(jù)是根據(jù)正態(tài)分布圖中的細(xì)胞數(shù)統(tǒng)計(jì)的，顯示各代次細(xì)胞兩種基因的陽性率情況和單細(xì)胞平均值。所

25、有單細(xì)胞均檢測了其看家基因（GAPDH）的表達(dá)，參與統(tǒng)計(jì)的數(shù)據(jù)均代表一個(gè)細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)的真實(shí)情況。數(shù)據(jù)顯示，正常BHK-21細(xì)胞中BP的檢出率最高，有96.8%的細(xì)胞都檢測到了BP基因的表達(dá)。而持感細(xì)胞中BP的檢出率都比正常細(xì)胞要低，可見，病毒的存在對宿主細(xì)胞BP基因的表達(dá)是有影響的。表達(dá)病毒3D蛋白的細(xì)胞比率隨著持感代次的增長而趨于穩(wěn)定，在早代次持感細(xì)胞PI28中，只有66.7%的細(xì)胞檢測到病毒3D蛋白，說明此時(shí)的持感細(xì)胞一個(gè)混合群體，其中即有攜帶病毒的持感細(xì)胞，也還存在正常未感染病毒的正常細(xì)胞。而當(dāng)代次到達(dá)38代時(shí)，幾乎所有細(xì)胞都能檢測到病毒3D基因的表達(dá)，此時(shí)的持感細(xì)胞已可以說處于病毒與

26、細(xì)胞共生的穩(wěn)定狀態(tài)，高代次持感細(xì)胞病毒3D基因的檢測，也得到相同的結(jié)果，證實(shí)口蹄疫病毒穩(wěn)定存在于宿主細(xì)胞中，形成穩(wěn)定的持續(xù)感染狀態(tài)。而宿主BP基因的表達(dá)量卻是隨著持續(xù)感染細(xì)胞代次的升高逐漸降低的。AB圖3-6. 正常細(xì)胞與各代次持感細(xì)胞BP基因和3D基因的正態(tài)分布圖A：正常細(xì)胞與各代次持感細(xì)胞BP基因的正態(tài)分布圖；B：正常細(xì)胞與各代次持感細(xì)胞3D基因的正態(tài)分布圖表3-1正常細(xì)胞和各代次持感細(xì)胞單細(xì)胞數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)BHK-21PI28PI38PI55PI68細(xì)胞樣品總數(shù)(411)9381798771BP陽性細(xì)胞數(shù)（337）（陽性率）90(96.8%)65(80.2%)55(69.6%）72(82.8%

27、)55(77.5%）3D陽性細(xì)胞數(shù)（287）（陽性率）N/A54(66.7%）78(98.7%)87(100%)68(95.8%)BP平均（copies/cell）17321510160463D平均（copies/cell）N/A42616246682003.3.7 各代次持感單細(xì)胞BP基因與3D基因的關(guān)系分析散點(diǎn)圖3-7是以口蹄疫病毒3D基因的表達(dá)量為X軸，以BHK-21細(xì)胞BP基因的表達(dá)量為Y軸繪制而成的。同時(shí)以PI28代次3D基因的單細(xì)胞平均值繪制一條與X軸相交的豎線，以正常細(xì)胞BP基因的單細(xì)胞平均值繪制另一條與Y軸相交的橫線。如將該散點(diǎn)圖分成四個(gè)象限，R1，R2，R3，R4。R1代表B

28、P表達(dá)量高/3D表達(dá)量低區(qū)域，R2代表BP表達(dá)量高/3D表達(dá)量高區(qū)域，R3代表BP表達(dá)量低/3D表達(dá)量低區(qū)域，R4代表BP表達(dá)量低/3D表達(dá)量高區(qū)域。扇形圖則是將分布于4個(gè)區(qū)域中的細(xì)胞計(jì)數(shù)，計(jì)算出百分比含量后繪制而成的。圖3-7. 傳代持感單細(xì)胞BP基因相對病毒3D基因散點(diǎn)分布圖和扇形圖A、B、C、D：分別為PI28、PI38、PI55、PI68代次持感細(xì)胞的散點(diǎn)圖；E、F、G、H：分別為PI28、PI38、PI55、PI68代次持感細(xì)胞的扇形圖從圖3-7中可以看出，在持感細(xì)胞PI28代次時(shí)，BP基因上調(diào)的細(xì)胞比例（圖E：R1+R2）最大，有高達(dá)62.9%的細(xì)胞都分布在正常BHK-21細(xì)胞BP

29、基因均值線以上。當(dāng)持感細(xì)胞傳代至PI38代時(shí)，宿主BP基因的表達(dá)逐漸降低，表達(dá)量低于正常細(xì)胞均值的細(xì)胞（圖F：R3+R4）占總數(shù)的78.2%。單細(xì)胞中病毒3D基因表達(dá)量高于PI28代次單細(xì)胞的均值的細(xì)胞比例（圖F：R2+R4）為66.7%，單個(gè)細(xì)胞中3D基因的含量最高值達(dá)17576 copies/cell。當(dāng)持感細(xì)胞代次到達(dá)PI55和PI68時(shí)，病毒與宿主細(xì)胞已趨于平衡，宿主BP基因和口蹄疫病毒3D基因的表達(dá)均逐漸降低，在PI68代次時(shí)降至最低值。宿主BP基因下調(diào)細(xì)胞比例（圖H：R3+R4）為95.6%，病毒3D基因下調(diào)細(xì)胞（圖H：R1+R3）比例為91.2%。其中代表BP基因和3D基因均上調(diào)

30、的R2區(qū)域的細(xì)胞數(shù)在PI68代次時(shí)下降到了0。代表BP基因和3D基因均下調(diào)的R3區(qū)域所占的比例隨著持感代次的增加而增加，在PI68代次中達(dá)到了86.8%。這種數(shù)據(jù)只有從單細(xì)胞水平的檢測分析中才能得到。3.4 討論本實(shí)驗(yàn)選取了持感細(xì)胞傳代過程中具有代表性的幾個(gè)代次，來深入研究持感細(xì)胞不同代次中宿主BP基因與病毒3D基因的相互關(guān)系。選取的持感細(xì)胞涵蓋早中晚四個(gè)代次，橫跨40代，每個(gè)代次檢測的單細(xì)胞數(shù)量均在70個(gè)以上，總計(jì)檢測持感單細(xì)胞樣品318個(gè)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。并與正常BHK-21單細(xì)胞結(jié)果，一起做了比較與分析。對每一個(gè)單細(xì)胞我們都同時(shí)檢測了看家基因(GAPDH)，宿主基因（BP）和口蹄疫病毒基

31、因（3D）?？醇一虻臋z測使單細(xì)胞的數(shù)據(jù)更可信也更有說服力，也是我們確定BP基因陰性和3D基因陰性的依據(jù)。在持感細(xì)胞不同代次中，宿主BP基因和口蹄疫病毒3D基因的表達(dá)量都符合正態(tài)分布的規(guī)律，與文獻(xiàn)報(bào)道的相符。然后我們運(yùn)用該數(shù)據(jù)將所有代次持感細(xì)胞的BP基因的表達(dá)量相對于病毒3D基因作圖，得到了兩個(gè)基因在持感細(xì)胞不同代次中表達(dá)量的變化情況。通過對持續(xù)感染細(xì)胞代次由低到高的跟蹤檢測，發(fā)現(xiàn)在病毒與細(xì)胞共進(jìn)化的過程中，存在病毒復(fù)制效率與宿主細(xì)胞基因表達(dá)之間相互制約的過程。單細(xì)胞水平的實(shí)驗(yàn)結(jié)果充分證實(shí)，持感細(xì)胞在其早代次PI28代時(shí)并不是每個(gè)細(xì)胞都感染上了病毒，3D基因的陽性率為66.7%，在持感細(xì)胞群體中還存在約三分之一的未感染細(xì)胞，這些未感染細(xì)胞會被持感病毒感染，成為新的持感細(xì)胞。有諸多研究表明，在持感形成的過程中細(xì)胞起到關(guān)鍵性的作用，是因?yàn)榧?xì)胞自