地中海貧血的分子基礎(chǔ)及產(chǎn)前診斷徐湘民

1、 和和 地中海貧血的分子基礎(chǔ)地中海貧血的分子基礎(chǔ)及產(chǎn)前診斷及產(chǎn)前診斷 徐湘民徐湘民南方醫(yī)科大學(xué)，醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)教研室南方醫(yī)科大學(xué)，醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)教研室南方醫(yī)院產(chǎn)前診斷和遺傳病診斷技術(shù)中心南方醫(yī)院產(chǎn)前診斷和遺傳病診斷技術(shù)中心遺傳性血紅蛋白病遺傳性血紅蛋白病genetic disorders of human hemoglobin 異常血紅蛋白異常血紅蛋白 abnormal hemoglobin, structural variants 地中海貧血地中海貧血 (地貧地貧) 遺傳性持續(xù)性胎兒血紅蛋白遺傳性持續(xù)性胎兒血紅蛋白 hereditary persistence of fetal hemoglobin

2、(hpfh)thalassemia地中海貧血是全球最大的單基因遺傳病之一地中海貧血是全球最大的單基因遺傳病之一中國(guó)南方不同高發(fā)地中國(guó)南方不同高發(fā)地區(qū)人群攜帶率區(qū)人群攜帶率 1 23%研究背景研究背景研究背景研究背景研究背景研究背景全球血紅蛋白病人群負(fù)荷全球血紅蛋白病人群負(fù)荷whowho地區(qū)地區(qū)人口人口( (百萬(wàn)百萬(wàn)) )出生出生( (百萬(wàn)百萬(wàn)) )純合子出生純合子出生( (千千) )非洲非洲65030.0230美洲美洲73017.55.0亞洲亞洲315084.0120.0歐洲歐洲78011.01.6大洋洲大洋洲300.50.2合計(jì)合計(jì)5340143.0356.8中國(guó)南方地中海貧血人群攜帶率中國(guó)

3、南方地中海貧血人群攜帶率 地區(qū)地區(qū)攜帶率攜帶率(%)(%) 地貧地貧 地貧地貧 廣東廣東 8.53 2.54 廣西廣西 14.95 6.78 四川四川 1.92 2.18 臺(tái)灣臺(tái)灣 4.20 1.10 香港香港 5.02 3.41xu, et al. j clin pathol 2004, 57:517-22. cai, et al. chi j epidemiol 2002,23:281-5. 排序排序出生缺陷分析出生缺陷分析例數(shù)例數(shù)發(fā)生頻率發(fā)生頻率(/(/萬(wàn)萬(wàn)) )1先天性心臟病先天性心臟病26019.662重型重型 地貧地貧 20815.733多指多指20015.124肢體短縮肢體短縮1

4、11 8.395唇裂唇裂 / 腭裂腭裂109 8.24廣州市主要出生缺陷的發(fā)生率廣州市主要出生缺陷的發(fā)生率 (1998-2001) pedigree for -thalassemia in a typical family. 地中海貧血地中海貧血: : 常染色體隱性遺傳病常染色體隱性遺傳病地貧是嚴(yán)重致死地貧是嚴(yán)重致死、致殘性遺傳性血液病致殘性遺傳性血液病 常染色體隱性遺傳病常染色體隱性遺傳病 受累基因：受累基因： 突變純合子：突變純合子： 病理學(xué)基礎(chǔ)：病理學(xué)基礎(chǔ)： / /鏈比例失衡鏈比例失衡地貧純合子：致死性出生缺陷地貧純合子：致死性出生缺陷重型重型 地貧地貧:胎兒水腫綜合征胎兒水腫綜合征 早

5、產(chǎn)死胎或出生前后死亡早產(chǎn)死胎或出生前后死亡 可導(dǎo)致嚴(yán)重產(chǎn)科并發(fā)癥可導(dǎo)致嚴(yán)重產(chǎn)科并發(fā)癥 無(wú)理想治療方法無(wú)理想治療方法重型重型 地貧地貧 出生后出生后1 1年內(nèi)發(fā)病年內(nèi)發(fā)病 多于未成年前因嚴(yán)重貧血而夭折多于未成年前因嚴(yán)重貧血而夭折 輸血和去鐵治療可維持輸血和去鐵治療可維持, ,代價(jià)昂貴代價(jià)昂貴家系樣品采集現(xiàn)場(chǎng)家系樣品采集現(xiàn)場(chǎng)研究地中海貧血的意義研究地中海貧血的意義 重癥地貧患兒的出生是世界公認(rèn)的公共衛(wèi)生問(wèn)題重癥地貧患兒的出生是世界公認(rèn)的公共衛(wèi)生問(wèn)題 通過(guò)產(chǎn)前診斷阻止重癥患兒出生是首選預(yù)防措施通過(guò)產(chǎn)前診斷阻止重癥患兒出生是首選預(yù)防措施 who優(yōu)先推薦在發(fā)展中國(guó)家實(shí)施預(yù)防的遺傳性疾病優(yōu)先推薦在發(fā)展中國(guó)

6、家實(shí)施預(yù)防的遺傳性疾病 預(yù)防地貧是中國(guó)南方高發(fā)區(qū)減少出生缺陷的戰(zhàn)略需求預(yù)防地貧是中國(guó)南方高發(fā)區(qū)減少出生缺陷的戰(zhàn)略需求研究背景研究背景研究背景研究背景研究背景研究背景中國(guó)需要解決的研究主題中國(guó)需要解決的研究主題 發(fā)展用于臨床和預(yù)防的分子診斷技術(shù)發(fā)展用于臨床和預(yù)防的分子診斷技術(shù) 高發(fā)地區(qū)人群中的遺傳流行病學(xué)調(diào)查高發(fā)地區(qū)人群中的遺傳流行病學(xué)調(diào)查 開(kāi)展人群水平的地中海貧血預(yù)防開(kāi)展人群水平的地中海貧血預(yù)防指導(dǎo)制定計(jì)劃指導(dǎo)制定計(jì)劃大人群監(jiān)控和預(yù)防大人群監(jiān)控和預(yù)防 診斷診斷 篩查篩查 預(yù)防預(yù)防地中海貧血的研究策略地中海貧血的研究策略研究背景研究背景研究背景研究背景研究背景研究背景遺傳流行病學(xué)調(diào)查遺傳流行病學(xué)

7、調(diào)查建立一系列診斷標(biāo)準(zhǔn)和診斷技術(shù)建立一系列診斷標(biāo)準(zhǔn)和診斷技術(shù)地中海貧血的臨床特征地中海貧血的臨床特征小細(xì)胞低色素性溶血型貧血小細(xì)胞低色素性溶血型貧血( (中、重度中、重度) )黃疸黃疸肝脾腫大肝脾腫大 ( (脾大明顯脾大明顯) )骨髓擴(kuò)增骨髓擴(kuò)增發(fā)育遲緩發(fā)育遲緩合并感染合并感染barts barts 水腫胎水腫胎(地貧地貧, ,宮內(nèi)或出生后半小時(shí)內(nèi)死亡宮內(nèi)或出生后半小時(shí)內(nèi)死亡) )地中海貧血的血液學(xué)表型特征地中海貧血的血液學(xué)表型特征 rbc 參數(shù)參數(shù) mcv mch 細(xì)胞形態(tài)變化細(xì)胞形態(tài)變化 hb電泳分析電泳分析 hb a2 ( ) 或或 ( ) hb barts hb h ( ) hb e

8、( ) 地貧血象：紅細(xì)胞著色不足、異形紅細(xì)胞和骨髓成紅血細(xì)胞增多癥地貧血象：紅細(xì)胞著色不足、異形紅細(xì)胞和骨髓成紅血細(xì)胞增多癥血紅蛋白電泳圖譜血紅蛋白電泳圖譜1 2 3 4 51. 正常人正常人hb2. 輕型輕型 地貧地貧 3. 異常異常hb e 雜合子雜合子4. 新生兒新生兒hb barts ( 地貧標(biāo)準(zhǔn)型地貧標(biāo)準(zhǔn)型）5. hb hnormal aa2 ae barts af ha+ +- -500v, 25min地貧地貧發(fā)生的發(fā)生的分子病理學(xué)經(jīng)典機(jī)制分子病理學(xué)經(jīng)典機(jī)制 地貧地貧: : 基因缺失使基因功能丟失基因缺失使基因功能丟失 地貧地貧: : 結(jié)構(gòu)基因變異使結(jié)構(gòu)基因變異使轉(zhuǎn)錄異常轉(zhuǎn)錄異常

9、-50kb -10kb 0kb 10kb 20kb 30kb (-sea) deletion (- 4.2) deletion (- 3.7) deletion 2 1導(dǎo)致導(dǎo)致地貧的不同類型的基因缺失地貧的不同類型的基因缺失 globin genes affected by thalassemia deletionsilent carrierthalassemia traithb h diseasehydrops fetalisnormal 地貧疾病嚴(yán)重程度的單倍型順序 2 1t 2 1 2t 1 1t hematological data of the proposituse and her

10、 family members. 121 234512jia sq, et al. j clin pathol, 2004; 57:164-7. different point mutations reducing globin gene expression exon 1ivs 1 exon 2exon 3 ivs 2rund. & rachmilewitz. n. engl. j. med. 2005, 353:1135-46. 世界上不同種族的常見(jiàn)世界上不同種族的常見(jiàn)地貧突變地貧突變類型類型 種種 族族 突變類型突變類型 地中海人地中海人 ivs-1, position 110

11、(g a) cd39, nonsense (cag tag) ivs-1, position 1 (g a) ivs-2, position 745 (c g) ivs-1, position 6 (t c) ivs-2, position 1 (g a)黑人黑人 29, (a g); 88, (c t) poly(a), (aataaa aacaaa) 東南亞人東南亞人,中國(guó)人中國(guó)人 cd 41-42, frameshift ( cttt) ivs-2, position 654 (c t) 28, (a g); hb e (g a) cd17, nonsense (aag tag) ivs

12、-1, position 5 (g c)亞洲印地安人亞洲印地安人 ivs-1, position 5 (g c) 619-bp deletion cd 8-9, frameshift (+g) ivs-1, position 1 (g t) cd 41-42, frameshift ( cttt)results of blood analysis, dna diagnosis and results of blood analysis, dna diagnosis and mrna detection in the family members.mrna detection in the fa

13、mily members.sequencing of the -globin gene amplified from the probandheterozygosityheterozygosity for the c for the ct substitution t substitution at position-90 of the-globinat position-90 of the-globin gene gene近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的部分中國(guó)南方新突變近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的部分中國(guó)南方新突變基基 因因 突突 變變珠蛋白基因珠蛋白基因 11.111.1大片段缺失大片段缺失珠蛋白基因珠蛋白基因 2 2cd

14、118(+tca)cd118(+tca)珠蛋白基因珠蛋白基因 90(ct90(ct珠蛋白基因珠蛋白基因 73(at)73(at)珠蛋白基因珠蛋白基因 28(ac)28(ac)珠蛋白基因珠蛋白基因cds15/16(+g)cds15/16(+g)珠蛋白基因珠蛋白基因 cd38(cd38( a) a) 地中海貧血的產(chǎn)前診斷地中海貧血的產(chǎn)前診斷 胎兒取樣技術(shù)胎兒取樣技術(shù) dna診斷技術(shù)診斷技術(shù) -地貧的診斷地貧的診斷 -地貧的診斷地貧的診斷羊膜穿刺羊膜穿刺 (amniocentesis) 抽取胎兒樣品示意圖抽取胎兒樣品示意圖 植入前基因診斷植入前基因診斷 preimplantation genetic

15、 diagnosis(pgd) 超聲產(chǎn)前診斷超聲產(chǎn)前診斷 prenatal diagnosis: ultrasound measurement 母體外周血分離胎兒細(xì)胞進(jìn)行產(chǎn)前診斷母體外周血分離胎兒細(xì)胞進(jìn)行產(chǎn)前診斷 prenatal diagnosis: fetal cells in the maternal circulation 母體血漿或血清中胎兒母體血漿或血清中胎兒dna分析分析 analysis of fetal dna in maternal plasma and serum目前及今后的胎兒產(chǎn)前診斷新技術(shù)目前及今后的胎兒產(chǎn)前診斷新技術(shù)ding c, chiu rw, lau tk,

16、leung tn, chan lc, chan ay, charoenkwan p, ng is, law hy, ma es, xu x, wanapirak c, sanguansermsri t, liao c, ai ma, chui dh, cantor cr, lo ym. ms analysis of single-nucleotide differences in circulating nucleic acids: application to noninvasive prenatal diagnosis.proc natl acad sci u s a. 2004 20;1

17、01(29):10762-7. 單堿基延伸產(chǎn)物的質(zhì)譜分析單堿基延伸產(chǎn)物的質(zhì)譜分析m ff父親的突變類型父親的突變類型saber:single allele base extension reaction 分子量分子量fmstandard protocol saber protocol在母血漿在母血漿dnadna中中排除排除父親的父親的地貧突變地貧突變+雙親基因型不同：雙親基因型不同：case cd 41/42 - cttt ivs2 654 c t nt 28 a g cd 17a t standard protocol saber fetal genotypeweeks gestation

18、1 f m n / n11 2 f m n / n18 3 f m n / n21 4 m f f / n18 5 m f f / m 17 6 f m f / n11 7 f m f / n14 8 f n / n7 9 f f / n12 10 m f n / n17 11 f f / n20 12 m & f n.a. n.a. n / n18 鑒定母血漿鑒定母血漿dna中的父親中的父親地貧突變地貧突變單倍型分析用于鑒定母血漿單倍型分析用于鑒定母血漿dna中的父親等位基因中的父親等位基因case mother father hbb mutant allele hbb wt all

19、ele snp g allele paternal hbb mutation fetal hbb genotype3 cc gc g c n / n11 cc gc g c f / n12 cc gc g c n.a. n / n地中海貧血的產(chǎn)前診斷地中海貧血的產(chǎn)前診斷 胎兒取樣技術(shù)胎兒取樣技術(shù) dna診斷技術(shù)診斷技術(shù) -地貧的診斷地貧的診斷 -地貧的診斷地貧的診斷dna診斷技術(shù)診斷技術(shù) 多重多重pcr （multiplex pcr） 等位基因特異性性寡核苷酸雜交等位基因特異性性寡核苷酸雜交（aso） 反向點(diǎn)雜交反向點(diǎn)雜交 （rdb） 變性高效液相色譜（變性高效液相色譜（dhplc） 基于基于

20、微孔板微孔板 (microtiter well-based ) 高通量檢測(cè)高通量檢測(cè) 實(shí)時(shí)實(shí)時(shí)pcr (real-time pcr) -50kb -10kb 0kb 10kb 20kb 30kb (-sea) deletion (- 4.2) deletion (- 3.7) deletion 2 1導(dǎo)致導(dǎo)致地貧的不同類型的基因缺失地貧的不同類型的基因缺失location of primers and detection of -sea deletion by gap-pcrgenotyping of the-sea alleles by gap-pcr chong ss, et al. bl

21、ood. 2000; 95(1):360-2. 寡核苷酸探針雜交技術(shù)寡核苷酸探針雜交技術(shù)asoaso探針檢測(cè)探針檢測(cè) - -地貧基因診斷結(jié)果地貧基因診斷結(jié)果 pcrbbbbbbgdnahybridizationdetectionstreptavidin-podcolor signal mmembraneason m n m n msubstrate(tmb)反反向向點(diǎn)點(diǎn)雜雜交交技技術(shù)術(shù)rdb analysis: application to rapid prenatal diagnosisrdb analysis: application to rapid prenatal diagnosis

22、for eight for eight thalassaemiathalassaemia mutations. mutations.genotypefather cds41-42 ( cttt) / n motherivs-2-654 (c t) / n fetuscds41-42 / ivs-2-654normal control n / n human human -globin gene and the pcr amplicons -globin gene and the pcr amplicons 5utrexon 1ivs 1exon 2ivs 2 ivs2exon 33utrfa(

23、453bp)fb(364bp)fc(423bp)-90,-73,-29,-28cd2cd13-14,cd14-15,cd15-16,cd17 cd26,cd27-28 ivs1-1,ivs1-5 cd37,cd38 cd41-42,cd43cd71-72ivs2-5,ivs2-16ivs2-654,ivs2-666fragmentmutation patternsnormal patternstotalmutationmutation + snpheterozygoushomozygousfa12221237fb 5152224fc 0 322 7total1740566868 uniquel

24、y profiled dhplc patterns observed from 795 dna samples實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果中國(guó)南方中國(guó)南方 和和地中海貧血的預(yù)防計(jì)劃地中海貧血的預(yù)防計(jì)劃人群篩查預(yù)防計(jì)劃的策略人群篩查預(yù)防計(jì)劃的策略 醫(yī)院水平醫(yī)院水平(hospital-based)(hospital-based)的預(yù)防計(jì)劃的預(yù)防計(jì)劃 社區(qū)水平社區(qū)水平(community-based)(community-based)的預(yù)防計(jì)劃的預(yù)防計(jì)劃 家系擴(kuò)展篩查家系擴(kuò)展篩查(screening extended families)(scree

25、ning extended families)carrier screening for and thalassemia in pregnancy: the results of an 11-year prospective program in guangzhou maternal and neonatal hospital guangzhou maternal and neonatal hospital liao c li j huang yn li qm feng q zhong hz cui yysouthern medical university mo qh li ly hua l

26、 zhang jz zeng r jia sq xu xmprenat diagn 2004, 25:163-71地貧攜帶者篩查及產(chǎn)前診斷流程地貧攜帶者篩查及產(chǎn)前診斷流程被檢對(duì)象被檢對(duì)象（婚前或孕中期）（婚前或孕中期）血液學(xué)分析血液學(xué)分析（mcv ，hb a2變化）變化）排除地貧排除地貧地貧攜帶者地貧攜帶者遺傳咨詢，配偶檢查遺傳咨詢，配偶檢查血液學(xué)分析血液學(xué)分析（mcv hb a2變化）變化）地貧攜帶者地貧攜帶者排除地貧排除地貧遺傳咨詢遺傳咨詢雙親基因分析雙親基因分析胎兒產(chǎn)前診斷胎兒產(chǎn)前診斷outcomes of screening program in gzmnh 1993-2003 total49221 860758 4503 2804 (5.7) 1783 (3.6) 198 (4.4) 83 (1.8) 131 (2.9) 187 (95.8) 82 (98.8) ( contd )prenatal diagnosis in 83 fetuses at-risk for thalassemia ( contd )results in 266 pregnancies where a prec