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1、 酶 組 織 化 學(xué) ( e n z y m e histochemistry)是利用組織細(xì)胞內(nèi)酶具有催化某種反應(yīng)的特性來(lái)檢測(cè)酶活性。一般是用凍結(jié)或固定的切片,再一定條件下(具有酶的底物等)全酶進(jìn)行催化作用,產(chǎn)生一種可見(jiàn)產(chǎn)物,沉淀在酶所在的部位,最終通過(guò)顯微鏡對(duì)酶的活性進(jìn)行定位或定量研究。 第二章第二章 酶組織化學(xué)酶組織化學(xué)2021-11-121 特點(diǎn): 在原位檢測(cè) 檢測(cè)酶的活性而不是酶分子本身酶的分類(lèi):按生物化學(xué)分類(lèi)六大類(lèi) 氧化還原酶 轉(zhuǎn)移酶 水解酶 裂解酶 異構(gòu)酶 連接酶常用檢測(cè)方法常用檢測(cè)方法1沉淀法 金屬沉淀法:ca+co+法;pb法 偶聯(lián)法:重氮鹽法 靛原法 四唑鹽法22后偶聯(lián)法po
2、st-coupling(acp)3合成法4底物膜法 設(shè)計(jì)半透膜 切片/ 孵育法 影響酶組化實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵因素 酶活性的保存a)固定:酶組化的固定劑有教嚴(yán)格的限制,不 同的酶適用不同的固定劑 抑制酶活性和細(xì)胞化學(xué)成分活性的重金 屬鹽hg、cr、pb等不能用做固定劑。 慎用醛 3b)取材:快捷,實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備充分。冰結(jié)切片應(yīng)先備液氮防止酶活性喪失。橫冷箱切片稍固定(丙酮 氯仿=1 1)4,510分鐘,但脂溶性蛋白脫落。 底物濃度 a)量要足夠1 20 v/ v b)孵育法只能用一次,配制 時(shí)要適量(節(jié)儉) ph和滲透壓 應(yīng)以緩沖液調(diào)節(jié) 溫度控制與時(shí)間:室溫37(40min) 4(510min)4 捕獲劑 亦
3、要求一定濃度,要以反應(yīng)原位瞬 時(shí)沉淀。 激活劑與抑制劑(對(duì)照)a)兩者的選擇都應(yīng)具有特異性。b)要有適當(dāng)?shù)臐舛确秶?時(shí)間:通過(guò)實(shí)驗(yàn)自行摸索。任何配方都是一 個(gè)很大的范圍(指時(shí)間),受多種因 素的影響,因藥品的質(zhì)量、環(huán)境因素 的變化而變化。故不可輕信之。 擴(kuò)散:控制反應(yīng)速度,避免擴(kuò)散(冰凍 切片孵育尤應(yīng)注意)5 對(duì)照:必須設(shè)立對(duì)照,以防非特異反應(yīng)。 這對(duì)結(jié)果的解釋非常重要。 對(duì)結(jié)果的分析,應(yīng)考慮如下幾個(gè)問(wèn)題:經(jīng)過(guò)凍結(jié)或固定后組織細(xì)胞破壞,酶究竟 能保留多少?酶是否在原位?反應(yīng)中多少酶起了作用?酶的活性是否代表細(xì)胞生活時(shí)的活性?沉淀的產(chǎn)物是否代表酶蛋白分子,時(shí)間延 長(zhǎng),會(huì)不會(huì)改變?是否有擴(kuò)散移位6
4、 一、鈣鈣鈷法顯示堿性磷酸酶鈷法顯示堿性磷酸酶 alkaline phosphatase (alp)原理原理以天然存在的甘油磷酸鈉為底物,經(jīng)酶水解釋放出磷酸,立即被鈣離子沉淀為 磷酸鈣,再依次被置換為磷酸鈷和硫化鈷,最終產(chǎn)物為黑色的硫化鈷沉淀。反應(yīng)式如下:7方法方法標(biāo)本:標(biāo)本:大白鼠腎、小腸恒冷溫箱切片(載片) 厚6微米。固定:丙酮 氯仿(1 1)混合液。4 25切片標(biāo)本入下列孵育液中,37,5分鐘 孵育液: 3甘油磷酸鈉 6ml 底物 保 2巴比妥鈉 6ml 調(diào)ph 證 2氯化鈣(無(wú)水) 9ml 沉淀劑 新 2硫酸鎂 6ml 激活劑 鮮 蒸餾水 3ml 30ml 將孵育液混勻,若渾濁可過(guò)濾,
5、調(diào)ph至9.4。 流水流水洗2分鐘后入蒸餾水 入2硝酸鈷,5分鐘(小腸可3分鐘) 置換 流水洗5分鐘,入蒸餾水。 入0.5硫化胺,2分鐘。 置換 流水洗10分鐘,入蒸餾水。 入mayer氏蘇木精染液(復(fù)染核)1分鐘 流水洗5分鐘蒸餾水。 甘油明膠或apathy糖膠封固。 結(jié)果結(jié)果:腎小體(近端小管)刷狀緣、小腸絨毛 紋狀緣和 血管內(nèi)皮出現(xiàn)黑色的硫化鈷沉 淀,顯示alp活性強(qiáng) 。 alp為一種膜酶,廣泛存在于腎小管、小腸 絨毛、膀胱、腎上腺、包曼氏囊、肝、脾、 乳腺及 卵巢等細(xì)胞膜,與細(xì)胞的吸收有關(guān)。對(duì)照對(duì)照 無(wú)底物孵育,以蒸餾水代替孵育液中的3 甘油磷酸鈉,其余各步進(jìn)行同上。 加熱滅活酶活性。
6、 加抑制劑,左旋咪唑0.11.0mmol/l注意事項(xiàng)注意事項(xiàng)ca2+要足量 硫化鈉(nh4)s 配置成淡黃色,可提供 s2-滴23滴 用水將鈷離子洗凈,以防止出現(xiàn)假陽(yáng)性。 有些組織中有色素(含鐵血黃素、黑色 素)出現(xiàn),可影響結(jié)果。 本法可用顯示:5核苷酸酶、肌蛋白 atpase、alp 二、鉛法鉛法顯示酸性磷酸酶顯示酸性磷酸酶 (gomori,1950 lojda,1979)原理原理 以甘油磷酸鈉為底物,在酸性ph下,被acp水解,釋放出磷酸鹽,遇鉛離子則生成磷酸鉛沉淀。在被s2-置換,最終生成硫酸鉛棕色沉淀。反應(yīng)式如下: 酸性磷酸酶acid phosphatas(acp) acp的特性 ph
7、 4.55.5適宜 激活劑:mn2+ 抑制劑:naf,有些acp為cu2+、酒石 酸鹽、四氧嘧啶甲醛等抑制劑。acp定位定位 溶酶體(顆粒狀)內(nèi); 溶酶體外acp存在于er和胞液。 該酶活性高的器官:腎、肝、腸、脾、 腎上腺。方法方法標(biāo)本:大白鼠腎、肝橫冷箱切片(載片),厚6 微米。固定:冰凍片或橫冷箱切片。凍融,有時(shí)也可 用甲醛,但影響活性。 本實(shí)驗(yàn)不固定或固定于丙酮 氯仿(1 1) 混合液,4,25min步驟:步驟: 將標(biāo)本放于下列孵育液中 37, 1015 孵育液:0.1m醋酸緩沖液,ph5.2 15ml 0.24硝酸鉛 15ml 3甘油磷酸鈉 3ml 33ml 混勻,置37水浴中153
8、0分鐘后,過(guò)濾。 于37蒸餾水中洗2次,每次1分鐘。(溫 蒸餾水洗) 入5硫化胺,12分鐘。 流水沖洗35分鐘后,換蒸餾水。 (可用mayer蘇木素復(fù)染核) 用甘油明膠或apathy氏糖膠封固。結(jié)果結(jié)果酶活性部位棕黑色硫化鉛沉淀。 分布于腎近曲小管細(xì)胞核周?chē)?,肝?xì) 胞毛細(xì)膽管周?chē)凶睾谏w粒。對(duì)照對(duì)照孵育液內(nèi)加0.01m naf(13.9mg / 33ml)() 注意事項(xiàng)注意事項(xiàng) 鉛離子的濃度 關(guān)鍵問(wèn)題,沒(méi)有底物,有 些組織吸附鉛離子(+),因此必須用naf 抑制酶活性排除假陽(yáng)性反應(yīng)。 孵育時(shí)間不可過(guò)長(zhǎng),否則染色擴(kuò)散或核染色。應(yīng)用范圍應(yīng)用范圍 “鉛法”適用于:acp,5-核苷酸酶g6p酶;
9、膜atpase mitoatpase ttpase(硫胺素焦磷酸酶) 三、偶氮偶聯(lián)法顯示偶氮偶聯(lián)法顯示acp原理原理 以奈酚的衍生物磷酸脂naphthol asbl phosphate為底物,在酸性ph(5.2)下,經(jīng)酸性磷酸酶水解釋放出naphol asbi,立即與六氮化對(duì)品紅偶聯(lián),生成紅色偶氮染料,用以代表酸性磷酸酶活性。方法方法標(biāo)本:標(biāo)本:大白鼠腎、肝橫冷箱切片(載片),厚 6 微米。 不固定或固定于丙酮 氯仿(1 1)混 合液內(nèi),4 ,25min 標(biāo)本入下列孵育液,37,3060分鐘。 孵育液:磷酸奈酚asbi 15 mg 溶于二甲基亞砜 0.6 ml 六氮化對(duì)品紅 緩沖液 30 ml
10、 30.6 ml 充分混勻并過(guò)濾 蒸餾水洗 入mayer蘇木精內(nèi)染1分鐘。 流水沖5分鐘后入蒸餾水。 用apathy糖膠或甘油明膠封固。結(jié)果結(jié)果 酶的活性部位呈紅色,核蘭色。 分布于腎近端小管核周,肝毛細(xì) 膽管周?chē)?acp是溶酶體的標(biāo)志酶。 六氮化對(duì)品紅液的配制(30ml) 4對(duì)品紅鹽酸溶液 堿性品紅 400mg 濃鹽酸 2 ml 蒸餾水 8ml 4nano3配好后于冰箱保存用時(shí)取1ml。+ 等量混勻(各取1ml),蓋嚴(yán)并置室 溫靜止一分鐘,待混合液變?yōu)榈S色 倒入28ml 2.72醋酸鈉溶液,用1n naoh調(diào)ph至5 5.5即成。 四、四唑鹽法顯示琥珀酸脫氫酶四唑鹽法顯示琥珀酸脫氫酶對(duì)照
11、對(duì)照用抑制劑naf濃度為10mmol/l ca2+ 濃度為10mmol/l注意事項(xiàng)注意事項(xiàng) 六氮鹽濃度不能太高 背景會(huì)略帶黃色應(yīng)用范圍應(yīng)用范圍 本法用于alp、acp、非特 異性脂酶。原理利用原理利用 利用h受體的h2,使四唑還 原成甲 月替 :反應(yīng)式如下:本實(shí)驗(yàn):本實(shí)驗(yàn):以琥珀酸(鈉鹽)為底物,在酶的作 用下脫氫,人工合成的硝基藍(lán)四唑(nitro bt)為受h體,其接受h后被還原成甲月替 呈紫色以代表琥珀酸脫氫酶的活性。 琥珀酸脫氫酶是線(xiàn)粒體的標(biāo)志酶之一。 抑制物:抑制物:丙二酸鹽(競(jìng)爭(zhēng)抑制),磷酸 鹽,氯化物,蘇拉明草酰乙酸 (競(jìng)爭(zhēng)抑制)凡與-sh基化合的 作用劑皆抑制其活性。方法方法 標(biāo)
12、本標(biāo)本:大白鼠肝、腎或心肌。橫冷箱切片,后 6微米不固定。 步驟:步驟: 將標(biāo)本放入下列孵育液中,37,約5分鐘。 孵育液:nitro bt 10mg 0.1mpbs,ph7.8 10ml pms(吩嗪硫酸甲酯) 1mg 徐徐加溫,使其溶解,冷卻過(guò)濾。 再加入琥珀酸鈉 80mg 蒸餾水洗凈 apathy氏液糖膠封固結(jié)果結(jié)果 酶活性部位成藍(lán)紫色沉淀。此標(biāo)本內(nèi) 所見(jiàn)藍(lán)紫色顆粒即線(xiàn)粒體。對(duì)照對(duì)照 孵育液去底物,加入等量蒸餾水,同 時(shí)孵育()注意注意 甲月替易溶于脂,反應(yīng)擴(kuò)散時(shí)組織內(nèi)脂滴被染。 加入pms(中間遞氫體)定位更加準(zhǔn)確。 如果聚乙烯醇pva,可以保護(hù)線(xiàn)粒體膜,使 反應(yīng)局限在線(xiàn)粒體內(nèi)。應(yīng)用范
13、圍應(yīng)用范圍 適用于:甲胺氧化酶、乳酸脫氫 酶、琥珀酸脫氫酶。 五五 、dab法法 顯示過(guò)氧化物酶顯示過(guò)氧化物酶原理原理 過(guò)氧化物酶分解h2o2的過(guò)程中,下面反應(yīng)不直接發(fā)生:ah2(供氫體)+h2o2a(供氫體的氧化物)+2h2o2實(shí)驗(yàn)可知,有稱(chēng)為復(fù)合物 、的酶底物(受氫體)復(fù)合體生成,在復(fù)合體最后分解為酶和水時(shí),游離的原子氧使供氫體氧化而顯色。酶組織化學(xué)中所使用的供氫體應(yīng)是含有色原性基團(tuán)的發(fā)色物質(zhì),如奈酚和聯(lián)苯胺。光鏡顯示方法光鏡顯示方法(1)孵育液的配置: 預(yù)孵育液: dab 4hcl 10mg 溶于蒸餾水 5ml 0.2m磷酸緩沖液(ph6.5) 5ml fahimi孵育液: dab 4h
14、cl 10ml 溶于蒸餾水 5ml 0.2m磷酸緩沖液(ph6.57.0) 5ml 0.3h2o2 0.1ml grahamk孵育液: dab 4hcl 5mg 0.05m th緩沖液(ph7.6) 10ml 1h2o2 10ml lojda 孵育液: 0.1n苯基對(duì)次甲苯二胺 25ml 0.1-萘酚 25ml0.3h2o2(新配) 1ml方法方法 固定:溫度4,30分鐘(3戊二醛固 定液:20戊二醛15ml,或25 戊二 醛12ml 0.2 m磷酸緩沖 液50 ml,蒸 餾水加至100ml止); 洗滌:洗滌三次以上,每次15分鐘,或 過(guò)濾。 切片:cryostat制成切片(510m) 染色步驟染色步驟 切片入下列孵育液中 a預(yù)孵液:室溫下1030分鐘 b后孵液: fahimi孵育液,室溫560分鐘 gropam-karnovsky液,室溫,310分鐘 洗滌:蒸餾水漂洗 染核:亞甲藍(lán)染核 封固:甘油明膠封固
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