蛋白質(zhì)分子量測(cè)定方法研究進(jìn)展

1、蛋白質(zhì)分子質(zhì)量測(cè)定蛋白質(zhì)分子質(zhì)量測(cè)定方法概述方法概述皇家藥院目錄目錄其他方法其他方法SDS-PAGESDS-PAGE凝膠電泳凝膠電泳v聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)是實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行蛋白質(zhì)研究中最常用的技術(shù)，兼有電泳和分子篩的雙重作用。vSDS是一種陰離子去污劑，可使蛋白質(zhì)變性，與其蛋白質(zhì)結(jié)合成帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合體，消除電泳過程中蛋白質(zhì)所帶電荷對(duì)電泳結(jié)果的影響，從而保證蛋白質(zhì)電泳僅受分子質(zhì)量大小的影響。在一定的電場(chǎng)作用下，該復(fù)合體沿著以聚丙烯酰胺凝膠形成的分子篩向電場(chǎng)的正極移動(dòng)，從而將蛋白質(zhì)根據(jù)他們的分子量大小而分開。v蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合體：形狀一定、電荷密度一定SDS-PAGESDS-PAGE凝

2、膠電泳凝膠電泳上樣：防止樣品溢出、正負(fù)極、電壓SDS-PAGESDS-PAGE凝膠電泳凝膠電泳當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)分子量在10-200kDa時(shí)，樣品的遷移率和分子量的對(duì)數(shù)呈對(duì)數(shù)關(guān)系，符合如下方程式： lgMW = -bRf + K其中，MW為蛋白質(zhì)分子質(zhì)量，Rf為相對(duì)遷移率，b為斜率，K為截距，當(dāng)條件一定時(shí)，b和K為常數(shù)。因此通過已知分子量的蛋白和未知分子量蛋白的比較，就能得出未知蛋白的分子量。 影響分子量測(cè)定的因素很多，包括蛋白質(zhì)與SDS的結(jié)合量的不同，凝膠濃度和交聯(lián)劑濃度等，如圖所示。研究者測(cè)定了當(dāng)交聯(lián)劑濃度不變，改變凝膠濃度，下圖分別對(duì)應(yīng)于凝膠濃度為5%，10%，15%。SDS-PAGESDS-PA

3、GE凝膠電泳凝膠電泳 優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單，容易掌握，成本低，分辨率高，重復(fù)效果好。 缺點(diǎn)缺點(diǎn)：對(duì)于電荷異?；蛘邩?gòu)象異常的蛋白、帶有較大輔基的蛋白及一些結(jié)構(gòu)蛋白測(cè)定的分子質(zhì)量不太可靠，而且電泳結(jié)束后還需要染色，染色，脫色比較耗時(shí)。SDS-PAGESDS-PAGE凝膠電泳凝膠電泳凝膠滲透層析法凝膠滲透層析法定義：又叫體積排阻層析、分子篩層析，當(dāng)生物大分子通過裝有凝膠顆粒的層析柱時(shí)，根據(jù)它們分子大小不同而進(jìn)行的分離技術(shù)。固定相：惰性凝膠顆粒，顆粒內(nèi)部立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，形成許多孔穴原理：原理：凝膠滲透層析法凝膠滲透層析法常用凝膠：交聯(lián)葡聚糖凝膠（Sephadex）、聚丙烯酰胺凝膠、瓊脂糖凝膠（Sephar

4、ose）凝膠滲透層析法凝膠滲透層析法洗脫體積Ve與分子量的關(guān)系可用下式表示：Ve=K1K2logMW（K1、K2為常數(shù)，MW為分子量）從公式可以看出，目標(biāo)樣品的流出體積與分子量對(duì)數(shù)成線性關(guān)系。在實(shí)際操作過程中，選取標(biāo)準(zhǔn)品與樣品同時(shí)通過凝膠柱，通過已知標(biāo)準(zhǔn)品的流出體積和分子量可以計(jì)算出曲線中的K1、K2值，再根據(jù)已知的曲線方程和樣品流出體積計(jì)算樣品的分子量。凝膠滲透層析法凝膠滲透層析法 優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單，設(shè)備簡(jiǎn)單，樣品用量少，周期簡(jiǎn)單，條件溫和，一般不引起生物活性的改變。 缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：應(yīng)用具有一定的局限性，在pH68的范圍內(nèi)，線性關(guān)系比較好，但在極端pH時(shí)，一般蛋白質(zhì)有可能因變性而偏離。糖蛋

5、白在含糖量超過5%時(shí)，測(cè)得分子量比真實(shí)的要大，鐵蛋白則與此相反，測(cè)得的分子量比真實(shí)的要小。質(zhì)譜法質(zhì)譜法 1906年，Thomson發(fā)明了質(zhì)譜技術(shù)，最初只是用于無機(jī)化學(xué)中的同位素分析，直至20世紀(jì)40年代末才發(fā)展成為有機(jī)質(zhì)譜。近年來，生物質(zhì)譜技術(shù)取得了突飛猛進(jìn)的發(fā)展，其中以分別由美國科學(xué)家John.B.Fenn和日本科學(xué)家田中耕一發(fā)明的電噴霧離子化質(zhì)譜技術(shù)（電噴霧離子化質(zhì)譜技術(shù)（ESI-MSESI-MS）及基質(zhì)輔助激光解吸基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜技術(shù)（電離質(zhì)譜技術(shù)（MALDI-MSMALDI-MS）的貢獻(xiàn)最為突出?？蓽?zhǔn)確測(cè)定分子量1.電噴霧離子化質(zhì)譜技術(shù)（電噴霧離子化質(zhì)譜技術(shù)（ESI-MS）原理

6、：原理：電噴霧離子化質(zhì)譜技術(shù)（ESI-MS）是在毛細(xì)管的出口處施加一高電壓，所產(chǎn)生的高電場(chǎng)使從毛細(xì)管流出的液體霧化成細(xì)小的帶電液滴，隨著溶劑蒸發(fā)，液滴表面的電荷密度逐漸增大，最后液滴崩解為大量帶一個(gè)或多個(gè)電荷的離子，致使分析物以單電荷或多電荷離子的形式進(jìn)入氣相的質(zhì)譜技術(shù)。ESI-MS測(cè)定蛋白質(zhì)大分子是根據(jù)一簇多電荷的質(zhì)譜峰群，通過解卷積的方式計(jì)算得到蛋白質(zhì)的分子量，由于ESI-MS可以產(chǎn)生多電荷峰，因此使得測(cè)試的分子質(zhì)量范圍大大擴(kuò)大。1.電噴霧離子化質(zhì)譜技術(shù)（電噴霧離子化質(zhì)譜技術(shù)（ESI-MS） 電噴霧是一種離子化方法，可以用作質(zhì)譜儀的離子源1.電噴霧離子化質(zhì)譜技術(shù)（電噴霧離子化質(zhì)譜技術(shù)（ES

7、I-MS）多電荷使得樣品譜圖復(fù)雜荷質(zhì)比：1.電噴霧離子化質(zhì)譜技術(shù)（電噴霧離子化質(zhì)譜技術(shù)（ESI-MS）優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：（1）對(duì)樣品的消耗少，不會(huì)造成樣品的大量浪費(fèi)；（2）對(duì)樣品分子質(zhì)量測(cè)試靈敏度、分辨力和準(zhǔn)確度都相當(dāng)高；（3）能夠方便地與多種分離技術(shù)聯(lián)用，如毛細(xì)管電泳、高效液相色譜等，是解決非揮發(fā)性、熱不穩(wěn)定性、極性強(qiáng)的復(fù)雜組分化合物的定性定量的高靈敏度檢測(cè)方法。缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：對(duì)樣品純度要求高，且會(huì)形成多電荷的質(zhì)譜峰群，難以分辨，使得結(jié)果分析較為困難。2.基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜技術(shù)（基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜技術(shù)（MALDI-MS）原理：原理：基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜技術(shù)（MALDI-MS）是將待測(cè)

8、物懸浮或溶解在一個(gè)基體中，基體與待測(cè)物形成混晶，當(dāng)基體吸收激光的能量后，均勻傳遞給待測(cè)物，使待測(cè)物瞬間氣化并離子化。將它與經(jīng)典的脈沖化工作方式的飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（TOF）直接聯(lián)用，即我們常聽到的基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）。TOF的原理是離子在電場(chǎng)作用下加速飛過飛行管道，根據(jù)到達(dá)檢測(cè)器的飛行時(shí)間不同而被檢測(cè)即測(cè)定離子的質(zhì)荷比（M/Z）與離子的飛行時(shí)間成正比，檢測(cè)離子。2.基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜技術(shù)（基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜技術(shù)（MALDI-MS）優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：（1）同ESI-MS 一樣對(duì)樣品的消耗很少；（2）MALDI-MS 的最高分辨率不斷提高，甚至超過ESI-

9、MS； （3）有利于對(duì)復(fù)雜混合物的分析，且能忍受較高濃度的鹽、緩沖劑和其他難揮發(fā)成分，降低了對(duì)樣品預(yù)處理的要求；（4）MALDI-TOF 質(zhì)譜對(duì)生物大分子分子量的測(cè)定范圍是所有測(cè)試技術(shù)中最廣。缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：在與高效液相色譜、毛細(xì)管電泳等分離設(shè)備的聯(lián)用時(shí)，目前只能采取離線的方式，致使分析結(jié)果的重復(fù)性較差，與MALDI-MS 本身高精密度的特性不匹配。其他方法其他方法 除了以上幾種目前實(shí)驗(yàn)室常用的測(cè)定方法，還有一些現(xiàn)在在實(shí)驗(yàn)室一般不太使用的方法，包括粘度法，滲透壓法，輻射失活法，超速離心沉降法，光散射法等。1.1.粘度法粘度法 粘度法是指通過測(cè)定樣品溶液的粘度，從而計(jì)算樣品的的分子量的方法。一定溫度

10、條件下，高聚物稀溶液的粘度與其分子量之間呈正相關(guān)性，隨著分子量的增大，聚合物溶液的粘度增大。通過測(cè)定高聚物稀溶液粘度隨濃度的變化，即可計(jì)算出其平均分子量(粘均分子量)。如果高聚物分子的分子量愈大，則它與溶劑間的接觸表面也愈大，摩擦就大，表現(xiàn)出的特性粘度也大。特性粘度與相對(duì)分子量M之間遵循Mark-Houwink經(jīng)驗(yàn)方程：=KM。K和值與溫度、聚合物、溶劑性質(zhì)有關(guān)，也和分子量大小有關(guān)。2.2.滲透壓法滲透壓法在一種理想溶液中，滲透壓與溶質(zhì)濃度成正比。但是實(shí)際上蛋白質(zhì)溶液與理想溶液有較大的偏差。滲透壓法測(cè)定蛋白質(zhì)分子量靈敏度較低，測(cè)定誤差較大，與SDS-PAGE法和凝膠色譜法等相比不常用于蛋白質(zhì)分

11、子量的測(cè)定。 RTKccRTMrcRTMcr0lim3.3.輻射失活法輻射失活法 輻射失活法無需純化和溶解蛋白質(zhì)，可在原位測(cè)定其分子量。高能射線照射生物組織會(huì)產(chǎn)生電離作用，若在一定范圍內(nèi)輻射能量破壞蛋白質(zhì)分子的C-H鍵，使蛋白質(zhì)喪失功能，電離作用減少。 D：輻射能量輻射失活法作為一種獨(dú)特的蛋白質(zhì)分子量測(cè)定方法，具有獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)，尤其是在膜蛋白研究方面，提供了一個(gè)測(cè)定膜蛋白分子量和研究其結(jié)構(gòu)的手段，但由于高能射線使用的局限性，在生化研究中不常用。DMr11104.64.4.超速離心沉降法超速離心沉降法 利用超速離心沉降法測(cè)蛋白質(zhì)的分子量是在較低轉(zhuǎn)速下進(jìn)行的（8000-20000r/min）。離心開始時(shí)，分子顆粒發(fā)生沉降，一段時(shí)間以后，沉降的結(jié)果造成了濃度梯度，因而產(chǎn)生了蛋白質(zhì)分子反向擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)，當(dāng)反向擴(kuò)散與離心沉降達(dá)到平衡時(shí)，濃度梯度就固定不變了，但是目前由于操作繁瑣，已經(jīng)不在一般實(shí)驗(yàn)室使用。5.5.光散射法光散射法 主要基于染料陰離子在蛋白質(zhì)等電點(diǎn)前與肽鏈上帶正電荷的基團(tuán)上的結(jié)合作用。此時(shí)生色團(tuán)聚集于蛋白質(zhì)