蔗糖酶的制備和活力測定

1、蔗糖酶的制備和比活力的測定1. 酵母蔗糖酶的制備2. 各級分酶溶液活性的測定（1）葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備（2）蔗糖酶水解蔗糖后還原糖含量的測定3. 各級分蔗糖酶溶液蛋白質(zhì)含量的測定4. 各級分蔗糖酶溶液比活力的計算實驗內(nèi)容比色法測酶活性的原理 酶活力單位（u）：在特定條件下反應(yīng)1min,每產(chǎn)生1mmol底物所需要的酶量，或轉(zhuǎn)化底物中1mmol的有關(guān)基團(tuán)的酶量。實際應(yīng)用是1ml 酶液所產(chǎn)生底物的量定為1ml酶液的活力 酶的比活力: 每mg酶蛋白質(zhì)所具有的酶活力 在蔗糖酶催化下蔗糖水解為等量的葡萄糖和果糖,最適ph值為3.5-5.5。 通過測定生成還原糖(葡萄糖和果糖)的量來測定蔗糖酶的活力，同時測

2、定蛋白含量，從而求得酶的比活力。制備蔗糖酶 (冰上操作！)研磨水抽提（級分i ）機(jī)械破碎，提取水溶性蛋白成分 （留出1.5ml測酶活力和蛋白質(zhì)含量，余做下一步）熱抽提（級分ii）： 去除部分熱變性蛋白雜質(zhì) （留出1.5ml測酶活力和蛋白質(zhì)含量，余做下一步）乙醇抽提（級分iii）：有機(jī)溶劑沉淀濃縮蔗糖酶 等量分裝在兩個1.5ml的ep管中，4保存，做為下兩次實驗中的酶 酶分離提純的總目標(biāo)是提高回收率及純度，保持較高的酶比活力（低溫操作）研磨水抽提 （級分i）將研缽放入冰中，預(yù)冷去離子水稱10g 酵母和約5g二氧化硅，放入研缽中緩慢加入預(yù)冷的去離子水30ml ，每次加2ml，邊加邊研磨；研磨30分

3、鐘以上，直至酵母細(xì)胞大部分研碎將混合物轉(zhuǎn)入兩個離心管中，平衡，4度10000rpm離心15min用滴管將上清水相轉(zhuǎn)入另一個清潔離心管中，再次離心15min上清轉(zhuǎn)入量筒測體積，用1m乙酸調(diào)節(jié)ph值至5.0留出1.5ml測酶活力和蛋白質(zhì)含量（冰上），余做下一步熱抽提 （級分ii）將級分i 水浴50度30分鐘，不斷輕搖 此時可以開始做 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線冰浴迅速冷卻3-5分鐘，4度10000rpm離心15min將上清轉(zhuǎn)入小燒杯，置于冰上留出1.5ml測酶活力和蛋白質(zhì)含量（冰上），余做下一步乙醇抽提 （級分iii）向燒杯中的級分ii 加入等體積 95%乙醇，攪拌，冰浴10min 4度10000rpm離心1

4、5min棄去上清，倒置于抽紙上瀝干，沉淀等量分裝于兩個1.5ml的ep管中，4保存，做為下兩次實驗中的酶 （級分iii）冰浴和離心的同時，可以開始做級分i和級分ii的 蛋白質(zhì)含量測定，酶活測定葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備以零號管調(diào)零，測520nm光密度。以葡萄糖含量為橫坐標(biāo)，以光密度為縱坐標(biāo)繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線 管號試劑 ml012345標(biāo)準(zhǔn)糖溶液 5mm00.60.81.01.21.40.1m醋酸緩沖液2.01.41.21.00.80.60.1m naoh溶液2.52.52.52.52.52.5二硝基水楊酸溶液0.50.50.50.50.50.5混勻，沸水浴 5min，流水冷卻3min葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的

5、制備以零號管調(diào)零，測520nm光密度。以葡萄糖含量為橫坐標(biāo)，以光密度為縱坐標(biāo)繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線 管號試劑 ml012345標(biāo)準(zhǔn)糖溶液 2mg/ml00.20.40.60.81.00.1m醋酸緩沖液0.20.20.20.20.20.2h2o1.81.61.41.21.00.80.1m naoh溶液2.52.52.52.52.52.5二硝基水楊酸溶液0.50.50.50.50.50.5混勻，沸水浴 5min，流水冷卻3min酶 活 測 定 （注意保留原管酶液，以備*） 以標(biāo)準(zhǔn)曲線的“0”管調(diào)零，測520nm光密度值。以測定管的光密度值減去對照管光密度值，求得的差值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得相應(yīng)的糖含量管號試

6、劑 ml測定管對照管級分i (3管)級分ii（3管）級分i （3管）級分ii （3管）10% 蔗糖溶液0.60.60.1m醋酸緩沖液1.31.325水浴3min酶（1:10, 1:50，1:100）各 0.125水浴5min0.1m naoh溶液2.52.5二硝基水楊酸試劑0.50.5酶（ 1:10, 1:50，1:100）各0.1混勻，沸水浴 5min，流水冷卻3min酶 活 測 定 （注意保留原管酶液，以備*） 以標(biāo)準(zhǔn)曲線的“0”管調(diào)零，測520nm光密度值。以測定管的光密度值減去對照管光密度值，求得的差值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得相應(yīng)的糖含量管號試劑 ml測定管對照管級分i (3管)級分ii（3管

7、）級分i （3管）級分ii （3管）300mm 蔗糖溶液0.60.60.1m醋酸緩沖液0.20.2h2o1.11.125水浴3min酶（1:10, 1:50，1:100）各 0.125水浴5min0.1m naoh溶液2.52.5二硝基水楊酸試劑0.50.5酶（ 1:10, 1:50，1:100）各0.1混勻，沸水浴 5min，流水冷卻3min蛋白質(zhì)含量的測定（考馬斯亮藍(lán)方法） 參照蛋白質(zhì)濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線(預(yù)制)，計算出各級分蛋白質(zhì)含量。y=0.0035x x代表溶液的濃度（mg/ml），y代表595nm下的吸收值 樣品 0.5ml + 考馬斯亮藍(lán)染液 5ml，室溫5min， 測od5951. h2o2. 級分i （1:10）3. 級分i （1:50）4. 級分i （1:100）5. 級分ii （1:10）6. 級分ii （1:50）7. 級分ii （1:100） 樣品：實實 驗驗 結(jié)結(jié) 果果1、葡萄糖濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線2、級分i和級分ii中的蔗糖酶的活力 （每 1ml蔗糖酶溶液產(chǎn)生的還原糖量）3、級分i和級分ii中蛋白質(zhì)的含量（每1ml 所含的mg）4、計算級分i和級分ii蔗糖酶