平面色譜法hjtPPT課件

1、1.Thin-layer chromatography of standard PL samples Fig.1Description: The thermo-stability of phospholipids and lysophospholipids was determined by one dimensional thin-layer chromatography (TLC). A chloroform-methanol-28% aqueous ammonia solvent system (65:35:8, v/v) provided clear separation of maj

2、or phospholipids (PL) and their lyso forms. The 5% (w/v) dodecamolybdophosphoric acid solution in ethanol was used as spray reagent. The thermo stability of phospholipids was evaluated by compare the spots density and area of PL samples with varying heat treatment. Rapid determination of thermo-stab

3、ility of phospholipids by TLC第1頁/共32頁第五章 平面色譜法 定義：平面色譜法(plane chromatography)是在平面上進行分離的一種色譜方法。 一、平面色譜法的分類和原理分類 紙色譜法：濾紙為載體，纖維素的羥基與水結(jié)合形成液-液分配色譜固定相，展開劑由于毛細作用沿濾紙向上運動。-分配色譜 薄層色譜法：將吸附材料均勻固定在載板上，由于吸附劑顆粒間的毛細作用，展開劑（流動相）上行。 -吸附色譜 薄層電泳法：荷電組分樣品負載于惰性支持介質(zhì)（紙、纖維素、聚丙烯酰胺凝膠等），在電場作用下進行分離。第2頁/共32頁二、平面色譜法的基本流程 確定樣品的預(yù)處理方法

4、 選擇吸附劑和展開劑 制備層析用薄板 點樣 層析分離 顯色 定性或定量分析 分析結(jié)果，給出結(jié)論第3頁/共32頁三、平面色譜法參數(shù)（一）定性參數(shù)1. 比移值Rf (retardation factor; Rf) 溶質(zhì)移動的距離與流動相移動距離之比 Rf范圍： 0 Rf 1Rf = 0.20.8（常用） Rf = 0.30.5（最佳）LdRsf原點到溶劑前沿的距離心的距離原點到組分斑點質(zhì)量中第4頁/共32頁Lds1ds2圖圖181LdRsf11LdRsf22第5頁/共32頁2. 相對比移值Ris 討論 參考物與被測組分在完全相同條件下展開 可以消除系統(tǒng)誤差，大大提高重現(xiàn)性和可靠性； 參考物可以是后

5、加入純物質(zhì)，也可是樣品中已知組分 相對比移值Ris與組分、參考物性質(zhì)及色譜條件有關(guān)，范圍可以大于或小于1sisfifisddRRR中心的距離原點到參考物斑點質(zhì)量心的距離原點到組分斑點質(zhì)量中）（）（第6頁/共32頁（二）面效參數(shù) 1、理論塔板數(shù) N=16(ds/W)2 ds:原點到斑點中心的距離 W：組分斑點的縱向?qū)挾?2、塔板高度 H=ds/N=(Rf L)/N ds：原點到展開劑前沿的距離 N越大，H越小。 與展開劑的速率常數(shù)、組分在展開劑中的擴散系數(shù)、吸附劑的平均粒徑及其粒度分布等因素有關(guān)。第7頁/共32頁（三）容量因子k與比移值Rf的關(guān)系 容量因子： k=ts/tmts 、 tm 分別為

6、組分在固定相和展開劑中的保留時間保留值的定義： 11kRtttRfmsmf第8頁/共32頁（四）分離參數(shù)1、分離度(resolution; R) 兩相鄰斑點中心的距離與兩斑點平均寬度的比值 R=2(ds2-ds1)/(W1+W2) =2d/(W1+W2) ds1 、ds2 :分別為原點至兩半斑點中心的距離， W1、W2斑點的寬度。第9頁/共32頁2.分離數(shù)(separation number; SN)定義：相鄰斑點分離度為1.177時，在Rf=0(原點)到Rf=1(溶劑前沿)之間能容納的色譜斑點數(shù)。 W(1/2)0, W(1/2)1為實驗測得的某組分色譜峰的半峰寬對ds作圖外推至在原點處和溶劑

7、前沿處的半峰寬。 一般薄層板的分離數(shù)為 710，高效薄層板可達1020。SN是衡量分離容量的重要參數(shù)。11)21()21(WWLSNo第10頁/共32頁第二節(jié) 薄層色譜法 一、主要類型 二、吸附劑與展開劑 三、操作方法 四、定性與定量分析 五、高效薄層色譜法 六、薄層掃描法 七、應(yīng)用實例第11頁/共32頁概述1TLC定義：將固定相均勻涂布在表面光滑的平板上， 形成薄層而進行色譜分離和分析的方法2操作過程：鋪板 活化 點樣 展開 定位(定性)/洗脫(定量)3分離機制：吸附* 、分配*、離子交換、空間排阻4特點；分離能力強、靈敏度高、展開時間較短、顯色 方便。5應(yīng)用：藥物雜質(zhì)檢查、純度測定、定性及

8、定量等。第12頁/共32頁第13頁/共32頁一、主要類型 （一）吸附薄層色譜 固定相為吸附劑的薄層色譜。利用吸附劑對不同組分的吸附能力差異而實現(xiàn)分離.經(jīng)過吸附、解吸、再吸附、再解吸最后混合物得到分離.K大，Rf值小，移動慢；K小，Rf大，移動快。 （二）分配薄層色譜 固定相為液體，吸留在載體上的薄層色譜。利用被分離組分在固定相與流動相中的分配系數(shù)不同而被分離。常用的是反相薄層色譜法，固定相是烷基化學(xué)鍵合相，展開劑是水及與水相溶的有機溶劑。第14頁/共32頁二、吸附劑與展開劑(一）吸附劑1. 硅膠：硅膠H-不含黏合劑 硅膠G-含煅石膏（13-15%） 硅膠F254- 既含煅石膏，又含熒光指示劑2

9、. 氧化鋁：可分為中性（pH7.5)、堿性（pH9.0）和酸性（pH4.0） （二）展開劑 常用的有： 石油醚環(huán)己烷二硫化碳四氯化碳三氯乙烷苯甲苯二氯甲烷乙醚氯仿乙酸乙酯正丁醇丙酮乙醇甲醇吡啶酸水第15頁/共32頁吸附劑與展開劑的選擇 展開劑的選擇：根據(jù)被測組分、吸附劑和展開劑本身的極性 吸附劑的選擇：根據(jù)被測物極性和吸附劑的吸附能力 被測物極性強弱極性吸附劑 被測物極性弱強極性吸附劑圖183第16頁/共32頁三、操作方法定性分析窄條定量分析1020cm 硅膠G自含粘和劑硅膠H不含粘和劑，鋪板時另加入CMC硅膠FH254含熒光劑，254nm紫外光照發(fā)綠光硅膠FH365含熒光劑，365nm紫外光

10、照發(fā)光（一）薄層板的制備（二）點樣：用毛細管或微量注射器，幾微升，24mm（三）展開：見續(xù)頁（四）顯色方法：日光、紫外光(254、365nm)顯色劑等第17頁/共32頁 連續(xù)展開：層析缸，預(yù)飽和，防止邊緣效應(yīng)浸入展開劑深度0.51.0cm，展開至整板3/4距離,標記。1 , 2樣品 3 標準品前沿原點 1.5-2.0cm2.0cm1 2 3展開方式第18頁/共32頁展開方式 二維展開在兩個垂直的方向上進行展開。將樣品點在薄層板的一個角上，展開適當距離后，揮干溶劑，再將薄層板以與原展開方向成90 的方向進行展開。原點12第19頁/共32頁四、定性和定量分析定性分析 利用保留值 測定Rf值 測定相

11、對Rf值，即Ris值。 利用二維色譜（改變色譜條件，比較Rf值是否一致） sb1b2b2sb1sb1b2點樣第一次展開第二次展開第20頁/共32頁定量分析 1. 目視比較半定量 2. 測量斑點面積 3. 洗脫法 4. 薄層掃描法第21頁/共32頁五、高效薄層色譜法 高效薄層色譜法（high performance thin layer chromatography；HPTLC) 所用的吸附劑顆粒很小 （5m或10m），用噴霧法制成高效薄層板。常用的有硅膠、氧化鋁、纖維素和化學(xué)鍵合相預(yù)制薄層板。第22頁/共32頁六、薄層掃描法 薄層掃描法是用一定強度光束照射薄層上的斑點，用儀器測量照射前后光束強

12、度的變化，從而求得物質(zhì)含量的方法。 檢測方法 紫外-可見吸收測定法和熒光測定法 測量方法 投射法和反射法 掃描方式 單波長和雙波長 影響薄層掃描定量的因素 均勻度 展開距離 隨行標準及點樣次序 顯色均勻度及穩(wěn)定性第23頁/共32頁第四節(jié) 紙色譜法 以紙做載體的色譜法，分離原理屬于液-液分配色譜法，操作與薄層法類似。 選紙 點樣 展開 顯色(定性)/洗脫(定量)固定相：紙纖維吸附的水流動相：與水不互溶的有機溶劑（水飽和正丁醇）分離機制：同液-液分配色譜定性參數(shù)：討論：Rf與組分性質(zhì)、流動相及溶解度有關(guān) 極性組分易保留，Rf ?。鲃酉鄻O性， Rf ） 非極性組分易流出，Rf大（流動相極性，Rf

13、）LdsRf原點到溶劑前沿的距離心的距離原點到組分斑點質(zhì)量中第24頁/共32頁本章小結(jié) 掌握: 平面色譜法的基本分離原理及相關(guān)參數(shù)的計算（比移值、相對比移值，分離度）；薄層色譜法的特點；吸附薄層色譜中吸附劑和展開劑的選擇原則。 熟悉: 薄層色譜法的主要操作步驟。 了解: 薄層掃描法的應(yīng)用及技術(shù)；紙色譜法的分離原理及實驗條件。第25頁/共32頁參考書及文獻1.分析化學(xué)（第四版）下冊，孫毓慶主編，人民衛(wèi)生出版社 2周同惠等紙色譜和薄層色譜。分析化學(xué)叢書第三卷第五冊北京：科學(xué)出版社，19893林珍安等譯高效薄層色譜上海：上?？萍汲霭嫔?，19844. 孫毓慶主編薄層掃描法及其在藥物分析中的應(yīng)用北京，人

14、民衛(wèi)生出版社，19905. Fried Band Sherma JThin-layer ChromatographyNew York：Marcel Dekker lnc，19826. Grinberg NModern Thin-layer ChromatographyNew York：Marcel Dekker lnc，1990。7. Sherma J and Fried BHandbook of Thin-Layer Chromatography. New York：Marcel Dekker lnc，1991. 第26頁/共32頁第27頁/共32頁第28頁/共32頁第29頁/共32頁（二）相平衡參數(shù) 相平衡參數(shù)：分配系數(shù)K和容量因子k前面推導(dǎo)出 R表示單位時間內(nèi)一個分子在流動相中出現(xiàn)的幾率，也可以表示組分分子在平面上移動的速度. RfL/L0=ut/u0t，定時展