歐洲藥典EP50

1、2.6.14 細菌內(nèi)毒素細菌內(nèi)毒素實驗是使用來自鱟（美洲鱟或東方鱟）的阿米巴細胞溶解物用于檢測或定量革蘭氏陰性細菌的實驗。本實驗有三種檢測技術：基于凝膠形成的凝膠法技術；基于內(nèi)源性基質斷裂后濁度的變化的濁度法技術；基于帶有生色團的合成肽斷裂后的顏色的變化的顯色法技術。本章介紹了下列6種方法：方法A凝膠法：限量實驗方法B凝膠法：半定量實驗方法C動態(tài)濁度法方法D動態(tài)顯色法方法E終點顯色法方法F終點濁度法可使用6種方法中的任何一種進行實驗。如果出現(xiàn)懷疑或爭議，除非文中另有規(guī)定，否則以方法A的結果為準。實驗應在可避免污染的方式下進行。器 具將所有的玻璃器皿和其它遇熱穩(wěn)定的器具置于熱空氣烘箱中用經(jīng)驗證的

2、的方法除熱原，常用的最少時間和溫度是250 30分鐘，如果使用塑料器具，如用于自動移液器的微量滴定板和移液吸頭，應使用經(jīng)證實無可測內(nèi)毒素及對實驗無干擾的器具。注：在本章中，“試管”這個詞泛指所有容器，例如微量滴定板孔內(nèi)毒素標準品原液的制備內(nèi)毒素標準品復溶原液是用經(jīng)過國際標準品校準的內(nèi)毒素參考標準品制備的，例如內(nèi)毒素標準品BRP。內(nèi)毒素以國際單位（IU）表示，世界衛(wèi)生組織規(guī)定國際標準品等于1 IU。注：1 IU=1 EU按照產(chǎn)品說明書和標簽上的說明制備和儲存內(nèi)毒素標準品復溶液。內(nèi)毒素標準品溶液的制備將內(nèi)毒素標準品原液強力混合后，用細菌內(nèi)毒素檢查用水（檢查用水）稀釋本復溶液制備合適的內(nèi)毒素稀釋液系

3、列。稀釋液應盡快使用以避免因吸附導致的活性損失。供試品溶液的制備用細菌內(nèi)毒素檢查用水溶解或稀釋活性物質或藥品制備供試品溶液，某些物質或產(chǎn)品可能更適合用其它水性溶液進行溶解或稀釋。如果有必要，調(diào)整供試品溶液的PH值以使試劑和供試品溶液的混合物的PH在試劑生產(chǎn)商所指定的范圍內(nèi)。這通常適用于PH值范圍在6.0-8.0之間的產(chǎn)品，PH值可按試劑生產(chǎn)商的推薦用酸、堿或緩沖液調(diào)節(jié)。酸堿可用細菌內(nèi)毒素檢查用水在無熱原的容器中用原液或固體制備。緩沖液必須經(jīng)驗證無可測內(nèi)毒素和干擾因子。最大有效稀釋倍數(shù)的確定最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）是允許的樣品的最大稀釋倍數(shù)，在此稀釋倍數(shù)下可確定內(nèi)毒素限值。內(nèi)毒素限值：非經(jīng)腸道

4、給藥的活性物質的內(nèi)毒素限值，用劑量定義，等于：K/MK=每小時每公斤體重的內(nèi)毒素閾熱原劑量M=每小時每公斤體重產(chǎn)品的最大推薦劑量非經(jīng)腸道給藥的活性物質的內(nèi)毒素限值用IU/ml、IU/Unit等生物活性單位表示。供試品溶液的濃度表示方法：如果內(nèi)毒素限值是以重量單位表示（IU/mg）則為mg/ml。如果內(nèi)毒素限值以生物活性單位表示（IU/Unit）則為Units/ml如果內(nèi)毒素限值以生物活性單位表示（IU/Unit）則為Units/ml=凝膠法技術中的標示靈敏度或濁度法或顯色法技術的標準曲線的最低點凝膠法技術（方法A和B）凝膠法技術可以檢測或定量內(nèi)毒素，它是基于試劑在出現(xiàn)內(nèi)毒素時形成凝膠的原理。在

5、標準條件下導致試劑形成凝膠所需要的內(nèi)毒素濃度為試劑的標示靈敏度，為確保實驗的精確和有效性，應按1. 預備性實驗所述進行標示靈敏度復核實驗和干擾實驗。1. 預備性實驗(i) 標示靈敏度復核實驗在使用鱟試劑做實驗前，應復核其標示靈敏度，以IU/ml表示，將試劑溶液重復4管進行實驗。當使用新批號的試劑或任何可能影響實驗結果的實驗條件改變時應進行試劑靈敏度復核。用細菌內(nèi)毒素檢查用水稀釋內(nèi)毒素標準品原液制備相當于2、0.5、0.25的至少4個濃度的標準品溶液。在一支試管中將等量的試劑溶液和其中一個濃度的標準品溶液（如0.1ml）混合，如果是使用裝有凍干試劑的單次實驗小瓶或安瓿，可直接將溶液加入瓶中或安瓿

6、中。根據(jù)試劑生產(chǎn)商的建議將反應混合物恒溫孵育一段時間（通常是37±1 60±2分鐘），避免震動。檢驗凝膠的完整性：如果是試管，從恒溫器中依次拿出每支試管，平穩(wěn)地倒轉大約180°一次，如果形成堅實的凝膠，倒轉過來時不滑脫，結果記為陽性，如果未形成完整的凝膠，則結果記為陰性。如標準品溶液的最低濃度的所有重復管的結果均為陰性，則實驗有效。終點是內(nèi)毒素系列遞減濃度中最后一個陽性結果，使用以下表達式計算終點濃度的對數(shù)平均值，然后求平均值的反對數(shù)：åe = 所用的稀釋系列的終點濃度對數(shù)值的和f = 重復管數(shù)終點濃度幾何平均值是試劑溶液（IU/ml）的測定靈敏度，如果

7、0.5ll2l，則標示靈敏度符合規(guī)定，用該批試劑進行實驗時使用該靈敏度。(ii) 干擾實驗按表2.6.14-1制備溶液A、B、C和D，供試品溶液稀釋倍數(shù)不得大于MVD，不含有任何可測內(nèi)毒素，按1. 預備性實驗（i）標示靈敏度復核實驗進行實驗。表 2.6.14-1溶液內(nèi)毒素濃度/加入內(nèi)毒素的溶液稀釋劑稀釋倍數(shù)初始內(nèi)毒素濃度重復管A無/供試品溶液-4B2l/供試品溶液供試品溶液12482l1l0.5l0.25l4444C2l/檢查用水檢查用水12482l1l0.5l0.25l2222D無/檢查用水-2溶液A=無可測內(nèi)毒素的供試品溶液溶液B=干擾對照溶液C=標示靈敏度對照溶液D=陰性對照（檢查用水）

8、使用1. 預備性實驗（i）標示靈敏度復核實驗中給出的表達式確定溶液B和C的終點濃度的幾何平均值。當有可能影響實驗結果的實驗條件改變時，重復干擾實驗。所有溶液A和D的重復管均為陰性，溶液C符合標示靈敏度復核實驗的規(guī)定，則實驗有效。如果用溶液B確定的試劑靈敏度0.5ll2l，則供試品溶液在此實驗條件下不含有干擾因素。否則溶液對實驗有干擾。如果稀釋倍數(shù)小于MVD的供試品溶液對實驗有干擾，可使用更大的稀釋倍數(shù)重復干擾實驗，但不得大于MVD。使用高靈敏度的試劑允許用更大的稀釋倍數(shù)制備供試品溶液，這有助于消除干擾。干擾可通過適當?shù)奶幚砜朔?，比如過中和、透析或熱處理，為了確定所選擇的處理方法能有效消除干擾而

9、又不會損失內(nèi)毒素，可使用已加入內(nèi)毒素并用所選擇的處理方法處理過的供試品溶液重復干擾實驗。2. 限量實驗方法（方法A）（i） 實驗過程按照表2.6.14-2制備溶液A、B、C和D，并按照1. 預備性實驗（i）標示靈敏度復核實驗敘述的過程進行實驗。表2.6.14-2溶液內(nèi)毒素濃度/加入內(nèi)毒素的溶液重復管數(shù)ABCD無/稀釋的供試品溶液2l/稀釋的供試品溶液2l/檢查用水無/檢查用水2222用不大于MVD的稀釋倍數(shù)制備溶液A和B（陽性產(chǎn)品對照），并用1. 預備性實驗（ii）干擾實驗中所述的處理方法處理。溶液B和C含有2l濃度的內(nèi)毒素標準品，溶液D（陰性對照）為檢查用水。（ii） 結果判斷陽性對照溶液B

10、和C的兩支重復管結果均為陽性，陰性對照溶液D所有重復管均為陰性，則實驗有效。當溶液A的兩支重復管結果均為陰性時，供試品檢測合格。當溶液A的兩支重復管中有一支為陽性時：如果供試品已稀釋到MVD，產(chǎn)品不合格；如果供試品的稀釋倍數(shù)小于MVD，用更大的稀釋倍數(shù)稀釋供試品重復實驗，但不得大于MVD。3. 半定量實驗（方法B）（i） 實驗過程 本實驗通過確定終點濃度來定量供試品溶液的細菌內(nèi)毒素。按照表2.6.14-3制備溶液A、B、C和D，根據(jù)1. 預備性實驗（i）標示靈敏度復核實驗檢測這些溶液。（ii） 計算和結果判斷除非符合以下三個條件，否則實驗無效：（a） 溶液D（陰性對照）的兩支重復管結果均為陰性

11、；（b） 溶液B（陽性對照）的兩支重復管的結果均為陽性；（c） 溶液C的終點濃度幾何平均值在0.5和2范圍之間要確定溶液A的內(nèi)毒素濃度，可將每一終點對應的稀釋倍數(shù)乘以l計算出每個稀釋系列的每支重復管的終點濃度。供試品溶液的內(nèi)毒素濃度是重復管的終點濃度的幾何平均值（見1. 預備性實驗（i）標示靈敏度復核實驗中給出的表達式）。如果是用稀釋的供試品溶液進行實驗，用測得的濃度乘以稀釋倍數(shù)計算原始溶液的內(nèi)毒素濃度。在一個有效實驗中，如果供試品溶液的稀釋液的檢測結果都不是陽性，內(nèi)毒素濃度記為小于（或如果是檢測稀釋的樣品，記為小于´樣品的最小稀釋倍數(shù)）。如果所有的稀釋液結果均為陽性，內(nèi)毒素濃度記為

12、大于等于最大稀釋倍數(shù)乘以（例如表2.6.14-3中，初始稀釋倍數(shù)´8´）。如果內(nèi)毒素濃度小于規(guī)定的值，則供試品符合實驗要求。光度法技術（方法C、D、E和F）1. 濁度法技術（方法C和F）該技術是測定濁度變化的一種光度法實驗。根據(jù)所使用實驗原理，該技術分為終點濁度法實驗或動態(tài)濁度法實驗。終點濁度法實驗是基于內(nèi)毒素濃度與反應結束時反應混合物的濁度（吸光度或透光度）之間的定量關系。動態(tài)濁度法實驗（方法C）是一種測定反應混合物達到預定吸光度所需的時間（反應時間）或濁度變化率的方法。該實驗應在試劑生產(chǎn)商推薦的恒溫溫度下進行（通常是37±1）。2. 顯色法技術（方法D和E）該

13、技術是用來測定內(nèi)毒素與鱟試劑反應中的顯色肽釋放出來的顯色團。依據(jù)所使用的實原理驗，本技術分為終點顯色法實驗或動態(tài)顯色法實驗。終點顯色法（方法E）是基于反應結束時內(nèi)毒素濃度與釋放出來的顯色團數(shù)量之間的定量關系。動態(tài)顯色法（方法D）測定反應混合物達到預定吸光度所需的時間（反應時間）或顏色變化率。該實驗應在試劑生產(chǎn)商推薦的恒溫溫度下進行（通常是37±1）。3. 預備性實驗為了確保濁度法和顯色法實驗的精確性或有效性，需進行預備性實驗以確保標準曲線符合規(guī)定以及供試品溶液不會干擾實驗。當有可能影響實驗結果的任何實驗條件發(fā)生改變，要求對實驗方法進行驗證。（i） 標準曲線的可靠性實驗使用內(nèi)毒素標準品

14、溶液制備至少3個內(nèi)毒素濃度建立標準曲線，每個濃度的內(nèi)毒素標準品溶液至少重復3管并按照試劑生產(chǎn)商的建議（容液比例，恒溫時間、溫度、pH等等）進行實驗。使用動態(tài)方法時，如果要求的范圍大于兩個對數(shù)數(shù)量級，則應該在標準曲線范圍內(nèi)添加額外標準品來支持每個對數(shù)數(shù)量級的遞增。在試劑生產(chǎn)商指定的內(nèi)毒素濃度范圍內(nèi)，相關系數(shù)的絕對值|必須大于等于0.980。（ii） 干擾實驗選擇一個內(nèi)毒素標準曲線中點或靠近中點的內(nèi)毒素濃度。按照表2.6.14-4制備溶液A、B、C和D，按照試劑生產(chǎn)商的建議（供試品溶液和試劑溶液的量，供試品溶液和試劑溶液的量的比例、恒溫時間等等）至少重復2管進行實驗。表2.6.14-3溶液內(nèi)毒素濃

15、度/加入內(nèi)毒素的溶液稀釋劑稀釋倍數(shù)初始內(nèi)毒素濃度重復管A無/供試品溶液-1248-2222B2l/供試品溶液供試品溶液12l2C2l/檢查用水檢查用水12482l1l0.5l0.25l2222D無/檢查用水-2溶液A=稀釋倍數(shù)不超過MVD的供試品溶液，已做過干擾實驗，供試品溶液的進一步的稀釋亦不能超過MVD，根據(jù)干擾實驗結果，使用檢查用水制備兩個稀釋系列1，1/2，1/4和1/8，也可使用其它合適的稀釋系列。溶液B=含有2l內(nèi)毒素標準品的溶液A（陽性產(chǎn)品對照）溶液C=含有2l、l、0.5l、0.25l濃度的內(nèi)毒素標準品的兩個檢查用水系列。溶液D=檢查用水（陰性對照）表2.6.14-4溶液內(nèi)毒素

16、濃度加入內(nèi)毒素的溶液重復管數(shù)A無供試品溶液不少于2管B標準曲線中點濃度供試品溶液不少于2管C至少3個濃度（l為最低濃度）檢查用水每個濃度不少于2管D無檢查用水不少于2管溶液A=供試品溶液，可用不大于MVD的稀釋倍數(shù)稀釋。溶液B=含中點濃度的供試品溶液，與溶液A稀釋倍數(shù)相同溶液C=內(nèi)毒素標準品溶液，濃度同3. 預備性實驗（i）標準曲線可靠性實驗（陽性對照）的驗證實驗中的濃度。溶液D=檢查用水（陰性對照）用含有添加內(nèi)毒素的供試品溶液的平均濃度減去未添加內(nèi)毒素的供試品溶液的平均濃度來計算添加的內(nèi)毒素的平均回收率。如果在實驗條件下，測得加入供試品溶液中的內(nèi)毒素的濃度在已知添加的內(nèi)毒素濃度的50%-20

17、0%范圍內(nèi)，則供試品溶液無干擾。當內(nèi)毒素回收率超過指定范圍，應按照凝膠法技術中1. 預備性實驗（ii）干擾實驗所述的方法去除干擾因子。4. 實驗(i) 過程按3. 預備性（ii）干擾實驗的實驗過程。(ii) 計算使用陽性對照系列溶液C創(chuàng)建的標準曲線計算溶液A的每支重復管的內(nèi)毒素濃度。實驗只有符合以下三個要求才有效：（a）溶液D（陰性對照）的結果不超過所使用的試劑要求的空白值的限值；（b）陽性對照系列溶液C的結果符合3.預備性實驗（i）標準曲線可靠性實驗中所定義的驗證的要求（c）用溶液B的內(nèi)毒素濃度減去溶液A的內(nèi)毒素濃度計算出來的內(nèi)毒素回收率在50%-200%范圍內(nèi)。(iii) 判斷如果溶液A的重復管的內(nèi)毒素濃度平均值小于產(chǎn)品的內(nèi)毒素限值，則所檢產(chǎn)品合格。5. 試劑（i）