目的基因與克隆載體的體外重組課件

1、第五章第五章 目的基因與載體的目的基因與載體的 體外重組體外重組基因工程的操作過程基因工程的操作過程切切接接轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)增增檢檢連接時(shí)考慮因素連接時(shí)考慮因素實(shí)驗(yàn)步驟盡量簡單易行實(shí)驗(yàn)步驟盡量簡單易行連接形成的節(jié)點(diǎn)序列應(yīng)能被重新切割連接形成的節(jié)點(diǎn)序列應(yīng)能被重新切割對轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)譯中密碼閱讀不發(fā)生干擾對轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)譯中密碼閱讀不發(fā)生干擾u粘性末端連接粘性末端連接u平末端連接平末端連接u末端延伸連接：末端延伸連接：連接方式連接方式同聚物加尾同聚物加尾加人工接頭加人工接頭加加DNA銜接物銜接物粘性末端連接粘性末端連接單酶切產(chǎn)生的粘性末端的連接單酶切產(chǎn)生的粘性末端的連接（同種酶）（同種酶）5 5GAATTCCTTAAGG

2、AATTCCTTAAGEcoRI5GCTTAAAATTCG5 退火退火GCTTAAAATTCG5 GCTTAA 5 AATTCGT4-DNA ligaseGAATTCCTTAAG5 5GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAG5 5GAATTCCTTAAG5 GCTTAA 55 AATTCG5 5 GAATTCCTTAAG5 EcoRI粘性末端連接粘性末端連接單酶切產(chǎn)生的粘性末端的連接單酶切產(chǎn)生的粘性末端的連接（同尾酶）（同尾酶）BamHI5 5GGATCCCCTAGGGGATCCCCTAGG5GCCTAGGATCCG5 5 TACTAG 55 GATCAT5 退火退火GCCTAGGAT

3、CCG5 TACTAG 5 GATCATT4-DNA ligaseTGATCCACTAGG5 5GGATCACCTAGT5 TGATCAACTAGT5 BclITGATCCACTAGG5 5GGATCACCTAGT粘性末端連接粘性末端連接雙酶切產(chǎn)生的粘性末端的連接雙酶切產(chǎn)生的粘性末端的連接5 5GAATTCCTTAAGGGACTTCCTGAAEcoRI5GCCTGAAATTCG5 退火退火GCCTGAAATTCG5 GCTTAA 5 GACTTAT4-DNA ligaseGAATTCCTTAAG5 5GGACTTCCTGAA5 GCTTAA 55 GACTTA5 5 GAATTCCTTAAGE

4、coRIGGACTTCCTGAABamBam平末端連接平末端連接HpaI5 5GTTAACCAATTGGTTAACCAATTG5GTTCAA AACTTG5 5 CCCGGG5 GGG CCC3 T4-DNA ligaseCCCAACGGGTTG5 5GTTGGGCAACCC5 CCCGGGGGGCCC5 StuI3 平末端連接平末端連接-不同粘性末端的平端連接不同粘性末端的平端連接BamHI5 5GGATCCCCTAGGGGATCCCCTAGG5GCCTAGGATCCG5 5 CTGCAG5 GACGTC3 T4-DNA ligaseCGATCCGCTAGG5 5GGATCGCCTAGC5

5、CTGCAGGACGTC5 PstI3 T4-DNA pol切平切平5 CG5 GCKlenow補(bǔ)平補(bǔ)平5GGATCCCTAGGATCC5 CTAGGCGATCCGCTAGG5 5GGATCGCCTAGC粘性末端的更換粘性末端的更換BamHI5 5GGATCCCCTAGGT4-DNA ligaseKlenow補(bǔ)平補(bǔ)平GATCC5 G5GCCTAG55 5GGATCCCTAG5 GATCCCTAGG55GGATCCTGCAGGATCCCCTAGGACGTCCTAGG5 5PstICTGCAGGACGTCPstI linker末端轉(zhuǎn)移酶（末端轉(zhuǎn)移酶（TDT）：在沒有模板存在的條件下，能催化）：在沒

6、有模板存在的條件下，能催化dNTP 隨機(jī)加于隨機(jī)加于DNA分子的分子的3-OH端端5 p3 HOOH 3 p 5 TDTMg2+ dATPAAAAAAAAAAAA OH 3 5 p3 HOp 5 同聚物尾巴同聚物尾巴 Poly（dA）末端延伸連接末端延伸連接同聚物加尾同聚物加尾C 3 GG5 G 3C5C3 GT4-DNA ligaseTdTTdTdTTPdATPGTTTTTTTTTT 3C退火退火C3 TTTTTTTTTTGCAAAAAAAAAA 3 GG3 AAAAAAAAAAC5 5GTTTTTTTTTTGCAAAAAAAAAACCAAAAAAAAAACGTTTTTTTTTTGS1C3

7、5 5GTTTTTTTTTTGCAAAAAAAAAACCAAAAAAAAAACGTTTTTTTTTTG加熱加熱GTCATTTTTTTTTGAAAAAAAAACCAGTAAAAAAAAACTTTTTTTTTGTGACCAGT末端延伸連接末端延伸連接同聚物加尾同聚物加尾 （平齊末端）平齊末端）末端延伸連接末端延伸連接同聚物加尾同聚物加尾 （33突出末端）突出末端）CTGCA 3 GG3 ACGTC5 GCATG 3C5C3 GTACGT4-DNA ligaseTdTTdTdCTPdGTPGCATGCCCCCC 3C退火退火Pst IPst IC3CCCCCCGTACGCTGCAGGGGGG 3 G

8、G3 GGGGGGACGTC5 5GCATGCCCCCC GC GGGGGGACGTCCTGCAGGGGGG CG CCCCCCGTACG5 5GCATGCCCCCC GC GGGGGGACGTCCTGCAGGGGGG CG CCCCCCGTACG5 5GCATGCCCCCCTGCAGCGTACGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCATGCGACGTCCCCCCGTACG5 5GCATGCCCCCCTGCAGCGTACGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCATGCGACGTCCCCCCGTACGKlenowPst ISph I末端延伸連接末端延伸連接同聚物加尾同聚物加尾 （55

9、突出末端）突出末端）5GCCTAGGATCCG5 5 GCTTAA 555 AATTCGT4-DNA ligase5 5Klenow補(bǔ)平補(bǔ)平Klenow補(bǔ)平補(bǔ)平5GGATCCCTAGGATCC5 CTAGG5 GAATTCTTAA 555 AATTCTTAAGTdTTdTdGTPdCTPGAATTGGGGGGCTTAA AATTCGGGGGGTTAAGGGATCCCCCCC CCTAGGATCCCCCCCCCTAGGGAATTGGGGGGGATCCCTTAACCCCCCCTAGGGGATCCCCCCCAATTCCCTAGGGGGGGTTAAG5 5GAATTGGGGGGGATCCCTTAACC

10、CCCCCTAGGGGATCCCCCCCAATTCCCTAGGGGGGGTTAAG退火退火B(yǎng)amH IBamH IEcoR IBamH I人工接頭：化學(xué)合成的兩條互補(bǔ)寡核苷酸連，上面人工接頭：化學(xué)合成的兩條互補(bǔ)寡核苷酸連，上面 帶有一帶有一 至數(shù)個(gè)限制酶識別位點(diǎn)至數(shù)個(gè)限制酶識別位點(diǎn)作用：加至待克隆的平末端作用：加至待克隆的平末端DNA片段兩側(cè)，酶切后片段兩側(cè)，酶切后 產(chǎn)生粘性末端產(chǎn)生粘性末端末端延伸連接末端延伸連接人工接頭加尾人工接頭加尾CCGAATTCGG5 GGCTTAAGCC5 EcoR I末端延伸連接末端延伸連接人工接頭加尾人工接頭加尾55 GCTTAA 555 AATTCGT4-DN

11、A ligase5 5T4-DNA ligase5CCGAATTCGG5 GGCTTAAGCCEcoR ICCGGGCTTAAAATTCGGGCCGAATTCGGCTTAAGCCCCGAATTCGGCTTAAG退火退火EcoR IEcoR IEcoR ICCGAATTCGGGGCTTAAGCCDNADNA銜接物：人工合成的雙鏈寡核苷酸片段，一頭為平末端銜接物：人工合成的雙鏈寡核苷酸片段，一頭為平末端 （與目的基因連接），另一頭為特定酶的切后粘（與目的基因連接），另一頭為特定酶的切后粘 性末端（與載體粘端連接）性末端（與載體粘端連接）末端延伸連接末端延伸連接DNADNA銜接物加尾銜接物加尾CCG

12、5 GGCTTAA5 EcoR I AATTCGG5 GCC5 EcoR I重組率重組率重組率的定義：重組率的定義： 重組率 = 含有外源DNA的重組分子數(shù) / 載體分子總數(shù) （在常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件下，重組率一般為25 - 75%） 重組率是衡量連接反應(yīng)效率的重要指標(biāo)，較高的重組率可以大大簡化DNA重組的后續(xù)操作。重組率重組率提高重組率的方法：提高重組率的方法：提高外源DNA片段與載體的分子比：5 : 1 10 : 1 載體DNA分子在連接前先除去磷酸基團(tuán)： 5 5GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGEcoRI5GCTTAA pAATTCG5 p5 GCTTAA OH 55 AATTCG5 HO退火退火5 G-A-A-T-T-CC-T-T-A-A G5G A-A-T-T-CC-T-T-A-A-GOHHOOHHO堿性磷酸酶堿性磷酸酶5 GAATTCCTTAAG5 重組率重組率提高重組率的方法：提高重組率的方法：人工構(gòu)建粘性末端： CTGCA 3 GG3 ACGTC5 GCATG 3 C5C3 GTACGT4-DNA ligaseTdTT