梅毒檢測(cè)課件

1、梅毒實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)梅毒實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)與與評(píng)價(jià)評(píng)價(jià) 貴陽(yáng)市疾病預(yù)防控制中心貴陽(yáng)市疾病預(yù)防控制中心 謝謝 芳芳 學(xué)學(xué) 習(xí)習(xí) 內(nèi)內(nèi) 容容一、梅毒的現(xiàn)狀及定義二、梅毒螺旋體的生物學(xué)特性三、梅毒實(shí)驗(yàn)室檢查方法四、梅毒血清學(xué)診斷試驗(yàn)五、梅毒血清學(xué)試驗(yàn)的結(jié)果解釋六、梅毒實(shí)驗(yàn)室操作要求七、存在的問(wèn)題一、梅毒的現(xiàn)狀及定義一、梅毒的現(xiàn)狀及定義一、梅毒的現(xiàn)狀1、近年來(lái)我國(guó)嚴(yán)峻的梅毒流行形勢(shì)（梅毒實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)不規(guī)范現(xiàn)狀）。2、今年衛(wèi)生部出臺(tái)梅毒10年控制規(guī)劃（梅毒血清學(xué)檢測(cè)、新方法、新技術(shù)的應(yīng)用性評(píng)估）3、目前我國(guó)僅對(duì)首次就診的孕產(chǎn)婦制訂了梅毒篩查方案，即：首先采用非梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗(yàn)或梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗(yàn)之

2、一進(jìn)行初篩，當(dāng)篩查結(jié)果為陽(yáng)性時(shí)，需用另一類試驗(yàn)進(jìn)行復(fù)檢。對(duì)一般人群尚無(wú)明確的篩查診斷流程。二、梅毒的定義梅毒是一種全球分布的系統(tǒng)性性傳播疾病。梅毒的病原體是蒼白螺旋體（Treponemia pallidum，TP）。人是梅毒的唯一傳染源，主要傳播途徑主要有性傳播、血液傳播和母嬰傳播3種，可侵犯人體全身器官，臨床表現(xiàn)分為一期梅毒、二期梅毒、三期梅毒和潛伏梅毒，既能產(chǎn)生各種各樣的癥狀和體征，又可多年無(wú)癥狀而呈潛伏狀態(tài)，對(duì)人類健康危害極大。二、梅毒螺旋體的生物學(xué)特性1.長(zhǎng)度為8m20m，平均8m10m，直徑0.2m,有 612個(gè)螺旋。2.因其透明不易染色，故稱為蒼白螺旋體。3.梅毒螺旋是一種小而纖細(xì)

3、的螺旋狀微生物。4.梅毒螺旋體的特征是螺旋體整齊而規(guī)則，折光性強(qiáng)，較其他螺旋體亮。5.運(yùn)動(dòng)緩慢而有規(guī)律，具有三種特征性運(yùn)動(dòng)方式：常見(jiàn)是圍繞其長(zhǎng)軸旋轉(zhuǎn)前后移動(dòng)；其次是全身彎曲如蛇行；少見(jiàn)的是伸縮其螺旋間距而前進(jìn)6.梅毒螺旋體至今還不能在人工培養(yǎng)基上生長(zhǎng)繁殖，目前只能將其接種到兔睪丸內(nèi)增殖、傳代和保存。以橫斷分裂的方式進(jìn)行增殖，世代時(shí)間為30小時(shí)33小時(shí)。7.梅毒螺旋體在體外不易存活，煮沸、干燥，一般的消毒劑如汞劑、石炭酸、乙醇等很容易將其殺死。在4142時(shí)經(jīng)過(guò)1小時(shí)2小時(shí)也可將其殺死。8.低溫（-70-196）下可保存數(shù)年并保持其形態(tài)、活力及毒性。三、梅毒實(shí)驗(yàn)室檢查方法梅毒的臨床實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法較

4、多，概括起來(lái)分為梅毒的病原體檢查、梅毒的血清免疫學(xué)檢查和梅毒的核酸檢查3大類。（一）病原體檢查方法即梅毒螺旋體檢查，采用暗視野顯微鏡檢查或直接免疫熒光試驗(yàn)(direct fluorescent antibody test，DFA)，在顯微鏡下觀察梅毒螺旋體的特征性形態(tài)和運(yùn)動(dòng)方式。該方法是診斷早期現(xiàn)癥最直接的方法，但由于受到患者用藥、檢測(cè)儀器狀態(tài)和檢測(cè)人員技能等條件的制約，本方法實(shí)際檢出率并不高。未檢測(cè)到梅毒螺旋體，并不能排除患梅毒的可能性。本方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，也不適用于梅毒的大規(guī)模篩查。（二）（二）血清免疫學(xué)檢查方法1 1、非梅毒螺旋體抗原試驗(yàn) 檢測(cè)患者血清中宿主針對(duì)機(jī)體組織破壞后暴露的脂抗原或者

5、螺旋體表面的脂質(zhì)產(chǎn)生的非特異性抗類脂抗原的抗體(反應(yīng)素)。檢測(cè)方法包括：快速血漿反應(yīng)素環(huán)狀卡片試驗(yàn)RPR)；甲苯胺紅不加熱血清(TRUST)；性病研究實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)(VDRL)；不加熱血清反應(yīng)素試驗(yàn)(USR)。目前最常用的是RPR和TRUST。 由于在治療過(guò)程中反應(yīng)素滴度可呈動(dòng)態(tài)變化，非梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗(yàn)常用于臨床療效觀察、復(fù)發(fā)或再感染的檢查。同時(shí)，由于該方法操作簡(jiǎn)便、快速，成本低，特別適合基層應(yīng)用和人群調(diào)查。此類方法的缺點(diǎn)是反映不出既往感染，并且受其他疾病影響較大，易產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果（二）（二）血清免疫學(xué)檢查2 2、梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗(yàn) 目的 檢測(cè)梅毒螺旋體IgG、IgM抗體。 檢測(cè)方法

6、包括：梅毒螺旋體顆粒凝集試驗(yàn)（TPPA）梅毒螺旋體顆血球凝集試驗(yàn)（TPHA）梅毒酶聯(lián)免疫吸咐試驗(yàn)（TP-ELISA）化學(xué)發(fā)光免疫分析法（CLIA）梅毒快速檢測(cè)（TP-RT）梅毒螺旋體蛋白印跡試驗(yàn)（TP-WB）。 梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗(yàn)的共同優(yōu)點(diǎn)是特異性強(qiáng)，可以作為非梅毒螺旋體抗原試驗(yàn)初篩陽(yáng)性標(biāo)本的復(fù)檢或確證試驗(yàn) ，但是，由于感染梅毒螺旋體后，一旦梅毒螺旋體抗體試驗(yàn)呈陽(yáng)性，則患者長(zhǎng)時(shí)間甚至終生陽(yáng)性。所以這些方法不能區(qū)分既往感染和現(xiàn)癥感染。亦不能作為療效觀察的指標(biāo)。（三）梅毒螺旋體核酸檢查可對(duì)血漿、血清、皮損部位組織液、淋巴穿刺液及腦脊髓液等標(biāo)本的梅毒螺旋體核酸采用PCR進(jìn)行檢測(cè)。核酸檢查的優(yōu)點(diǎn)

7、是特異性高，在早期梅毒、神經(jīng)梅毒、先天梅毒和伴艾滋病梅毒等診斷中，以及螺旋體現(xiàn)癥感染和既往感染的鑒別診斷中具有一定的價(jià)值，也可應(yīng)用于梅毒螺旋體的耐藥性監(jiān)測(cè)、菌株流行病學(xué)分型。該方法缺點(diǎn)是成本高，對(duì)實(shí)驗(yàn)條件要求高并且易受多種因素影響，不宜做療效觀察。四、梅毒血清學(xué)診斷試驗(yàn)四、梅毒血清學(xué)診斷試驗(yàn)?zāi)壳埃范镜膶?shí)驗(yàn)室血清學(xué)診斷技術(shù)是檢測(cè)梅毒螺旋體抗體主要方法有兩類： 1.非梅毒螺旋體血清試驗(yàn) 2.梅毒螺旋體血清試驗(yàn)（一）非梅毒螺旋體血清試驗(yàn)（一）非梅毒螺旋體血清試驗(yàn)1 1非梅毒螺旋體抗原試驗(yàn) ：用心磷脂、卵磷脂、及膽固醇做抗原，檢測(cè)宿主對(duì)梅毒螺旋體表面的類脂物質(zhì)所產(chǎn)生的IgG和IgM抗體（抗心磷脂抗體

8、，反應(yīng)素 包括VDRL、USR 、RPR、TRUST試驗(yàn)等 性病研究實(shí)驗(yàn)室玻片試驗(yàn)（VDRL）：屬于沉淀反應(yīng)，目前應(yīng)用最廣泛。用心擬脂、卵磷脂、膽固醇為抗原，可作定性和定量試驗(yàn)，操作簡(jiǎn)單，費(fèi)用低，常用作大量病人的篩選及療效觀察。但在一期梅毒時(shí)敏感性不夠高，以及弱陽(yáng)性時(shí)判讀結(jié)果困難為其缺點(diǎn)。 血清不需加熱的反應(yīng)素試驗(yàn)（URS）：此法在國(guó)內(nèi)已逐步推廣使用，也是一種非螺旋體抗原原血清沉淀試驗(yàn)。其原理是在VDRL所用抗原中加入了EDTA（乙二胺四醋酸）和氯化膽堿，使操作更為簡(jiǎn)單，更便于讀結(jié)果，其敏感性與特異性和VDRL相同。 快速血漿反應(yīng)素環(huán)狀卡片試驗(yàn)(RPR):此試驗(yàn)是VDRL試驗(yàn)的一種改良方法。該

9、法是在抗原中加入活性炭顆粒作為指示物，加入了氯化膽堿，因此血清不需滅活。特制的白色紙卡替代了玻片。試驗(yàn)結(jié)果易于判斷，肉眼即可觀察。也可用血漿進(jìn)行檢測(cè)，試驗(yàn)結(jié)果可保存。抗原放4冰箱可保存1年。（一）非梅毒螺旋體（一）非梅毒螺旋體血清試驗(yàn)試驗(yàn)2 2臨床應(yīng)用價(jià)值：1.簡(jiǎn)便、快速、敏感性和特異性較好2.可用于大規(guī)模的人群和產(chǎn)前篩查3.指示目前疾病的活動(dòng)程度4.可作定量試驗(yàn)，用于療效觀察，早期梅毒經(jīng)有效治療后，抗體滴度會(huì)下降，並轉(zhuǎn)為陰性，如抗體滴度不下降或下降緩慢或下降后又上升，說(shuō)明治療失敗、復(fù)發(fā)或再感染。5.晚期梅毒可自然轉(zhuǎn)陰。 材 料(以RPRRPR為例)a.RPR試劑盒：含RPR抗原；直徑為18m

10、m圓圈的特制白色反應(yīng)卡片；標(biāo)準(zhǔn)針頭（601滴/mL）；RPR試驗(yàn)結(jié)果圖片。b.其他：水平旋轉(zhuǎn)器。 定性試驗(yàn)a. 吸取0.05 mL血清或血漿加于卡片圈內(nèi)，并均勻地涂布在整個(gè)圈內(nèi)（每張紙卡有10個(gè)或12個(gè)反應(yīng)圈）；b. 將抗原輕輕搖勻，用標(biāo)準(zhǔn)針頭吸取抗原，每個(gè)標(biāo)本加1滴抗原；c. 將卡片置水平旋轉(zhuǎn)器旋轉(zhuǎn)8 min；d. 立即在明亮光線下觀察結(jié)果。 結(jié)果中到大的黑色絮狀物，液體清亮 3+4+ 強(qiáng)陽(yáng)性小到中的黑色絮狀物，液體較清亮 2+ 陽(yáng)性小的黑色絮狀物，液體混濁 1+ 弱陽(yáng)性僅見(jiàn)活性炭顆粒集于中央一點(diǎn)或均勻分散 陰性 定量試驗(yàn)RPR定量試驗(yàn)與TRUST試驗(yàn)相同。 a.在圈內(nèi)加入0.05 mL等滲

11、鹽水（一般作68個(gè)稀釋度）勿將鹽水涂開； b. 吸取0.05 mL血清或血漿作系列稀釋（1:21:64），當(dāng)稀釋到最后的第6孔時(shí)，棄去0.05 mL稀釋液。從第6孔起將血清稀釋液涂布整個(gè)圈內(nèi)，再涂布第5孔，依此向前到第1孔。 c. 滴加抗原，旋轉(zhuǎn)時(shí)間、速度和觀察結(jié)果同定性試驗(yàn)。RPR試驗(yàn)結(jié)果（二）梅毒螺旋體抗原血清試驗(yàn)梅毒螺旋體血清試驗(yàn)方法有梅毒螺旋體血清試驗(yàn)方法有: : 1.TPHA( 1.TPHA(梅毒螺旋體血凝試驗(yàn)梅毒螺旋體血凝試驗(yàn)) ) 2.TPPA 2.TPPA（明膠顆粒凝集試驗(yàn)）（明膠顆粒凝集試驗(yàn)） 3.FTA 3.FTAABSABS（熒光抗體吸收試驗(yàn)）（熒光抗體吸收試驗(yàn)） 4.T

12、P-ELISA 4.TP-ELISA（免疫吸附試驗(yàn)）（免疫吸附試驗(yàn)） 5.TP-WB 5.TP-WBTPTP和和TPLATPLA（蛋白印跡試驗(yàn)）（蛋白印跡試驗(yàn)） 方法簡(jiǎn)便，結(jié)果易讀，適用于大量標(biāo)本的檢測(cè)。方法簡(jiǎn)便，結(jié)果易讀，適用于大量標(biāo)本的檢測(cè)。 FTAFTAABSABS試驗(yàn)是試驗(yàn)是“金標(biāo)準(zhǔn)金標(biāo)準(zhǔn)”試驗(yàn)，具有敏感性高，特異性強(qiáng)等試驗(yàn)，具有敏感性高，特異性強(qiáng)等特點(diǎn)。不能作為觀察療效特點(diǎn)。不能作為觀察療效 優(yōu)點(diǎn)：特異性高優(yōu)點(diǎn)：特異性高， 對(duì)非特異性試驗(yàn)進(jìn)行證實(shí)對(duì)非特異性試驗(yàn)進(jìn)行證實(shí) 缺點(diǎn)：不能區(qū)分是新發(fā)感染或治療后缺點(diǎn)：不能區(qū)分是新發(fā)感染或治療后， 通常終身持續(xù)陽(yáng)性通常終身持續(xù)陽(yáng)性 梅毒螺旋體明膠

13、顆粒凝集試驗(yàn)（TPPA）原理:TPPA試驗(yàn)用梅毒螺旋體致敏明膠顆粒，此致敏顆粒與人血清中的抗梅毒螺旋體抗體結(jié)合，產(chǎn)生可見(jiàn)的凝集反應(yīng)。明膠顆粒為玫瑰紅色，便于肉眼觀察結(jié)果。 材 料（以TPPA為例）a. TPPA試劑盒：含蒸餾水（標(biāo)記A），用于溶解致敏顆粒、未致敏顆粒和質(zhì)控血清；標(biāo)本稀釋液（標(biāo)記B），用于稀釋血清標(biāo)本；致敏顆粒（標(biāo)記C），冷凍干燥品，用前30 min按規(guī)定量加A液溶解并混勻；未致敏顆粒（標(biāo)記D），冷凍干燥品，用前30 min按規(guī)定量加A液溶解并混勻；質(zhì)控血清（標(biāo)記E），冷凍干燥品，用時(shí)按規(guī)定量加入A液。b. 其他：U型微量反應(yīng)板；微量加樣器 (25L )；微量滴管 (C和D管)；

14、移液管 (微量移液管和刻度滴管)；微量板振蕩器。梅毒螺旋體明膠凝集試驗(yàn)（梅毒螺旋體明膠凝集試驗(yàn)（TPPATPPA） 定量試驗(yàn)定量試驗(yàn)a. 加B液至微量反應(yīng)板孔，第1孔第4孔與定性試驗(yàn)相同，第5孔第10孔各加25L；b. 取血清25L加至第1孔，如定性試驗(yàn)稀釋方法，從第2孔第10孔混勻，混勻后第10孔棄去25L；c. 第3孔加D液25L，第4孔第10孔各加C液25L；d. 以后步驟同定性試驗(yàn)。結(jié)果以最高血清稀釋度能產(chǎn)生陽(yáng)性反應(yīng)的稀釋度為抗體滴度結(jié)果顆粒光滑覆蓋整個(gè)孔底，有時(shí)邊緣有折疊 陽(yáng)性 4+顆粒光滑覆蓋大部分孔底 陽(yáng)性 3+顆粒光滑集聚覆蓋孔底，周圍有一顆粒環(huán) 陽(yáng)性 2+顆粒光滑集聚覆蓋孔底

15、，周圍有一明顯顆粒環(huán) 陽(yáng)性 1+顆粒沉集孔底，中央形成一小點(diǎn) 可疑 顆粒緊密沉積孔底中央 陰性 - 報(bào)告方法報(bào)告方法 a. 陽(yáng)性報(bào)告：定性試驗(yàn)，血清在1:80以上稀釋度與致敏顆粒發(fā)生凝集反應(yīng)（1+或更強(qiáng)），與未致敏顆粒（第3孔）不發(fā)生凝集反應(yīng)。定量試驗(yàn)則應(yīng)報(bào)告發(fā)生陽(yáng)性反應(yīng)的血清最高稀釋度，為血清滴度。b. 陰性報(bào)告：血清與致敏顆粒和未致敏顆粒均不發(fā)生凝集反應(yīng)。 注意事項(xiàng)注意事項(xiàng) a. 微量反應(yīng)板要清潔干凈，孔內(nèi)無(wú)異物。b. 加入血清后，使用微量板振蕩器振蕩反應(yīng)板，而不可使用水平旋轉(zhuǎn)儀。c. 試劑盒不可置于0以下，防止凍結(jié)。不同批號(hào)試劑不可混合使用。 d. 如未致敏顆粒出現(xiàn)凝集反應(yīng)，應(yīng)將血清進(jìn)行

16、吸收處理后再進(jìn)行試驗(yàn)，或用其他試驗(yàn)方法。 梅毒血清反應(yīng)的假陽(yáng)性反應(yīng)（1）梅毒血清反應(yīng)假陽(yáng)性的分類 技術(shù)性假陽(yáng)性反應(yīng) 由于標(biāo)本的保存不當(dāng)（如細(xì)胞污染或溶血）、試劑質(zhì)量差或過(guò)期、或?qū)嶒?yàn)室操作錯(cuò)誤所造成。 生物學(xué)假陽(yáng)性反應(yīng) 是由于患者有其他疾病或生理狀態(tài)發(fā)生變化，使梅毒血清試驗(yàn)出現(xiàn)陽(yáng)性（2）急性生物學(xué)假陽(yáng)性反應(yīng) 很多非梅毒螺旋體感染性疾病，如風(fēng)疹、水痘、傳染性單核細(xì)胞增多癥、病毒性肝炎、上呼吸道感染、肺炎球菌性肺炎、亞急性細(xì)菌性心內(nèi)膜炎、活動(dòng)性肺結(jié)核、絲蟲病和溝端螺旋體病等。五、梅毒血清學(xué)試驗(yàn)的結(jié)果解釋五、梅毒血清學(xué)試驗(yàn)的結(jié)果解釋 六、梅毒實(shí)驗(yàn)室操作要求 1 實(shí)驗(yàn)室要求清潔明亮，溫度保存在23 29

17、。 2儀器設(shè)備制定詳細(xì)的操作說(shuō)明書，定期維護(hù)。 3玻璃器皿或耗材要清潔干凈。 4試驗(yàn)操作要適合工作需要，操作人員要持證上崗。 5操作規(guī)程要確實(shí)可行，不得隨意改變。 6. 認(rèn)真精確操作標(biāo)本和試劑，包括各種移液器和所操作的 用具量的準(zhǔn)確。7定期檢查說(shuō)明書，操作保持與說(shuō)明書的一致。8 每次試驗(yàn)設(shè)立陽(yáng)性和陰性質(zhì)控，包括反應(yīng)性，介質(zhì)和每次試驗(yàn)操作記錄是否一致性；9標(biāo)本不應(yīng)溶血、乳糜狀，應(yīng)標(biāo)記血漿或血清，腦脊液是否有紅細(xì)胞；10常規(guī)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)具有一定的空間，所有試驗(yàn)的記錄，試驗(yàn)鑒定，溫度記錄和原始數(shù)據(jù)應(yīng)保留；11認(rèn)真監(jiān)督報(bào)告方式和記錄筆誤。 12. 梅毒血清學(xué)試驗(yàn)操作和結(jié)果分析標(biāo)本的采集和分離 編號(hào)或姓名登

18、記 采血、分離血清和貯存試劑準(zhǔn)備 溫度、器具的校正 試劑、血清和反應(yīng)板恢復(fù)到試驗(yàn)溫度 試劑鑒定試驗(yàn)操作 血清量的控制 試劑量的控制 旋轉(zhuǎn)儀速度和時(shí)間的控制 實(shí)驗(yàn)報(bào)告 核對(duì)編號(hào)或姓名 試驗(yàn)結(jié)果分析 重復(fù)試驗(yàn)(結(jié)果與臨床表現(xiàn)不符) 進(jìn)一步與臨床核對(duì)（病理討論） 登記結(jié)果 發(fā)送報(bào)告 七、存在的問(wèn)題值得注意的是，臨床實(shí)驗(yàn)室采用梅毒血清學(xué)方法檢測(cè)標(biāo)本時(shí)，由于方法學(xué)本身的局限性、患者的特殊情況、實(shí)驗(yàn)條件和試劑或儀器的狀況等因素的影響，在結(jié)果判讀時(shí)，可能會(huì)出現(xiàn)假陰性或假陽(yáng)性的情況。1前帶現(xiàn)象：是指臨床上符合梅毒體征，但未經(jīng)稀釋血清的TRUST或RPR實(shí)驗(yàn)呈陰性或弱陽(yáng)性，若將血清稀釋后重復(fù)實(shí)驗(yàn)，便可出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果。原因是血清中抗心磷脂抗體過(guò)多，抑制了沉淀反應(yīng)的出現(xiàn)。為避免此類情況，不能只做原倍血清的檢測(cè)，可以同時(shí)作倍比稀釋血清的滴度檢測(cè)。2病程的影響：初期或晚期梅毒患者血清TRUST或RPR可呈假陰性。原因是感染初期，非特異性心磷脂抗體遲于特異性抗體出現(xiàn)在血清中，而晚期梅毒非特異性抗體可消失。因此，RPR實(shí)驗(yàn)不適合一期、三期和治療后梅毒的診斷3溫度的變化：RPR是絮狀沉淀反應(yīng)，溫度可以改變絮狀物形成的速度，可能導(dǎo)致RPR假陰性。4、操作