下游實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

1、實(shí)驗(yàn)一 牛奶中酪蛋白的制備一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.學(xué)習(xí)從牛乳中制備酪蛋白的方法。2.了解從牛奶中制取酪蛋白的原理。二、實(shí)驗(yàn)原理牛乳中的主要蛋白質(zhì)是酪蛋白，含量約為3.5g/100ml。酪蛋白是含磷蛋白質(zhì)的混合物，相對密度1.25-1.31，不溶于水、醇、有機(jī)溶劑，等電點(diǎn)為4.7。利用等電點(diǎn)時(shí)溶解度最低的原理，將牛乳的pH值調(diào)至4.7時(shí)，酪蛋白就沉淀出來。用乙醇洗滌沉淀物，除去脂質(zhì)雜質(zhì)后便可得到純的酪蛋白。三、原料與器材 鮮牛奶、恒溫水浴鍋、臺式離心機(jī)、抽濾裝置。四、試劑1.95%乙醇2.無水乙醚3.0.2mol/l的醋酸-醋酸鈉緩沖液A液（0.2mol/l的醋酸-醋酸鈉溶液）：稱取NaAc.3H2O5

2、4.44g，定容至2000ml。B液（0.2mol/l的醋酸-醋酸鈉溶液）：稱取優(yōu)級純醋酸（含量大于99.8%）12.0g，定容至1000ml。取A液1770ml與B液1230ml混合即得pH4.7的醋酸-醋酸鈉緩沖液3000ml。4.乙醇-乙醚混合液 乙醇：乙醚=1：1（體積比）。五、操作步驟1.將5ml牛奶置試管或小燒杯中，在水浴中加熱至40，在攪拌下漫漫加入預(yù)熱至40（應(yīng)注意兩種液體都應(yīng)先預(yù)熱至40再用），pH4.7的醋酸-醋酸鈉緩沖液5ml，用精密pH試紙或酸度計(jì)調(diào)pH至4.7(用1%NaOH或10%醋酸溶液進(jìn)行調(diào)整)。觀察牛奶開始有絮狀沉淀出現(xiàn)后，保溫一定時(shí)間使沉淀完全。將上述懸浮液

3、冷卻至室溫。離心分離8min（8000r/min）或15min（2000r/min），棄去上清液，得到酪蛋白粗制品。2.用蒸餾水洗滌沉淀3次（洗滌時(shí)將沉淀顆粒用干凈吸管吹開或用毛細(xì)管的封閉一端攪開，充分洗滌），離心5min（12000r/min）或10min（3000r/min），棄去上清液。3.在沉淀中加入3ml95%的乙醇，攪拌片刻，將全部懸濁液轉(zhuǎn)移至布氏漏斗中抽濾。用乙醇-乙醚混合液洗滌沉淀2次，最后用乙醚洗滌沉淀2次，抽干。4.將沉淀攤開在表面皿上，風(fēng)干，得酪蛋白精制品。5.稱取所獲酪蛋白的質(zhì)量（g）。六、計(jì)算含量和得率：酪蛋白含量（g/ml）=酪蛋白（g）/5ml×100%

4、；得率=測得含量/理論含量×100%。七、實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)：1.離心管中裝入樣品后必須嚴(yán)格配平，否則對離心機(jī)損壞嚴(yán)重；2.離心管裝入樣品后必須蓋嚴(yán)，并擦干表面的水分和污物后方可放入離心機(jī)。3.離心機(jī)用完后應(yīng)拔下電源，然后檢查離心腔中有無水跡和污物，擦除干凈后才能蓋上蓋子放好保存，以免生銹和損壞。八、思考題：1.為什么調(diào)整溶液的pH可以將酪蛋白沉淀出來？2.試設(shè)計(jì)一個(gè)利用蛋白質(zhì)其他性質(zhì)提取蛋白質(zhì)的實(shí)驗(yàn) 。10實(shí)驗(yàn)二、雙水相萃取相圖的繪制及BSA分配系數(shù)的測定一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.掌握繪制雙水相相圖的方法2.理解雙水相形成條件和定量關(guān)系3.掌握PEG/無機(jī)鹽體系雙水相萃取蛋白質(zhì)的方法4.了解影響蛋

5、白質(zhì)在雙水相體系中分配行為的主要參數(shù)二、實(shí)驗(yàn)原理雙水相是指某些高聚物之間或高聚物與無機(jī)鹽之間在水中以一定的濃度混合而形成互不相容的兩相，由于溶質(zhì)在兩相間的分配系數(shù)的差異而進(jìn)行萃取的方法即為雙水相萃取。雙水相形成條件和定量關(guān)系常用相圖來表示（見圖1）。成相物質(zhì)都能與水無限混合，當(dāng)它們的組成位于曲線的上方時(shí)（用M點(diǎn)表示）體系就會(huì)分成兩相，分別有不同的組成密度，輕相（或稱上相）組成用T點(diǎn)表示，重相（或稱下相）組成用B點(diǎn)表示，T、B點(diǎn)稱為節(jié)點(diǎn)。直線TMB稱為系線，是相圖的重要特征，關(guān)系到相的平衡組成。所有組成在系線上的點(diǎn)，分成兩相后，其上下相組成均分別為T、B，但是其體積比（VT/VB）不同。相體積比

6、可由相圖上線段比（BM/MT）估算，即服從杠桿規(guī)則。本實(shí)驗(yàn)繪制PEG/(NH4)2SO4體系雙水相相圖。圖1雙水相體系相圖與一般分離純化技術(shù)相比，雙水相萃取技術(shù)具有處理容量大、能耗低、易連續(xù)化操作和工程放大等優(yōu)點(diǎn)，在蛋白質(zhì)等生物大分子的分離純化等方面受到廣泛重視，是一種有發(fā)展?jié)摿Φ囊子诠I(yè)化應(yīng)用的生物分離技術(shù)。影響蛋白質(zhì)及細(xì)胞碎片在雙水相體系中分配行為的主要參數(shù)有成相聚合物的種類、成相聚合物的分子質(zhì)量和總濃度、無機(jī)鹽的種類和濃度、pH值等。三、實(shí)驗(yàn)材料及儀器PEG1000原液（0.6g/mL，w/w=56.926%，密度1.054）；硫酸銨原液（0.43g/mL，密度1.2）。牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)

7、液（100g/mL，pH8.0）；考馬斯亮藍(lán)G-250蛋白試劑。紫外可見分光光度計(jì)。四、 實(shí)驗(yàn)方法1、雙水相相圖的繪制準(zhǔn)確稱取2.0mLPEG原液，加入25 mL具塞刻度試管中，然后逐滴加入硫酸銨原液，混合，直至試管中開始出現(xiàn)混濁為止，記錄加入硫酸銨量，算出PEG和硫酸銨在系統(tǒng)中的質(zhì)量百分濃度，再向試管中加入適量水（0.20.51.0 mL），使體系變澄清，記錄加入水的量，并繼續(xù)加入硫酸銨，使體系再次變混濁，如此反復(fù)操作二十幾次，計(jì)算達(dá)到混濁時(shí)PEG和硫酸銨在系統(tǒng)中的質(zhì)量百分含量，得出不同相對分子量的PEG和硫酸銨的雙節(jié)線相圖節(jié)點(diǎn)。以上述試驗(yàn)所得結(jié)點(diǎn)繪制出不同相對分子量的PEG/(NH4)2S

8、O4體系雙水相相圖。2、標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：按下表加入試劑。搖勻。放置2min后測定595nm吸光度值。管號1（空白）234567BSA標(biāo)準(zhǔn)液（mL）00.10.20.40.60.81蒸餾水（mL）1.00.90.80.60.40.20考馬斯亮藍(lán)G-250試劑（mL）5555555蛋白質(zhì)量（g）01020406080100OD5953、雙水相萃取BSA蛋白取4 mL PEG儲液和4mL硫酸銨溶液于干燥的10 mL刻度試管中，再加入1 mL牛血清白蛋白溶液，混勻，以少量蒸餾水調(diào)節(jié)體系總質(zhì)量為10g，混勻，靜置15min，讀取上下相體積及總體積，再將其倒入分液漏斗使上下相分開，并分別測上下相蛋白濃度。

9、五、 數(shù)據(jù)處理1、雙水相相圖的繪制表1 相圖節(jié)點(diǎn)數(shù)據(jù)序號PEG質(zhì)量（g）體系中鹽溶液（mL）鹽質(zhì)量（g）體系加水量（g）體系總質(zhì)量（g）PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)（w/w）鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)（w/w）1020.330.5n1.5根據(jù)數(shù)據(jù)結(jié)果繪制雙水相相圖2、標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：以蛋白量（g）為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。3、牛血清白蛋白分配系數(shù)有關(guān)計(jì)算公式：分配系數(shù)m=Ct/Cb ,相比R =Vt/Vb，萃取率Y=目標(biāo)相中的蛋白量/上下相中的總蛋白量。五.思考題1、如何利用雙水相相圖控制相比？2、PEG平均分子量及濃度、(NH4)2SO4濃度、pH值等因素如何影響雙水相體系中被提純物質(zhì)的分配平衡？實(shí)驗(yàn)三、離

10、子交換柱層析法分離氨基酸一. 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?. 學(xué)習(xí)離子交換樹脂分離氨基酸的基本原理。2. 掌握離子交換柱層析的基本操作。3. 掌握氨基酸和茚三酮顯色機(jī)理。二. 實(shí)驗(yàn)原理1離子交換層析法離子交換層析法（簡稱ICE）是分離和制備樣品混合物的液-固相層析方法。用離子交換劑（具有離子交換性能的物質(zhì)）作固定相，利用它與流動(dòng)相中的離子能進(jìn)行可逆的交換性質(zhì)來分離離子型化合物的層析方法。即溶液中的離子同離子交換劑上功能集團(tuán)交換反應(yīng)的過程。這種可逆地交換性質(zhì)是基于待測物質(zhì)的陽離子或陰離子和相應(yīng)的離子交換劑間的靜電結(jié)合，即根據(jù)物質(zhì)的酸堿性、極性等差異，通過離子間的吸附和脫吸附原理將電解質(zhì)溶液各組分分開。它是從復(fù)雜混

11、合物體系中分離性質(zhì)極為相似的生物分子的有效手段之一。層析時(shí)要根據(jù)物質(zhì)的解離性質(zhì)的差異，選用不同的離子交換劑進(jìn)行分離。由于帶電荷不同的各種物質(zhì)對離子交換劑有不同的親和力，通過改變洗脫液的離子強(qiáng)度和pH值，控制這種親和力，即可使這些物質(zhì)根據(jù)親和力大小順序依次從層析柱中洗脫下來。l 因?yàn)橛H和力不同，在洗提過程中，不同離子在離子交換柱上的遷移速度也不同，最后得以分離。l 帶電荷量少，與交換劑親和力小的先被洗脫下來；帶電荷量多，親和力大的后被洗脫下來2氨基酸的性質(zhì)氨基酸是兩性電解質(zhì)，分子上的凈電荷取決于氨基酸的等電點(diǎn)和溶液的pH值，各種氨基酸分子結(jié)構(gòu)不同，在同一pH值是所帶的電荷的性質(zhì)和多少不同，與離子

12、交換樹脂的親和力有差異，因此可以根據(jù)親和力從小到大的順序被洗脫液分別洗脫下來，達(dá)到分離的效果。R-SO3H + M+ = R-SO3M + H+R-NH3OH + Cl- = R-NH3Cl + OH-3 茚三酮反應(yīng)氨基酸名稱- COOH pKa-NH3+ pKaR group pKaAsp2.19.83.9Lys2.29.010.5茚三酮反應(yīng)是在加熱條件及弱酸環(huán)境下，氨基酸或肽與茚三酮反應(yīng)生成紫藍(lán)色（與脯氨酸或羥脯氨酸反應(yīng)生成(亮)黃色）化合物及相應(yīng)的醛和二氧化碳的反應(yīng)。三. 實(shí)驗(yàn)器材層析柱 1.0cm x 20cm；恒流泵；部分收集器；試管；燒杯；移液槍；電磁爐；水浴鍋；分光光度計(jì)四. 實(shí)

13、驗(yàn)試劑732型陽離子交換樹脂；洗脫液(0.45mol/L，pH5.3的檸檬酸鈉緩沖溶液)；顯色劑(2%茚三酮)；60%乙醇；混合氨基酸樣品液0.005mol/L(Asp、Lys)五. 實(shí)驗(yàn)步驟1. 樹脂的處理（已做好）新鮮樹脂用蒸餾水浸泡過夜，使之充分溶脹。用4倍提及的2mol/LHCl浸泡1h，傾去清液，用蒸餾水水洗至中性。再用2mol/LNaOH浸泡1h，用蒸餾水洗去NaOH至樹脂pH呈中性，最后用pH5.3檸檬酸鈉緩沖液浸泡，備用。（實(shí)驗(yàn)中這一部老師已經(jīng)做好，可以直接使用浸泡好的樹脂。）2. 裝柱前準(zhǔn)備選擇層析柱（1 x 20cm），觀察柱底端濾膜是否完好，分別用流水和蒸餾水沖洗干凈。將

14、層析柱垂直裝在鐵架臺上，柱進(jìn)水口和出水口裝上橡皮管，關(guān)閉柱底端出口，在柱內(nèi)注入少許（約1.0cm高）洗脫液，打開出水口，排凈管內(nèi)的空氣后關(guān)閉出水口。3. 裝柱向盛有已處理好的樹脂的燒杯中，加適量洗脫液，用玻棒輕輕將樹脂攪成懸浮狀。然后沿柱內(nèi)壁小心地加至適當(dāng)高度。倒入速度不要太快，以防產(chǎn)生泡沫和氣泡。待樹脂在柱底部有明顯沉積后，慢慢打開柱底端的出口，或用吸管吸去柱內(nèi)上層過多的洗脫液，繼續(xù)向柱內(nèi)加入懸浮的樹脂直至沉積后柱床體高度達(dá)6.0cm為止，液面高度為3-4cm。4. 平衡層析柱裝好后，接上已調(diào)好流速的恒流泵，用洗脫液以0.4ml/min的流速進(jìn)行平衡，直至流出液的pH值與洗脫液的pH值相同為

15、止（2-3倍柱床體積，約20min）。5. 加樣移去層析柱上端出口塞，打開層析柱底端出口，小心使層析柱內(nèi)液體流至層析柱床體表面時(shí)，立即關(guān)閉出口。用微量取液器吸取0.5ml氨基酸混合樣液沿柱內(nèi)壁緩慢地加入柱中，以免沖壞樹脂表面。加樣完畢后，慢慢打開層析柱底端出口，使液面流至與樹脂表面相平時(shí)，即行關(guān)閉。用移液槍吸取0.5ml洗脫液，重復(fù)上樣方法反復(fù)洗滌層析柱內(nèi)壁四周2-3次，當(dāng)最后一次洗脫液面流至與樹脂表面相平時(shí)立即關(guān)閉柱底端出口。6. 洗脫與收集用滴管吸取洗脫液，沿柱內(nèi)壁緩慢地加入柱中，以免沖壞樹脂表面。加至約3-4cm高后，接上層析柱上端出口塞，同時(shí)打開層析柱底端出口和已調(diào)好流速的恒流泵開關(guān)，

16、開始進(jìn)行自動(dòng)洗脫并計(jì)時(shí)。以每管4.0ml的條件進(jìn)行收集（10min/管，準(zhǔn)確計(jì)時(shí)），收集10管后關(guān)閉恒流泵停止收集（試管收集前應(yīng)事先編號）。7. 樣液的測定按下表所示配制待測溶液，用分光光度計(jì)測其在570nm下的吸光度。012345678910收集的樣液0.00.50.50.50.50.50.50.50.50.50.5洗脫液1.51.01.01.01.01.01.01.01.01.01.0茚三酮0.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.5100攝氏度保溫25min，冷卻至室溫60%乙醇3.03.03.03.03.03.03.03.03.03.03.0然后以吸光度為縱坐標(biāo)，洗脫液累計(jì)體積（每管4ml，故4ml為一個(gè)單位）為橫坐標(biāo)繪制洗脫曲線，并加以說明。六. 注意事項(xiàng)層析柱底端濾膜要完好，防止樹脂進(jìn)入導(dǎo)管后堵塞導(dǎo)管。倒入速度不要太快，以防產(chǎn)生泡沫和氣泡。裝柱的注意事項(xiàng)裝柱時(shí)應(yīng)注意液面不能低于數(shù)值表面。樹脂懸浮液的溫度要相對恒定或應(yīng)與室溫接近，否則柱床體內(nèi)易產(chǎn)生氣泡而影響層析效果。裝好的柱體應(yīng)該沒有“紋路”、節(jié)痕和氣泡，并且柱床體表面平整而均勻。否則需要重新裝柱直至達(dá)到要求為止。在裝柱的同時(shí)應(yīng)該將其他儀器設(shè)備（如：自動(dòng)部分收集器，恒流泵等）電源接通，