細(xì)胞工程復(fù)習(xí)

1、細(xì)胞工程第一章 植物組織培養(yǎng)簡介 細(xì)胞工程(Cell Engineering)：在體外培養(yǎng)生物細(xì)胞，并對細(xì)胞進(jìn)行生長與分化的調(diào)控、遺傳重組與改良，使其生產(chǎn)出人類所需要的產(chǎn)品。技術(shù)：細(xì)胞培養(yǎng)、分化調(diào)控、細(xì)胞融合、細(xì)胞器移植、轉(zhuǎn)基因等產(chǎn)品：（1）細(xì)胞、組織、器官、個(gè)體 （2）有用物質(zhì)天然藥物、色素、香精、抗體、多肽藥物、蛋白質(zhì)、酶、等Dolly誕生的意義：（1）大型哺乳動物的克隆技術(shù)成熟；（2）證明了高等動物的細(xì)胞全能性；（3）為人們快速繁殖優(yōu)良動物、改良動物、利用動物作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)藥物（疫苗、多肽類藥物、激素等）帶來了希望。植物組織培養(yǎng)=培養(yǎng)植物組織=無菌培養(yǎng)(aseptic culture

2、)、離體培養(yǎng)(in vitro culture)：在人工培養(yǎng)基(artificial medium)上無菌培養(yǎng)整株植物或植物的器官、組織、細(xì)胞或原生質(zhì)體。植物組織培養(yǎng)的類型：1.植株培養(yǎng)(Plant Culture)：在容器中無菌培養(yǎng)完整的植株。植株來源：由種子無菌萌發(fā)而來；通過器官、組織、細(xì)胞再生而來。在快速繁殖中，后期的成苗和壯苗階段屬植株培養(yǎng)。一般時(shí)間較短，但也有培養(yǎng)時(shí)間長的，直接形成產(chǎn)品。2.胚培養(yǎng) (Embryo culture)：無菌培養(yǎng)植物的成熟胚或未成熟胚，使其形成正常的植株。目的：促進(jìn)胚的提早萌發(fā)，縮短育苗時(shí)間；克服遠(yuǎn)源雜種胚的夭折，以獲得新的育種材料；在科學(xué)研究中，用胚培養(yǎng)

3、所得到的幼苗作為其它試驗(yàn)的材料。3.器官培養(yǎng)(Organ Culture)：無菌培養(yǎng)植物的根、莖、葉、芽、花、果等器官,使其增殖或形成其它的組織或器官等。4.組織培養(yǎng)(Tissue culture)：指無菌培養(yǎng)植物各種組織（如分生組織、形成層、木質(zhì)部、韌皮部、皮層、薄壁組織、胚乳等），或由外植體分化形成的愈傷組織（callus），使其增殖或者分化。愈傷組織（Callus）：具有旺盛分裂能力，但沒有組織和器官分化的細(xì)胞群。5. 花藥與花粉培養(yǎng)：無菌培養(yǎng)植物的花藥（帶花粉）或花粉，形成單倍體植株。有效的育種輔助手段：單倍體植株獲得以后，通過染色體加倍，即得到可以穩(wěn)定遺傳的純合二倍體，縮短植物育種年

4、限。6.細(xì)胞培養(yǎng) (Cell culture)：無菌培養(yǎng)植物的單細(xì)胞或小細(xì)胞團(tuán)?？捎糜冢褐参锟寺?、細(xì)胞系的誘變和變異體的篩選、生產(chǎn)有用化合物（useful chemicals）。7.原生質(zhì)體培養(yǎng) (Protoplast culture)：將無細(xì)胞壁的原生質(zhì)體培養(yǎng)成愈傷組織或植株。由于無細(xì)胞壁的障礙，原生質(zhì)體是實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)緣植物間大規(guī)模遺傳物質(zhì)重組的良好體系。植物組織培養(yǎng)簡史：1838年：Schwann 和Schleiden在細(xì)胞學(xué)說基礎(chǔ)上提出了細(xì)胞全能性（totipotency）假說：一個(gè)高等生物（動物和植物）身上所有的體細(xì)胞(somatic cells)均來自一個(gè)共同的細(xì)胞合子(受精卵）；在適當(dāng)?shù)?/p>

5、條件下，一個(gè)體細(xì)胞應(yīng)能像合子一樣可以發(fā)育成一個(gè)完整個(gè)體。細(xì)胞全能性假說是開展植物組織培養(yǎng)研究的理論基礎(chǔ)；驗(yàn)證細(xì)胞全能性假說是開展植物組織培養(yǎng)研究的動力。1902年：德國植物學(xué)家Gottlieb Haberlandt在世界上首次開展了植物組織培養(yǎng)研究，他分離和培養(yǎng)了許多植物的葉肉細(xì)胞、髓細(xì)胞、氣孔保衛(wèi)細(xì)胞。結(jié)果：細(xì)胞成活了數(shù)周，但不分裂、不增殖，以失敗告終。失敗的主要原因：當(dāng)時(shí)人們對植物細(xì)胞生長發(fā)育的了解太少。規(guī)律？營養(yǎng)條件？所用的培養(yǎng)基成分太簡單，沒有維生素和植物激素，特別是當(dāng)時(shí)人們還沒有發(fā)現(xiàn)植物激素。1904年：Hanning成功地培養(yǎng)了蘿卜和辣根的胚，使其提早長成小植株。1922年：Knu

6、dson成功地進(jìn)行了蘭花種子無菌萌發(fā)，促進(jìn)了蘭花育種、種苗生產(chǎn)和栽培，既而蘭花產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。顯現(xiàn)了植物組織培養(yǎng)的應(yīng)用價(jià)值。1925年：Laibach進(jìn)行了亞麻種間雜種幼胚培養(yǎng)，成功地獲得了雜種植株。1934年-1935年：器官培養(yǎng)獲得成功。White(懷特)成功地進(jìn)行了番茄根尖離體培養(yǎng)，繼代培養(yǎng)達(dá)400余天。培養(yǎng)基使用了含有豐富B族維生素的酵母提取物(yeast extract)， 發(fā)現(xiàn)了VtB對植物組織培養(yǎng)的重要性。1937年： White設(shè)計(jì)了第一個(gè)培養(yǎng)基，為White培養(yǎng)基(懷特培養(yǎng)基) 。1939年：組織培養(yǎng)獲得成功。 上世紀(jì)30年代發(fā)現(xiàn)了生長素（IAA) ， Gautheret，Nob

7、ecourt和White等在培養(yǎng)基中加入生長素，成功地培養(yǎng)了山毛柳、黑楊等植物的形成層，使其形成了愈傷組織(callus)，并且發(fā)現(xiàn)愈傷組織可在生長素培養(yǎng)基上大量增殖, 證明了生長素對植物細(xì)胞分裂的重要性。1943年：White出版了植物組織培養(yǎng)手冊專著，植物組織培養(yǎng)成為一門新的學(xué)科。1940S-1950S：植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)出現(xiàn)重大突破1948年: Skoog 和Tsui（崔徵）發(fā)現(xiàn)了腺嘌呤與生長素的配合可以控制煙草愈傷組織形成芽與根。1950S：發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞分裂素。1957年：Skoog和Miller發(fā)現(xiàn)用激動素可以代替腺嘌呤，煙草愈傷組織形成芽的效果增加3萬倍；發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞分裂素與生長素的濃度

8、比值決定著愈傷組織根或芽的形成。細(xì)胞分裂素/生長素的比值：高：形成芽；低：形成根；相當(dāng)：愈傷組織增殖，但不分化=植物器官分化的激素調(diào)控模式：具有普遍性：在很多植物上得到證明；是進(jìn)行植物組織培養(yǎng)技術(shù)研究最重要的指導(dǎo)思想。1952年：法國植物學(xué)家 Morel等培育了世界上第一例脫毒植物-大麗花（取分生組織培養(yǎng)）1958年：第一次證明了細(xì)胞全能性假說。Reinert J. 和 Steward F. C 成功地將胡蘿卜單細(xì)胞培養(yǎng)成完整的植株1959年：Morel發(fā)現(xiàn)了蘭花的快速無性繁殖方法擬原球莖（protocorm-like body=PLB）途徑1960年：Cocking 創(chuàng)造了酶解法生產(chǎn)原生質(zhì)體

9、技術(shù)，為原生質(zhì)體培養(yǎng)、融合和細(xì)胞重組打下了基礎(chǔ)。1962年：Murashige和Skook 發(fā)表了著名的植物組織培養(yǎng)基MS培養(yǎng)基（最常用）。1967年：Bourgin和Nitsh等通過花粉粒培養(yǎng)獲得煙草單倍體植株。1971年：Takebe等首次將煙草原生質(zhì)體培養(yǎng)成完整植株。1972年：Carlson等通過原生質(zhì)體融合進(jìn)行煙草種間雜交，并獲得了第一個(gè)種間雜種植株。1970S-1980S年：德國Reihard等在藥用植物細(xì)胞培養(yǎng)方面取得重要進(jìn)展，成功地進(jìn)行了治療心臟病藥物（地高辛）的生物轉(zhuǎn)化1979年：日本用植物細(xì)胞發(fā)酵方法大規(guī)模培養(yǎng)人參細(xì)胞，商業(yè)化生產(chǎn)人參皂甙。1985年：日本Mitsui（三井

10、）石化工業(yè)公司用紫草細(xì)胞培養(yǎng)商業(yè)化生產(chǎn)紫草素（色素，抗菌抗病毒，用于化妝品）。1985年：Horsch等報(bào)道了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草轉(zhuǎn)基因方法。煙草葉片浸泡在農(nóng)桿菌溶液中，通過篩選和植株再生，獲得了具有外源基因的植株，即轉(zhuǎn)基因植株（transgenic plant），創(chuàng)建了現(xiàn)代植物生物技術(shù)植物基因工程植物組織培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用：1. 植物科學(xué)研究的有效手段：可以提供均勻一致的試驗(yàn)材料（細(xì)胞、組織、器官、植株）；研究細(xì)胞分裂、生長、分化、細(xì)胞壁再生等過程與機(jī)理；研究基因的功能。2.快速繁殖優(yōu)良植物3.挽救和保存植物的優(yōu)良品種：通過分生組織培養(yǎng)可以重新獲得無毒植株（virus-free plant），并可以

11、通過超低溫保存，長期保存無毒植株的種質(zhì)；用于挽救瀕危植物資源。4.改良植物性狀：胚培養(yǎng)：可挽救遠(yuǎn)源雜交胚、獲得遠(yuǎn)源雜種植株；花藥（花粉）培養(yǎng)：可獲得單倍體，提高選擇效率、縮短育種年限；原生質(zhì)體融合技術(shù)：可克服有性雜交不親和，創(chuàng)造遠(yuǎn)源雜種、甚至新的物種；細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)：可用于細(xì)胞突變，更有效篩選突變體。離體再生技術(shù)為培育轉(zhuǎn)基因植物提供了保障：5. 生產(chǎn)有用物質(zhì)：藥品、色素、香料等物質(zhì)（研究用紅豆杉植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉醇）植物組織培養(yǎng)技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)：1. 不受氣候、季節(jié)和地理位置的影響；2. 不受病蟲害的影響3. 植物生長發(fā)育過程容易調(diào)控，容易根據(jù)市場需求調(diào)節(jié)生產(chǎn)；4. 

12、效率高、質(zhì)量好第二章  植物組織培養(yǎng)的設(shè)施一、 化學(xué)試劑：用于配制培養(yǎng)基無機(jī)試劑：硝酸鉀、硝酸銨、硝酸鈣、硫酸鉀、硫酸鎂、硫酸銨、硫酸銅、硫酸亞鐵、磷酸氫二鉀、氯化鈣、硼酸、鉬酸鈉等。有機(jī)試劑：維生素(B1、 B6、煙酸、生物素）、氨基酸、糖（碳源）、植物激素、凝固劑以及其它一些物質(zhì)。二、 無菌設(shè)備1. 滅菌鍋（autoclave）：最常用消毒的工具。種類多：手提式（如常見的醫(yī)用消毒鍋，體積?。?、立式（體積中等）和臥式（有中型和大型）之分；有自熱式（帶有加熱裝置）和外熱式（無加熱裝置，需要從外部加熱，如煤氣、電爐、蒸氣等）之分。使用什么樣的滅菌鍋，要根據(jù)植物組織培養(yǎng)的規(guī)模而

13、定。2.超凈工作臺（laminar air-flow cabinet）：細(xì)胞工程中必不可少的一種設(shè)備，極端重要，用于對植物材料進(jìn)行無菌操作。超凈工作臺=空氣過濾器，空氣經(jīng)過12次粗濾后，最后通過孔徑為0.20.4m的濾網(wǎng)。超凈工作臺可以分為雙人和單人、單面和雙面、水平風(fēng)和垂直風(fēng)等類型。三、培養(yǎng)室（Culture room）植物材料需在一個(gè)可控溫、控光、潔凈的地方進(jìn)行培養(yǎng)。如規(guī)模小，則有12個(gè)培養(yǎng)箱即可。培養(yǎng)箱體積小，不占地方，控溫、控光條件好，很適合于摸索植物材料的培養(yǎng)條件和科學(xué)研究。缺點(diǎn)是空間小、價(jià)格昂貴（10000元/臺）。如果要培養(yǎng)較多的植物材料，應(yīng)建立專門培養(yǎng)室。培養(yǎng)室所需要的設(shè)備：1

14、.培養(yǎng)架:培養(yǎng)架的設(shè)計(jì)既要考慮充分利用培養(yǎng)室的空間，也要考慮取放材料方便。 2.加溫/降溫設(shè)備：空調(diào)3.光照和控光設(shè)備:分為光培養(yǎng)室和暗培養(yǎng)室。光培養(yǎng)室常用日光燈照明，并安置控制光照時(shí)間的自動開關(guān)。四、培養(yǎng)容器1. 玻璃容器：如試管、三角瓶、果醬瓶、罐頭瓶、飲料瓶等。玻璃瓶耐高溫消毒、透明（便于觀察），且為惰性物質(zhì)，對植物材料的生長影響小，是組培中用得最廣的容器，但容易破碎。2. 透明塑料容器：輕巧，不易破碎，但不耐反復(fù)高溫消毒，而且有些塑料容器在高溫消毒時(shí)會釋放一些有害的物質(zhì)，影響材料的生長。3. 容器封口：良好的封口用品要求做到既可以防止污染和容器內(nèi)水分的過分散失，又要做到透水、透氣。專用

15、的組培容器有自己的蓋子。如果沒有，可用棉塞、封口膜、錫箔紙、耐高溫的塑料紙（如培養(yǎng)食用菌的聚丙烯塑料袋）封口。棉塞最好。瓶蓋、瓶塞、或者封口膜的透氣性能對材料的培養(yǎng)有顯著影響，透氣性能不好的，容器中濕度高（飽和），容易導(dǎo)致植物材料出現(xiàn)玻璃化（生理病態(tài)，植物材料呈水漬狀，深綠色，剛脆，無繼續(xù)培養(yǎng)的價(jià)值）五、其它儀器設(shè)備與用具1. 天平：需要1臺萬分之一的精密分析天平和百分比之一或十分之一的普通天平。2. 冰箱：用于儲藏一些不宜在常溫下較長時(shí)間放置的藥品和試劑，如維生素、氨基酸、激素、微量元素等。3. 蒸餾水器或者去離子水生產(chǎn)裝置4. 酸度計(jì)：植物生長需要一定的pH值，因此需要調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值。

16、酸度計(jì)測定pH值精度高，準(zhǔn)確，但較煩瑣。如不進(jìn)行要求很高的培養(yǎng)（如單細(xì)胞培養(yǎng)、原生質(zhì)體培養(yǎng)），可以用pH試紙代替。5. 酒精燈6. 解剖刀和鑷子 7. 搖床植物組織培養(yǎng)室的設(shè)計(jì)植物組織培養(yǎng)工作按內(nèi)容不同可分為3個(gè)過程：1.培養(yǎng)基的準(zhǔn)備：試劑的配制、容器的洗滌、培養(yǎng)基的制備與消毒等：2. 植物材料的無菌操作(接種）：3.植物材料的培養(yǎng)、觀察與分析。第三章 植物組織培養(yǎng)基（Plant Tissue Culture Medium）培養(yǎng)基的重要性：營養(yǎng)來源；調(diào)節(jié)生長與分化的主要途徑。培養(yǎng)基種類比較多，共同之處：含有植物生長發(fā)育所必須的營養(yǎng)物質(zhì)和生物活性物質(zhì)不同之處：營養(yǎng)物質(zhì)的濃度不同培養(yǎng)基的組成：一、

17、水：要求純凈。應(yīng)用蒸餾水、去離子水，而不用自來水。二、無機(jī)營養(yǎng)：大量元素：C, H, O, N, P, K, Ca, Mg, S；微量元素：Fe, Cl, Cu, Mo, B, Zn, Mn三、有機(jī)營養(yǎng) (有機(jī)成分)：維生素和氨基酸的總稱。常用：肌醇、煙酸、維生素B6、維生素B1和甘氨酸等。難培養(yǎng)的材料，可增加維生素和氨基酸的種類：其它維生素：維生素M（葉酸）、維生素B2（核黃素）、泛酸鈣等。其它氨基酸：谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺等四、碳源：最常用的糖是蔗糖(sucrose)，也有用葡萄糖(glucose)、果糖(fructose)或其它的糖，有時(shí)幾種糖混用。糖是營養(yǎng)物質(zhì)，但不是越多

18、越好，用量大多在10-60g/L，一般為20-30 g/L。五、 植物生長物質(zhì)（俗稱激素）：植物激素和植物生長調(diào)節(jié)劑的總稱。植物激素：植物合成的、微量就有顯著效應(yīng)的物質(zhì)。植物生長調(diào)節(jié)劑：人工合成的、具有植物激素相似作用的物質(zhì)。根據(jù)功能不同，植物生長物質(zhì)共分為五大類：1. 生長素(Auxins)：吲哚乙酸 (IAA)、吲哚丁酸 (IBA)、萘乙酸(NAA)、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)（除草劑）作用：(1) 促進(jìn)細(xì)胞分裂、增殖，形成愈傷組織；2,4-D>NAA>IAA, IBA(2) 控制器官的分化，誘導(dǎo)根的形成、抑制芽的誘導(dǎo)。誘導(dǎo)根的作用：IBA>NAA>IAA2

19、. 細(xì)胞分裂素 (Cytokinins)：Zeatin 玉米素 (ZT)、異戊烯基腺嘌呤（2iP）、6-芐基氨基嘌呤（6-BA, BA, BAP）、激動素（KT）、噻苯?。═DZ）作用：促進(jìn)細(xì)胞分裂、增殖，形成愈傷組織；控制器官的分化，誘導(dǎo)芽的形成和增殖、抑制根的誘導(dǎo)。3.赤霉素 （Gibberellins）：種類很多，有七、八十種，其中以赤霉酸3（GA3）用得最普遍。作用：促進(jìn)細(xì)胞的伸長：赤霉素最顯著的作用，可用于促進(jìn)芽或莖的伸長。打破種子休眠的作用。赤霉素對熱不穩(wěn)定，故不能用高溫法消毒。4.乙烯：促進(jìn)果實(shí)成熟，加速植物衰老。植物組織培養(yǎng)極少使用乙烯（乙烯利），相反，而是盡量控制乙烯的產(chǎn)生。

20、5.脫落酸（ABA）：促進(jìn)植物的衰老和器官脫落，植物組織培養(yǎng)很少用。在胚狀體（embryoid）的誘導(dǎo)和培養(yǎng)中常常使用脫落酸，促進(jìn)胚狀體的成熟。 六、凝固劑：瓊脂（agar）是最常用的凝固劑，用量為6-12g/升。另外還有phytagel, Gelrite, 2-4g/L。七、有機(jī)附加物（Organic additives）：水解酪蛋白、水解乳蛋白、蛋白胨、胰蛋白胨、酵母提取物：用量為0.1-10g/L，一般為0.5-3 g/L。椰子汁：100-200ml/L。這些物質(zhì)的成分復(fù)雜、不明確，統(tǒng)稱為有機(jī)附加物。當(dāng)材料生長不好時(shí)，加入這些物質(zhì)往往可以會明顯改善材料的生長狀況。八、其它物質(zhì)防止與減緩植

21、物材料褐化的物質(zhì)：1）抗氧化劑：抗壞血酸（Vc）、L-半光氨酸、檸檬酸、二硫蘇糖醇等。2）吸附劑：活性炭（無選擇性）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP；酚類物質(zhì)吸附劑）。培養(yǎng)基的制備一、培養(yǎng)基母液配制1.無機(jī)鹽母液的配制（以MS培養(yǎng)基為例）1）大量元素母液的配制：大量元素濃度比較高，故母液濃度(倍數(shù))不能過大，否則溶解不完全，容易析出(特別是冬天)，使用很不方便，一般為20、50或100倍。另一個(gè)要考慮的問題是高濃度時(shí)有些離子之間發(fā)生會發(fā)生相互作用，形成沉淀，如SO42-、PO43-和Ca2+之間。因此，在母液濃度較高時(shí)，Ca鹽要與硫酸鹽、磷酸鹽分開。MS大量元素的母液濃度為20倍時(shí)，5種鹽在一起不會出

22、現(xiàn)沉淀；但當(dāng)母液濃度達(dá)到50倍時(shí)就出現(xiàn)沉淀。因此，母液濃度高時(shí)MgSO4和CaCl2要分開。如把KNO3和CaCl2·2H2O配在一起（母液 I）， NH4NO3 、MgSO4·7H2O和KH2PO4配在一起（母液 II），這樣，即使母液濃度達(dá)到100倍也不會出現(xiàn)沉淀。2）微量元素母液的配制：除鐵鹽外，其它微量元素可以全部配在一起，濃度常為100200倍。Fe2+容易變成Fe3+而形成沉淀，不利于植物材料的吸收，所以把FeSO4同Na2EDTA配在一起，形成絡(luò)合鐵（穩(wěn)定，植物利用度高）。其母液濃度為100-200倍。配法是先分別將FeSO4和Na2EDTA溶解，然后等體積混

23、合，邊混合邊攪拌，混合液為黃色。微量元素母液和鐵鹽要放在冰箱中保存。2. 有機(jī)成分母液的配制：一種培養(yǎng)基的有機(jī)成分(氨基酸和維生素) 可以配在一起,100-200倍。有機(jī)成分母液應(yīng)放在冰箱中保存，否則容易生霉、變質(zhì)。3. 植物激素母液的配制：每種植物激素要單獨(dú)配一種母液，濃度為0.5-1.0 mg/mL。激素不易溶于水，但易溶有機(jī)溶劑（乙醇、二甲基亞砜）和稀酸稀堿。稀酸稀堿：需要過濾滅菌；加入培養(yǎng)基后pH會變。 70%-90%乙醇：溶液無菌，加入培養(yǎng)基后pH不變。激素母液應(yīng)低溫保存。二、培養(yǎng)基的制備1.根據(jù)植物材料和培養(yǎng)目的，設(shè)計(jì)培養(yǎng)基配方（基本培養(yǎng)基，糖、植物激素、瓊脂和其它成分的濃度）;2

24、.根據(jù)培養(yǎng)基的體積和母液濃度，計(jì)算出各種成分的用量，并且準(zhǔn)確無誤寫在實(shí)驗(yàn)記錄本上;3. 根據(jù)計(jì)算出來的結(jié)果，正確配制培養(yǎng)基操作步驟：1、計(jì)算出各種成分的用量，填寫培養(yǎng)基記錄表2、配制過程（1）稱30g蔗糖和8g瓊脂，放入鍋中，加1000ml左右（總體積的2/3）蒸餾水，加熱、煮沸5min，至瓊脂完全熔化；（2） 按量加入各種成分(在記錄表上打鉤，防止漏加、多加)，然后用蒸餾水定容至1500ml；（3）調(diào)pH值：用KOH或NaOH和HCl調(diào)pH值至5.8。非常重要：pH值影響瓊脂培養(yǎng)基的凝固效果；pH值影響培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分的有效性；pH值影響植物材料的生長狀況（不同植物材料有不同的最佳pH環(huán)境，

25、水稻、杜鵑花、蘭花等喜歡偏酸性）（4）分裝到培養(yǎng)容器中，容器盛培養(yǎng)基量為容器體積1/5-1/3，但不要超過2/3，容器封口。3、培養(yǎng)基的消毒（方法如下）：高溫滅菌法：簡單、易行、量大、效果好、最常用。溫度121，壓力1.1-1.2大氣壓。應(yīng)注意的問題：一定要先排氣10 min，否則消毒不徹底；高溫消毒后，培養(yǎng)基的pH值會下降0.20.5個(gè)pH單位；高溫消毒過程中，培養(yǎng)基中有些物質(zhì)會被破壞或發(fā)生沉淀。如蔗糖會水解成葡萄糖和果糖，葡萄糖變成葡萄糖酸等。熱不穩(wěn)定的物質(zhì)高溫高壓消毒會完全被破壞，如赤霉素、玉米素等。物質(zhì)破壞程度與消毒時(shí)間和壓力有關(guān)。(2) 過濾滅菌法：不會破壞培養(yǎng)基的成分和改變培養(yǎng)基的

26、pH值，所以在原生質(zhì)體和單細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)要用過濾消毒法對培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌。熱不穩(wěn)定的物質(zhì)，如ZT、2ip、GA3、核黃素等，也要用過濾消毒法滅菌 過濾滅菌的操作：先將微孔濾膜（孔徑0.2-0.45 mm，用前最好在蒸餾水中浸泡數(shù)小時(shí)）裝入濾頭中，用紙或布將其包好，再高溫滅菌；在超凈工作臺上取出濾頭，用注射器吸取培養(yǎng)基或溶液，將注射器接在濾頭入口端，推動注射器使培養(yǎng)基或溶液從濾頭出口處流出，并用無菌容器收集濾液。要注意：A. 溶液中的成分必須完全溶解，不能有懸浮物或沉淀物，否則會堵塞微孔濾膜。如確有懸浮物或沉淀物，應(yīng)先離心。B. 要注意濾膜是否破裂（使用時(shí)可根據(jù)經(jīng)驗(yàn)判斷；使用完后可檢查濾膜）。C. 過

27、濾時(shí)不要用力過大，否則會導(dǎo)致濾膜破裂。過濾消毒法的缺點(diǎn)是操作比較煩瑣，只適合少量培養(yǎng)基的滅菌。第四章 外植體表面消毒與污染控制污染發(fā)生的途徑：1.植物材料自身帶菌；2. 培養(yǎng)基污染；3. 接種操作過程污染；4. 培養(yǎng)過程中污染防范接種操作過程中污染：1.接種空間要潔凈、無菌；2.超凈工作臺要合格；3.操作要規(guī)范、小心高潔凈度的接種室和合格的超凈工作臺是保證無菌操作的前提培養(yǎng)過程中污染的防范：培養(yǎng)室要潔凈、無蟲少菌；培養(yǎng)容器封口要好外植體(Explant)用于建立無菌培養(yǎng)的起始植物材料。表面消毒(Surface sterilization)（用消毒劑）殺死外植體表面其它生物（主要是細(xì)菌和真菌）的

28、過程。植物材料表面都帶細(xì)菌和真菌，接種前對外植體有效的表面消毒是建立無菌培養(yǎng)的關(guān)鍵。 表面消毒的要求：（1）最大限度地殺死細(xì)菌和真菌；（2）對外植體的毒害要盡可能的小評價(jià)消毒效果指標(biāo)：污染率和植物材料的成活率常用消毒劑：用于植物材料表面消毒的消毒劑有乙醇、氯化汞、次氯酸鈉、雙氧水等。次氯酸鈉=漂白粉 商品液：淡黃色，有效氯10%雙氧水=過氧化氫 商品液無色，含量30%消毒步驟：1.  對材料進(jìn)行適當(dāng)?shù)奶幚恚米詠硭畬⒉牧蠜_洗干凈。2. 將材料剪成適當(dāng)大?。ㄩL短）的小塊（段）。3. 在70%-75%的乙醇中10-60 S，然后迅速轉(zhuǎn)入到其它消毒劑（氯化汞、

29、次氯酸鈉）中，消毒劑中可加入少量表面活性劑（Tween 20或80、家用洗滌劑等），以增加消毒效果。4. 消毒結(jié)束后，將材料轉(zhuǎn)入無菌水中漂洗2-8次；5. 將材料的傷口部分切去后，再將其切成適當(dāng)大小，及時(shí)接入到培養(yǎng)基中。材料內(nèi)部污染的控制1、用分生組織作為外植體。因?yàn)榉稚M織內(nèi)無維管組織，所以不帶菌。2、在培養(yǎng)基中加抗菌素（青霉素、卡那霉素、四環(huán)素等），但高濃度的抗生素往往對植物材料生長發(fā)育也有抑制作用，而且抗菌效果有時(shí)不一定理想。 3、用盡量小的材料接種。每接一個(gè)外植體就將接種工具消毒一次，避免交叉感染。材料越小，污染的機(jī)會也就越小，但成活率越低。第五章   高

30、等植物離體再生與無性繁殖（In vitro Regeneration and Clonal Propagation of Higher Plants）有性繁殖（Sexual propagation）：通過授粉受精形成的種子進(jìn)行繁衍后代的方法叫有性繁殖。因?yàn)榉敝丑w是種子，所以又稱種子繁殖。種子發(fā)芽的條件：充足的水分、適宜的溫度、合適的光照種子繁殖的優(yōu)點(diǎn)：種苗生產(chǎn)操作比較簡單；種苗根系完整、生長健壯等優(yōu)點(diǎn)。種子繁殖的缺點(diǎn)：有些植物是不能或不宜用種子繁殖的。如無種子或種子無活力的植物；雜種植物；有些植物雖然可以用種子繁殖，但生育期長、或者繁殖系數(shù)低。無性繁殖（Asexual propagation）

31、：通過植物體一部分（常是營養(yǎng)器官，如芽、根、莖、葉等）繁殖的方法，所以又稱營養(yǎng)繁殖（vegetative propagation）。一株植物通過無性繁殖所形成的群體稱為一個(gè)無性系（clone,克?。?，無性繁殖植物=克隆植物，無性繁殖又稱clonal propagation植物的無性繁殖方法：（1）分株繁殖（Dividing）：通過植物本身的組織或器官生長出來的小植株進(jìn)行繁殖優(yōu)點(diǎn)：操作簡單；成活率高（2）扦插繁殖（Cutting）：剪取某些植物的莖（枝條）、葉、根等（插穗）插入土中、沙中，或浸泡在水中，生根后就成為獨(dú)立的新植株。最常用扦插成敗關(guān)鍵因素是生根 生根粉：促進(jìn)難生根植物生根葉插：景天屬

32、、石蓮屬、風(fēng)車草屬、伽藍(lán)菜屬等多肉植物。蘆薈根插：枝插成活困難而根插較易成活的樹種如棗、柿、核桃、長山核桃、山核桃、漆樹等常用此法（3）壓條繁殖（Layering）：將枝條壓入土中，使側(cè)芽生長、生根（4）嫁接繁殖（Grafting）：可以培育出結(jié)合兩種植株優(yōu)點(diǎn)的種苗。果樹育苗常用無性繁殖的優(yōu)點(diǎn)：所繁殖的植株與母株的性狀一致無性繁殖的缺點(diǎn)：繁殖速度有限，特別是當(dāng)起始材料少時(shí)，不能快速推廣優(yōu)良植株；容易傳播病害。植物離體再生(in vitro plantlet regeneration)：利用組織培養(yǎng)技術(shù)使植物外植體（根、莖、葉、花等）形成完整植株的過程離體無性繁殖=利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)對植物進(jìn)行

33、繁殖=in vitro clonal propagation。因?yàn)橹仓晷。址Q為植物的微型繁殖(簡稱微繁) =micropropagation; 因?yàn)榉敝乘俣瓤?，又稱為快速無性繁殖（簡稱快繁=rapid clonal propagation。植物離體無性繁殖的過程：1. 繁殖體的誘導(dǎo)（芽、胚性愈傷組織、Plb）2. 繁殖體的增殖；3. 植株再生（芽的生根、胚狀體形成與萌發(fā)、 Plb分化植株）4.小苗移栽: 將再生植株由組培室移栽到溫室、田間。植物離體再生途徑一、頂芽和側(cè)芽再生途徑（莖段培養(yǎng)= nodal culture ）1.選擇適當(dāng)?shù)闹l、莖段，消毒；2. 莖段

34、培養(yǎng)（nodal culture）或莖尖培養(yǎng)（shoot tip culture)；1-2芽/段3. 促進(jìn)頂芽和側(cè)芽生長，形成幼莖(shoot);4. 幼莖生根、形成完整植株。（重復(fù)2和3，可以大量繁殖植物）優(yōu)點(diǎn)：方法簡單；變異最低，所繁殖的植株在性狀上能最大限度地與母株保持一致。缺點(diǎn)：有時(shí)繁殖系數(shù)可能比較低，不能滿足快繁的要求莖段培養(yǎng)可能遇到的問題：1、有些植物不能通過莖段培養(yǎng)進(jìn)行繁殖：莖能伸長的植物（菊花、馬鈴薯、葡萄、木本植物等）效果好；節(jié)間短、蓮座狀的植物（如鳳梨、非洲菊、白菜等）效果差，甚至不能。即使莖能伸長的植物，因?yàn)榉敝承实鸵膊灰欢苓M(jìn)行有效地莖段培養(yǎng)。莖段培養(yǎng)繁殖植物的效率決

35、定于哪些指標(biāo)：芽生長率：側(cè)芽和頂芽萌動生長的莖段比率幼莖節(jié)數(shù)：節(jié)數(shù)多，側(cè)芽就多，增殖系數(shù)就大生長速度：培養(yǎng)一個(gè)周期需要的時(shí)間2、側(cè)芽和頂芽生長率低3、幼莖伸長不理想，影響增殖效率和生根（1）利用春、夏季材料，不用秋季、冬季材料；（2）在長日照條件(16h/d)和弱光下培養(yǎng)；（3）降低細(xì)胞分裂素的濃度（細(xì)胞分裂素高濃度抑制芽的伸長）（4） 添加GA二、不定芽再生途徑不定芽(adventitious bud)： 從外植體不固定的位置形成的芽。1、外植體的選擇與消毒2、不定芽的誘導(dǎo)（外植體既可以直接形成不定芽，也可以先形成愈傷組織，再由愈傷組織形成形成不定芽）；3、芽的增殖(莖段培養(yǎng)或不定芽)：不定

36、芽的增殖：增殖培養(yǎng)基一般可以在最佳的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行增殖，但有時(shí)激素濃度要適當(dāng)調(diào)整。如不定芽過多，但不伸長，則要降低細(xì)胞分裂素的濃度；如不定芽的形態(tài)正常，莖也能伸長，但增殖的數(shù)量較少，則可以提高細(xì)胞分裂素的濃度。4、不定芽的生根。優(yōu)點(diǎn)：（1）取材料方便，不毀壞母株；（2）芽的增殖速度快，繁殖效率高；（3）可以用于培育轉(zhuǎn)基因植物缺點(diǎn) ：(1)再生植株的變異幾率可能較大。如香蕉不定芽增殖6-8代后，不定芽的變異比率就大大增加。屬于體細(xì)胞變異；(2)嵌合體性狀會喪失：如一些花卉的花葉，通過不定芽途徑形成的植株可能會失去花葉的性狀。影響不定芽形成的因素：1.  植物種類和品種（基因）差異不同

37、植物形成不定芽的能力不同：草本植物大于木本植物；雙子葉植物大于單子葉植物。同一種植物，不同品種之間往往也有很大的差異。2. 外植體的類型：同一株植物上不同的器官（根、莖、葉、花、果實(shí)、胚）形成不定芽的能力往往會有差異。莖、葉是最常用的外植體，但對于非洲菊來說，其花托是最佳的外植體。3. 外植體的生理狀態(tài)發(fā)育狀態(tài)：植物的生長發(fā)育可以分為營養(yǎng)生長期和生殖生長期。前者為幼年期（童期），后者為成熟期。幼年期的外植體形成不定芽的能力大于成熟期的外植體，特別是木本植物。生長狀態(tài)：幼嫩的外植體比老的外植體容易形成不定芽。4 培養(yǎng)基（1） 基本培養(yǎng)基：不同基本培養(yǎng)基的無機(jī)鹽濃度差異大，對不定芽的誘導(dǎo)會有很大的

38、影響。（2）植物激素：培養(yǎng)基中激素的濃度和種類對絕大多數(shù)植物的不定芽誘導(dǎo)有決定性的影響。CTK/Auxin比值高，有利于不定芽的形成。激素的種類與：不同的細(xì)胞分裂素、不同生長素激素的組合：細(xì)胞分裂素/生長素比值：相對量激素的濃度：絕對量5. 培養(yǎng)條件：光照和溫度無根苗的生根（Rooting of Shoots）：當(dāng)頂芽、側(cè)芽或不定芽增殖形成的無根苗（shoot）達(dá)到足夠數(shù)量后，必須將其轉(zhuǎn)到生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根，形成完整的幼苗（plantlet）。生根的質(zhì)量影響組培苗的質(zhì)量和移栽成活率無根苗生根有2種類型：皮部生根型：根直接從無根苗基部莖的皮層處長出愈傷組織生根型：無根苗基部先形成愈傷組織，再在

39、愈傷組織上形成根。影響無根苗生根的主要因素：. 植物的類型和品種：草本比木本易；幼年期外植體形成的無根苗比成年期形成的無根苗容易。2. 基本培養(yǎng)基成分：不同培養(yǎng)基的無機(jī)鹽濃度差異較大，對生根的影響也比較大。一般較低的無機(jī)鹽有利于生根，故生根培養(yǎng)基常常將大量元素減半，特別是MS培養(yǎng)基。3. 激素：細(xì)胞分裂素抑制生根，生長素促進(jìn)生根三、胚狀體再生途徑胚是具有胚芽、胚根、胚軸和子葉的幼小植物體。在自然條件下，胚是通過兩性細(xì)胞受精形成的合子發(fā)育而成的，存在于種子中，故又稱為“合子胚”、“ 種子胚”。在種子中，胚的發(fā)育經(jīng)歷了球形胚、心形胚、魚雷形胚、子葉胚等幾個(gè)階段。由體細(xì)胞形成的“胚”稱為“體細(xì)胞胚”

40、(somatic embryo)，或“胚狀體” (embryo-like body; embryoid)。誘導(dǎo)植物體細(xì)胞形成體細(xì)胞胚（胚狀體）的過程就稱為“體細(xì)胞胚胎發(fā)生”或“體胚發(fā)生”(somatic embryogenesis)。胚狀體途徑植株再生的過程1.選擇合適的材料、誘導(dǎo)胚性愈傷組織（能夠產(chǎn)生胚狀體的愈傷組織）2.促進(jìn)胚性愈傷組織形成正常的胚狀體（球型胚、心型胚、魚雷型胚、子葉胚、成熟胚）3.促進(jìn)胚狀體萌發(fā)成苗胚性愈傷組織(embryonic callus)特征：質(zhì)地較堅(jiān)實(shí)，乳白色或黃色，表面具球形顆粒，生長比較緩慢；細(xì)胞較小、等直徑，原生質(zhì)濃厚，無液泡，常富含淀粉粒，核大，分裂活性

41、強(qiáng)。外植體：幼胚子葉培養(yǎng)基：無激素的MS培養(yǎng)基胚狀體的起源：單細(xì)胞影響胚狀體誘導(dǎo)的因素1. 植物種類：不同種類植物形成胚狀體的能力差異很大。目前已報(bào)道有90多個(gè)屬、150多種植物形成了體細(xì)胞胚，但以蕓香科、茄科、五加科、傘形科、毛茛科的植物比較容易。2.外植體種類：3.外植體生理狀態(tài)：幼年期外植體高于成年期外植體，尤其是用合子胚及種子萌發(fā)的幼苗為外植體，容易誘導(dǎo)成功。幼嫩外植體高于成熟外植體4. 植物激素：少數(shù)植物可以在無激素的培養(yǎng)基上形成胚狀體，如五加科的一些植物，人參;大多數(shù)植物則需要在生長素、或細(xì)胞分裂素、或生長素和細(xì)胞分裂素共同作用的誘導(dǎo)下才能形成胚狀體，但激素種類、組合、濃

42、度因植物種類而異。2,4-D：常用于誘導(dǎo)胚性愈傷組織ABA: 植物組織培養(yǎng)中一般不用，但在植物的胚狀體再生途徑中，ABA通常有促進(jìn)胚狀體發(fā)育與成熟的作用。5. 培養(yǎng)基成分：糖、NH4+、Ca2+濃度，氨基酸（特別是脯氨酸）、水解酪蛋白等物質(zhì)有利于胚狀體的誘導(dǎo)；麥芽糖有利于胚的成熟。胚狀體的應(yīng)用1、快速繁殖植物：胚狀體的形成需要經(jīng)歷胚性愈傷組織、球形胚、心形胚、魚雷形胚、子葉胚、成熟胚等一系列的過程，如果要用該途徑進(jìn)行植物快繁，則技術(shù)上需要做到兩點(diǎn)：（1）胚性愈傷組織要穩(wěn)定，可以大量增殖；（2）胚性愈傷組織形成胚狀體的發(fā)育過程要同步。只有這樣，才能大量生產(chǎn)整齊一致的種苗。2、生產(chǎn)人工種子：人工種

43、子制作是將胚狀體包裹一層“胚乳”和“種皮”類的物質(zhì)。一般將胚狀體混和在含有營養(yǎng)物質(zhì)和激素的海藻酸鈉中，通過漏斗滴入的CaCl2溶液中，則就形成顆粒狀。人工種子的好處：容易儲藏；方便運(yùn)輸；容易使用(播種)3.培育轉(zhuǎn)基因植物的重要技術(shù)之一四、擬原球莖途徑擬原球莖的特點(diǎn)：（1）增殖：切成薄片后，每片可以形成數(shù)個(gè)新的原球莖，繁殖速率高；（2）分化成苗：如果原球莖不被切割，則可象種子原球莖一樣，發(fā)育成苗。原球莖（根狀莖）途徑是蘭花無性繁殖最快的途徑；原球莖（根狀莖）誘導(dǎo)的是蘭花快速繁殖的關(guān)鍵。蘭花的繁殖： 1. 種子繁殖種子數(shù)量多：幾十萬-幾百萬種子/蒴果成熟種子：無營養(yǎng)、胚未分化成熟自然發(fā)芽率極低:共

44、生真菌、溫度、濕度2. 無性繁殖：常規(guī)方法是分株，速度太慢；有些蘭花不能分株繁殖無病毒植株的生產(chǎn)脫毒苗生產(chǎn)機(jī)理：在植物體內(nèi)，病毒是通過維管組織傳導(dǎo)的，莖尖的分生組織（meristem culture）無維管組織，所以沒有病毒；分離分生組織進(jìn)行組織培養(yǎng)，再生出植株就是無病毒植株。通過快速繁殖技術(shù)就可以生產(chǎn)出大量無毒苗，從而恢復(fù)其生產(chǎn)能力。無毒苗生產(chǎn)的主要技術(shù)要點(diǎn)： 1. 感病植株的病毒鑒定；2.感病植株的熱處理：37-39的溫度處理感病植株20-60天可以使病毒失活，增加獲得無病毒植株的機(jī)會；3.分生組織的分離：取莖尖生長點(diǎn)分生組織：0.1 mm×0.1 mm×0.1mm。4

45、.植株再生：誘導(dǎo)不定芽、胚狀體、原球莖5.再生芽或植株病毒的檢測：鑒定脫毒效果（血清免疫、電鏡觀察、接種鑒定等方法）。6. 擴(kuò)繁無毒苗：7. 移栽后的隔離繁殖，保證種苗無病毒。植物離體繁殖技術(shù)的應(yīng)用：1. 快速繁殖優(yōu)良品種2. 無病毒優(yōu)良種苗生產(chǎn)3.挽救和繁殖瀕危植物4.離體保存植物資源（離體種質(zhì)庫）5. 培育轉(zhuǎn)基因植物第六章 植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)植物細(xì)胞培養(yǎng)：培養(yǎng)彼此分離的細(xì)胞、使之生長、增殖。類型：1、固體培養(yǎng)(solid culture)：在固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞，也稱靜止培養(yǎng)。優(yōu)缺點(diǎn):1）細(xì)胞被固定、不能移動，可以跟蹤單細(xì)胞生長；2）所得到的細(xì)胞團(tuán)均由單細(xì)胞形成，遺傳成分和生理特性一致；3）

46、細(xì)胞生長速度較慢；4）單細(xì)胞分裂后形成細(xì)胞團(tuán)，不能長期、連續(xù)、大規(guī)模培養(yǎng)細(xì)胞。2. 液體培養(yǎng)（liquid culture）：在運(yùn)動的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。又稱懸浮細(xì)胞培養(yǎng)（ suspension cell culture）。液體培養(yǎng)又有2種形式：1）成批培養(yǎng)(batch culture)：在一個(gè)封閉體系中培養(yǎng)細(xì)胞，一個(gè)培養(yǎng)周期結(jié)束后，細(xì)胞被轉(zhuǎn)移到新的容器中繼續(xù)培養(yǎng)。2）連續(xù)培養(yǎng)(continuous culture)：在一個(gè)容器（或者系統(tǒng)）中連續(xù)不斷的培養(yǎng)細(xì)胞。懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的優(yōu)缺點(diǎn)1）細(xì)胞生長速度快；2）可以長期、連續(xù)、大規(guī)模培養(yǎng)細(xì)胞；3）不能跟蹤單細(xì)胞的分裂和生長過程。細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用：1.

47、 進(jìn)行細(xì)胞生物學(xué)研究：篩選細(xì)胞、獲得均勻一致的細(xì)胞作為試驗(yàn)材料；研究細(xì)胞生長、分裂：單細(xì)胞培養(yǎng)可以連續(xù)觀察和記錄（攝像）細(xì)胞的生長和分裂全過程2. 篩選和培育植物變異體： 如抗病、抗蟲、抗鹽堿、抗鋁、抗除草劑等。（1）從自然變異的植株中進(jìn)行選擇：自然變異率低、機(jī)會小，工作量大，效率低。（2）雜交育種：可以把抗性基因轉(zhuǎn)移到需要改良的品種中，但時(shí)間長（3）誘變植物（種子或芽）：工作量大 射線；甲基磺酸乙酯（EMS）（4）細(xì)胞培養(yǎng)：特別適合抗（耐）性育種，效率高?？鼓望}、堿、除草劑、旱先誘變細(xì)胞，再將細(xì)胞培養(yǎng)在有選擇壓力的培養(yǎng)皿中，具有抗性的細(xì)胞就可以分裂，誘導(dǎo)其形成完整植株，即可獲得真正的抗性變異

48、體。在一個(gè)培養(yǎng)皿中，一次可以篩選10-20萬個(gè)細(xì)胞（一個(gè)細(xì)胞就是一潛在的植株）細(xì)胞培養(yǎng)的建立和維持：細(xì)胞培養(yǎng)通常是將植物材料接種在液體培養(yǎng)基中，經(jīng)過搖蕩建立起來的。愈傷組織(callus)是一群無明顯組織分化、有分裂能力的細(xì)胞群（團(tuán)）。形成的因素：創(chuàng)傷；植物激素的誘導(dǎo)愈傷組織因植物種類、外植體、培養(yǎng)條件等在顏色、松散程度、含水量、生長速度等方面存在差異。分化(differentiation)形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能相同的細(xì)胞變成形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能互不同的細(xì)胞的過程，如分生組織細(xì)胞轉(zhuǎn)變成薄壁組織、維管組織、厚壁組織等。脫分化(去分化；dedifferentiation)已分化、成熟的細(xì)胞失去原有的狀態(tài)、重

49、新恢復(fù)分裂能力的過程。外植體形成愈傷組織的過程就是脫分化的過程。再分化 (redifferentiation)愈傷組織形成其它組織或器官的過程繼代培養(yǎng)（傳代培養(yǎng)；subculture）：將培養(yǎng)物（芽、愈傷組織、細(xì)胞等）分成若干份，接種到新鮮培養(yǎng)基上繼續(xù)增殖的過程。細(xì)胞培養(yǎng)周期：兩次繼代培養(yǎng)所間隔的時(shí)間。在一個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)周期中，細(xì)胞的生長情況經(jīng)歷了慢快慢的過程延滯期：細(xì)胞繼代培養(yǎng)開始后的一段增殖緩慢的時(shí)間?？焖偕L期：細(xì)胞數(shù)量、重量或體積直線上升的時(shí)期。對數(shù)生長期漸降期：細(xì)胞生長速度逐漸減慢的時(shí)期。靜止期：新生的細(xì)胞數(shù)量與死亡的細(xì)胞數(shù)量達(dá)到動態(tài)平衡的時(shí)期。下降期：活細(xì)胞數(shù)量不可逆下降的時(shí)期。細(xì)胞懸

50、浮培養(yǎng)要求達(dá)到一定的接種細(xì)胞密度 (cells/ml)， 一般為0.5-2.5×105個(gè) 細(xì)胞/ml。密度高，細(xì)胞分裂快，延滯期短；密度低則相反。如果密度太低，則細(xì)胞不能不分裂，最后全部死亡。因此，懸浮細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，要求達(dá)到最低起始細(xì)胞密度。最低起始細(xì)胞密度（minimum initial cell density）： 細(xì)胞能夠生長、分裂的最低接種密度。影響最低起始細(xì)胞密度的因素(1)植物種類：生長快、容易培養(yǎng)的植物（如大多數(shù)草本植物），其最低起始細(xì)胞密度比較低；相反，則高。(2) 細(xì)胞的生理狀況：用快速生長期的細(xì)胞接種，則起始細(xì)胞密度可以比較低。(3) 培養(yǎng)基成分：用營養(yǎng)成分豐富的培

51、養(yǎng)基或條件化培養(yǎng)基(conditioned medium)培養(yǎng)細(xì)胞，起始細(xì)胞密度低。條件化培養(yǎng)基：培養(yǎng)過幾天高密度細(xì)胞后的無細(xì)胞培養(yǎng)基(4) 培養(yǎng)方式：采用看護(hù)培養(yǎng)（nurse culture）是降低最低起始細(xì)胞密度的有效方法之一。看護(hù)培養(yǎng)（nurse culture）：將親本愈傷組織或高密度的懸浮細(xì)胞同低密度細(xì)胞一起培養(yǎng)，以促進(jìn)低密度細(xì)胞生長、分裂的培養(yǎng)方法。單細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)：培養(yǎng)彼此分離的單細(xì)胞，且細(xì)胞密度比較低應(yīng)用：研究和觀察細(xì)胞生長與分裂過程的最好方法分離、篩選細(xì)胞系的有效方法微室培養(yǎng)(Culture in microchamber) 可以用于：（1）連續(xù)觀察、記錄細(xì)胞生長、分裂的過程；

52、（2）研究一些物質(zhì)對細(xì)胞分裂的影響平板培養(yǎng)（Plate culture）：在固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)大量單細(xì)胞的一種方法方法：細(xì)胞懸浮液與固體培養(yǎng)基混勻后，倒平板1.單細(xì)胞懸浮液的制備：（1）用不銹鋼濾網(wǎng)（150m )過濾快速生長期（旺盛分裂）的懸浮細(xì)胞，得到單細(xì)胞濾液；（2）濾液經(jīng)過離心后， 細(xì)胞沉淀；（3）倒出上清液，用新鮮培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞，并調(diào)節(jié)細(xì)胞密度（視最終接種密度和固體培養(yǎng)基混合的比例而定；一般5×103-5×105 cell/ml）2.培養(yǎng)基的制備配制固體培養(yǎng)基，但濃度要比正常的高（與稀釋倍數(shù)有關(guān)），高溫滅菌后冷至40。條件化培養(yǎng)基的配制：培養(yǎng)懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)液離心取

53、上清液與高溫滅菌的培養(yǎng)基等量混合冷至40備用。3. 平板培養(yǎng)的制作：將單細(xì)胞懸浮液按預(yù)定的比例與40固體培養(yǎng)基混合均勻后，倒入無菌培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)基的厚度為5 mm左右。蓋上蓋子，搖動、布勻，用Parafilme膜封口。4.培養(yǎng)條件：溫度為25，黑暗或弱光照。平板培養(yǎng)的效果，可用植板率（plate efficiency）來衡量。植板率（%）=每個(gè)平板中新形成的細(xì)胞團(tuán)數(shù)/每個(gè)平板中接種的細(xì)胞數(shù)×100影響植板率的因素：(1)植物種類：生長快、容易培養(yǎng)的植物（如大多數(shù)草本植物），其植板率高；相反，則低。(2) 細(xì)胞的生理狀況：用快速生長期的細(xì)胞接種，則植板率高。(3)接種細(xì)胞密度：接種密度

54、高，有利于細(xì)胞分裂，提高植板率，如煙草細(xì)胞。(4) 培養(yǎng)基成分：基本培養(yǎng)基、激素等。用營養(yǎng)成分豐富的培養(yǎng)基或條件化培養(yǎng)基，植板率高。(5) 培養(yǎng)方式：采用看護(hù)培養(yǎng)可以提高植板率。平板培養(yǎng)是分離、篩選單細(xì)胞無性系和突變體的有效方法植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)次生代謝物質(zhì)初生代謝：為維持植物正常的生長發(fā)育所必須的代謝，如呼吸作用、光合作用、蛋白質(zhì)和氨基酸代謝、核酸和核苷酸代謝、脂肪代謝、激素代謝等。初生代謝產(chǎn)物：初生代謝過程中形成的產(chǎn)物。初生代謝產(chǎn)物不穩(wěn)定，在體內(nèi)容易發(fā)生轉(zhuǎn)化。次生代謝：對植物生長發(fā)育非必需的代謝，其代謝產(chǎn)物稱為次生代謝產(chǎn)物。次生代謝是在初生代謝基礎(chǔ)之上衍生而來的。次生代謝產(chǎn)物為小分子有

55、機(jī)化合物，其產(chǎn)生和分布通常有種屬、器官、組織以及生長發(fā)育時(shí)期的特異性，也往往是末端代謝產(chǎn)物，比較穩(wěn)定，可以在體內(nèi)積累。植物次生代謝產(chǎn)物種類繁多，按結(jié)構(gòu)特點(diǎn)可分為苯丙素類、醌類、黃酮類、單寧類、萜類、甾體及其甙、生物堿七大類植物次生代謝產(chǎn)物的重要性：1）藥物：全球80%的藥品直接、間接與其有關(guān)；2）保健品：種類繁多3）食品、化妝品原料或添加劑：色素、香料；4）化工等重要原料：獲得次生代謝物的方法1. 從植物中提?。嚎煽?，但受到資源的限制，會破壞野生資源；人工栽培則占用土地、受病蟲害、自然災(zāi)害等因素的限制。2. 化學(xué)合成：產(chǎn)量高、成本低，但污染環(huán)境，而且有些物質(zhì)結(jié)構(gòu)復(fù)雜，難以人工合成，如海南粗榧內(nèi)

56、酯；有些雖然可以人工合成，但成本太高，如紫杉醇等。3. 植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)：植物細(xì)胞不僅具有形態(tài)全能性，而且也具有化學(xué)全能性（植物離體細(xì)胞可以合成整株植物所合成的化學(xué)物物質(zhì)）。植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)次生代謝物質(zhì)的優(yōu)點(diǎn)：（1）不破壞、不依賴野生資源；（2）不受環(huán)境因素的影響；（3）不占用土地資源；（4）環(huán)境污染小；（5）產(chǎn)量可以調(diào)控。是一種可持續(xù)的、大有前途的方法植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)天然產(chǎn)物主要成就：1.證明植物細(xì)胞在離體條件下可以整株植物所合成的次生代謝物質(zhì)；2.發(fā)現(xiàn)了提高細(xì)胞次生代謝物質(zhì)含量的方法； 實(shí)現(xiàn)了植物細(xì)胞進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)（75噸）；3.成功商業(yè)生產(chǎn)了少數(shù)次生代謝物質(zhì)（紫草素、人參皂苷、地高

57、辛、紫杉醇等）。存在的問題：普遍產(chǎn)量不高、不穩(wěn)植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)次生代謝物質(zhì)研究的主要過程1. 選擇外植體、建立細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞系；2. 通過分析生長量和含量，選擇高產(chǎn)細(xì)胞系；3. 研究高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)的培養(yǎng)條件；4. 小試（放大培養(yǎng)）：優(yōu)化培養(yǎng)條件（高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)） (可參考3)5. 中試（再放大培養(yǎng)）：優(yōu)化培養(yǎng)條件（高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)） (可參考4)6. 大規(guī)模培養(yǎng)；優(yōu)化培養(yǎng)條件（高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)） (可參考5)7. 工業(yè)化生產(chǎn)；產(chǎn)品分離、純化。植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)次生代謝物的研究進(jìn)行了60年，只有少數(shù)成功的例子，主要原因：目標(biāo)化合物的產(chǎn)量低、不穩(wěn)定。尋找提高次生代謝物產(chǎn)量的方法對于用植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)工業(yè)化生產(chǎn)次生代謝物極為重要提高次生代謝物產(chǎn)量的方法1. 選擇、培育高產(chǎn)細(xì)胞系：細(xì)胞系合成次生代謝物的能力對細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)工業(yè)化生產(chǎn)次生代謝物有決定性的影響。（1）不同植物、不同單株、不同外植體：一種次生代謝物可能在多種植物中都有，但含量不同；在同一種植物中，不同植株之間會不同；同一株植物上，不同部位由于生理差異，往往也有不同的次生代謝物合成能力。（2）對細(xì)胞系進(jìn)行系統(tǒng)選擇： 在培養(yǎng)過程中，細(xì)胞系會出現(xiàn)變