Vero細(xì)胞HCP(宿主殘留蛋白)ELISA試劑盒說(shuō)明書

1、 Vero 細(xì)胞 HCP（宿主細(xì)胞蛋白） Vero細(xì)胞宿主蛋白酶聯(lián)免疫檢測(cè) 目錄 #F500預(yù)期用途 該試劑盒用于檢測(cè)用Vero 細(xì)胞.生產(chǎn)的制品中是否有宿主蛋白殘留。僅供研究和工業(yè)生產(chǎn)，不能用于人和動(dòng)物的診斷?？偨Y(jié)與說(shuō)明 病毒疫苗或其他治療用蛋白在Vero細(xì)胞中表達(dá)使商業(yè)用大量生產(chǎn)藥物原料產(chǎn)品的經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)便方法。生產(chǎn)和純化這些產(chǎn)品的過(guò)程中會(huì)殘留Vero細(xì)胞中的一些蛋白質(zhì)（稱為宿主細(xì)胞蛋白，HCPs）而造成污染。這種污染可以減少藥物的療效，引發(fā)毒副反應(yīng)和免疫學(xué)反應(yīng)，因此最好在實(shí)際生產(chǎn)制品過(guò)程中將HCPs降低到最低水平。 一些利用抗體來(lái)除HCPs的免疫學(xué)方法，如Western Blot 和ELISA

2、被廣泛使用。雖然Western blot是一種檢測(cè)HCPs的有效方法，但它受到了一些限制。因?yàn)樗^(guò)程復(fù)雜且技術(shù)依賴性強(qiáng)，需要操作者對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析解釋。而且，它在本質(zhì)上是一種定性檢測(cè)，不能定量分析。Western blot的敏感性易受被檢測(cè)樣品量的影響，也受目的產(chǎn)品濃度的干擾。因此Western blot可用來(lái)檢測(cè)純化上游的蛋白質(zhì)，而對(duì)純化下游或終產(chǎn)品的檢測(cè)靈敏度與特異性較低。本試劑盒中用到的ELISA方法克服了Western Blot的缺點(diǎn)，將敏感度提高了100倍。ELISA操作簡(jiǎn)單、客觀、可獲得半定量的結(jié)果，是純化工藝，過(guò)程控制，常規(guī)質(zhì)量檢測(cè)的最佳選擇。這個(gè)試劑盒可與純化過(guò)程中殘留的可獨(dú)立污

3、染產(chǎn)品的所有HCPs反應(yīng)，就這個(gè)意義上來(lái)說(shuō)，這個(gè)試劑盒是通用的。用Vero細(xì)胞輕度裂解物獲得抗體并經(jīng)親和純化，得到的最終抗體可以與用于生產(chǎn)各種病毒疫苗和蛋白質(zhì)產(chǎn)品的四種商用細(xì)胞系反應(yīng)。這一分析表明，絕大多數(shù)HCP存在于各種Vero細(xì)胞系和純化過(guò)程中。如果你需要一個(gè)更為敏感和特異性的方法去檢測(cè)樣品中的HCP量，Cygnus Technologies公司為你推薦一個(gè)優(yōu)于2D Western blot的方法，我們將這個(gè)方法稱為2D HPLC-ELISA。2D HPLC-ELISA相較于2D Western blot來(lái)說(shuō)敏感性強(qiáng)，特異性高。要想更多了解此方法，請(qǐng)聯(lián)系我們公司服務(wù)部門。 使用特殊的方法制

4、備抗體，以減少低分子量和低免疫原性污染物以及高分子量組分。例如本試劑盒，可以作為一個(gè)工藝過(guò)程開發(fā)的工具來(lái)監(jiān)控去除宿主細(xì)胞污染物的最佳條件，以及確保最終產(chǎn)品發(fā)布。 這種敏感性高的酶聯(lián)免疫吸附試劑盒已被用于檢測(cè)終產(chǎn)品的HCP，通過(guò)對(duì)來(lái)自不同生長(zhǎng)狀態(tài)和純化過(guò)程的4種疫苗產(chǎn)品的中間產(chǎn)品和最終產(chǎn)品的實(shí)際檢測(cè)來(lái)得到結(jié)果。我們鼓勵(lì)該試劑盒的的每個(gè)使用者進(jìn)行類似的驗(yàn)證研究以證明它符合他們的分析需求。這個(gè)試劑盒能滿足你們的樣品需求，不用再運(yùn)用其他的特異性實(shí)驗(yàn)，因?yàn)槟切?shí)驗(yàn)提供的信息對(duì)這個(gè)通用的試劑盒來(lái)說(shuō)是重復(fù)多余的。但是，如果你的驗(yàn)證研究表明此試劑盒中的抗體與你的樣品中的HCP不能充分反應(yīng)，那就需要同時(shí)運(yùn)用一種

5、特異性的ELISA，且需要特異性強(qiáng)的抗血清?；蛘?，如果該試劑盒中使用的多克隆抗體能提供足夠的敏感性和廣泛的抗原反應(yīng)性，可用它替代本試劑盒中經(jīng)共純化的污染物制作的標(biāo)準(zhǔn)品，從而在特異的HCP檢測(cè)過(guò)程中達(dá)到更好的精確性。使用更多的抗原和抗體所做的特異性分析法的應(yīng)用理論上具有更好的特異性，但因?yàn)樗^(guò)于特異而不能檢測(cè)出因?yàn)椴僮鞑灰?guī)范或過(guò)程改變后產(chǎn)生的一些新的或非典型的污染物。由于這個(gè)原因，我們建議用具有廣泛反應(yīng)性的“通用”宿主細(xì)胞蛋白檢測(cè)實(shí)驗(yàn)分析最終產(chǎn)品純度，即使可使用過(guò)程特異性分析。如果你認(rèn)為有必要進(jìn)行過(guò)程特異性分析檢測(cè)， Cygnus Technologies公司將運(yùn)用其已經(jīng)驗(yàn)證的方法開發(fā)這種抗體并

6、按顧客要求進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)原理 Vero細(xì)胞檢測(cè)是一個(gè)雙位點(diǎn)酶聯(lián)免疫檢測(cè)。樣品中包含的Vero Cell HCPs蛋白與標(biāo)記有抗-Vero Cell抗體的辣根過(guò)氧化酶同時(shí)反應(yīng)，反應(yīng)在之前涂有一層吸附性抗-Vero Cell蛋白抗體的微量滴定板中進(jìn)行。免疫反構(gòu)成為夾層結(jié)構(gòu)：固相抗體-HCP-酶標(biāo)記抗體。反應(yīng)結(jié)束后清洗微量滴定板，去除未結(jié)合反應(yīng)物。添加TMB作用底物反應(yīng)。微量滴定板讀數(shù)器上測(cè)定水解物濃度，水解物濃度與Vero Cell HCPs蛋白濃度成正比。試劑&材料（試劑盒提供）成分 產(chǎn)品 #抗-Vero cell:HRP F501羊抗Vero cell親和純化抗體，用辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記。

7、排列在加有防腐劑的試劑盒中， 1x12mLAnti-Vero cell coated微量滴定板 F502*12×8孔 裝在含有干燥劑的袋子內(nèi)Vero cell HCP標(biāo)準(zhǔn)液 F503含有Vero cell HCP、牛血清白蛋白與防腐劑。 規(guī)格有 0, 2, 8, 25, 75和 200ng/mL . 1 mL/瓶 終止液 F0060.5N硫磺酸 1x12mLTMB F0053,3,5,5-四甲基聯(lián)苯胺. 1x12mL清洗物（20倍濃縮） F004含防腐劑的Tris緩沖液 1x50ml *除了#F505，所有成分都可單獨(dú)購(gòu)買儲(chǔ)存&穩(wěn)定性*為了保持穩(wěn)定，所有的試劑應(yīng)儲(chǔ)存在2

8、76;C至8°C，直到打印所示的截止日期為止*若作為底物的試劑在450nm吸光度大于0.1，則不要使用*試劑盒所帶的復(fù)原液在保質(zhì)期前都是穩(wěn)定的材料和器材（試劑盒不提供）能在450&650nm對(duì)微量滴定板進(jìn)行讀數(shù)的分光光度計(jì)（如果你微量滴定板不能不提供雙波長(zhǎng)的分析，你可以讀取450nm波長(zhǎng)）移液槍 50µL 和100µL多頭或多道移液器 100µL微量滴定板旋轉(zhuǎn)器 150 - 200 rpm樣品稀釋液 推薦用Cat # 1028蒸餾水1L洗滌瓶，用來(lái)稀釋洗液警告*僅供研究和工業(yè)使用*終止液是0.5N硫磺酸，禁止眼睛、皮膚或衣服與之接觸。試劑盒的其他

9、試劑均無(wú)害*該試劑盒只能由有資格的技術(shù)人員操作試劑預(yù)處理*將所有試劑放到室溫下*用蒸餾水將濃縮的洗液稀釋到1L，在試劑盒上貼上標(biāo)簽，寫上組別和失效日期，儲(chǔ)存在4°C注意事項(xiàng) 1.正確洗板，除去過(guò)量的未反應(yīng)試劑對(duì)保持實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性和靈敏度是必不可少的。我們強(qiáng)烈建議不要使用自動(dòng)化或其他手動(dòng)操作的真空吸塵裝置清洗板，因?yàn)檫@樣會(huì)降低特異性的吸光度，增加非特異的吸光度，使精確度改變。下面介紹的人工清洗程序在一般情況下只造成較低的背景干擾，且特異性的吸光度高，精確度更好。 2.樣品中HCP濃度高時(shí)可觀察到高劑量鉤狀效應(yīng)或低水平的線性稀釋。高劑量鉤效應(yīng)是由于在純化上游階段樣品的HCP濃度過(guò)高，相對(duì)來(lái)

10、說(shuō)抗體較低而引起的。濃度大于1mg/mL 的樣品，其吸光度低于200 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)液。當(dāng)抗體濃度超過(guò)HCP濃度時(shí)，也會(huì)出現(xiàn)鉤效應(yīng)。在這種情況下，未稀釋的樣品的吸光度可能低于試劑盒最高標(biāo)準(zhǔn)液的吸光度。然而，這些樣本不能顯示隨著稀釋度增加，HCP濃度也增加的線性關(guān)系。鉤狀效應(yīng)最常出現(xiàn)在純化上游階段。如果可能出現(xiàn)鉤狀效應(yīng)，我們需要對(duì)已稀釋的樣品進(jìn)行檢測(cè)。如果未稀釋樣品中HCP的濃度低于已稀釋樣品中HCP的濃度，則可能引起鉤狀效應(yīng)。這樣的樣品至少要稀釋到用實(shí)驗(yàn)中間品和終成品驗(yàn)證了的需要稀釋的最低限度（MRDS）。在保證統(tǒng)計(jì)學(xué)精確度的情況下，一系列能檢測(cè)出相同HCP值的樣品稀釋度中，MRD是第一個(gè)符

11、合要求的稀釋度。據(jù)報(bào)道，樣品的稀釋度與HCP值的關(guān)聯(lián)是在已建立的MRD的基礎(chǔ)上修正的。所用稀釋劑應(yīng)該準(zhǔn)確回收。首選的稀釋劑是我們規(guī)格為100ml、500ml或1l/瓶的 Cat# I028。本試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)液也是由這種稀釋液制備的。當(dāng)樣品用1028稀釋時(shí)，其稀釋模型開始接近標(biāo)準(zhǔn)，從而減少用其他稀釋液所造成的任何錯(cuò)誤。其他要用的稀釋液必須測(cè)試非特異性的結(jié)合，并用它們回收 已稀釋的200ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)液，方法如下文所述。局限性*在依靠這種檢測(cè)來(lái)檢測(cè)宿主細(xì)胞殘留蛋白之前，每一個(gè)實(shí)驗(yàn)室都應(yīng)該驗(yàn)證該試劑盒的抗體和檢測(cè)程序的特異性、準(zhǔn)確性和精確度是否符合要求?？梢詮奈覀児镜姆?wù)部門或網(wǎng)站獲得驗(yàn)證試驗(yàn)的方

12、法。*在本實(shí)驗(yàn)中使用的標(biāo)準(zhǔn)品包括用常規(guī)方法在疫苗產(chǎn)品初次收獲液中溶解的Vero細(xì)胞HCPs。在該試劑盒中使用的用來(lái)分析抗體的1D Western blot可識(shí)別經(jīng)敏感蛋白染色（如銀染和膠體金染色）的大多數(shù)的PAGE分離的條帶。由于Vero 細(xì)胞系的大多數(shù)HCPS會(huì)表現(xiàn)出足夠的抗原量，該試劑盒應(yīng)該有足夠的抗體活性與你的細(xì)胞系充分反應(yīng)。但是，我們不能保證該試劑盒能檢測(cè)出你們生產(chǎn)過(guò)程中所有的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段。如果你希望用比 western blot 更為靈敏的方法來(lái)檢測(cè)該試劑盒中的抗體與你的HCPs是否充分反應(yīng)，我們將為你提供經(jīng)過(guò)ELISA后用2D-HPLC分離HCPs的方法。*某些樣品基質(zhì)可能會(huì)

13、干擾試驗(yàn)。本試劑盒使用的標(biāo)準(zhǔn)品試圖模擬典型的樣品與基質(zhì)矩陣。然而，潛在的產(chǎn)品本身或樣品基質(zhì)中的其他成分可能對(duì)本實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生一些正向或負(fù)向干擾。高或低的PH值，去垢劑，尿素，高濃度的鹽和有機(jī)溶劑是已知的干擾因素。建議對(duì)所有樣品基質(zhì)進(jìn)行測(cè)試以排除干擾，用經(jīng)稀釋的200ng/ml標(biāo)準(zhǔn)液，1/4的基質(zhì)不含或含非常低的HCP。如果要用標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)未知樣品，則需添加30到50 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)品的HCP值。至于如何定量樣品基質(zhì)的值，請(qǐng)咨詢公司服務(wù)部門。*避免對(duì)含有疊氮化鈉（NaN3）的樣品進(jìn)行測(cè)定，因?yàn)樗鼤?huì)破壞辣根過(guò)氧化酶的連接活性，測(cè)得的HCP值偏低。實(shí)驗(yàn)方案* 該測(cè)定是非常強(qiáng)大的，可通過(guò)改變孵育時(shí)間、樣本大小

14、及它后續(xù)反應(yīng)等實(shí)驗(yàn)中的可變因素可提高敏感性，增加分析范圍或減少樣本基質(zhì)干擾。在修改我公司推薦的方法之前請(qǐng)聯(lián)系我們，我們將以最佳方式輸入數(shù)據(jù)以確保達(dá)到您期望的目的。*實(shí)驗(yàn)指定使用經(jīng)認(rèn)證的微量滴定板振動(dòng)器或旋轉(zhuǎn)器進(jìn)行免疫學(xué)操作。這些設(shè)備可以從大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室購(gòu)買，不需要在公司買?；蛘吣阋部梢灾苯釉谖覀児举?gòu)買經(jīng)驗(yàn)證的，預(yù)校準(zhǔn)的微量滴定板振動(dòng)器。如果你沒(méi)有這樣的裝置，可以直接在板中孵育，不需要震蕩，但要將免疫孵育時(shí)間延長(zhǎng)到一個(gè)小時(shí)左右來(lái)達(dá)到使用振蕩器所達(dá)到的效果。孵育時(shí)的前30min不要振蕩，否則會(huì)造成背景污染或降低精確度。*將所有試劑放到室溫下。設(shè)置板的分光光度計(jì)的測(cè)試波長(zhǎng)為450nm，650nm處的

15、讀數(shù)為作為參考。*徹底清洗是保證本實(shí)驗(yàn)性能的必不可少的步驟。我們強(qiáng)烈建議不要使用自動(dòng)化或其他真空吸塵裝置清洗板。本實(shí)驗(yàn)推薦的手工清洗方法是保證精確性、敏感性和正確性的首選。關(guān)于此方法更詳細(xì)的信息可以從公司的服務(wù)部門或網(wǎng)站獲得。*所有標(biāo)準(zhǔn)品、對(duì)照品和樣品至少應(yīng)做一次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。*實(shí)驗(yàn)板孔加入試劑的順序應(yīng)一致，以保證所有反應(yīng)孔的孵育時(shí)間一致。*作一個(gè)工作記錄，以確定檢測(cè)時(shí)標(biāo)準(zhǔn)品、對(duì)照品和樣品各自的位置。*建議您的實(shí)驗(yàn)室對(duì)每一個(gè)過(guò)程的對(duì)照品進(jìn)行測(cè)試，以確保所有試劑和程序是正確的。強(qiáng)烈要求你用來(lái)自所用的細(xì)胞系的樣品基質(zhì)和HCP做一個(gè)典型樣品矩陣作為對(duì)照。這些對(duì)照品可分裝到單次使用的小瓶中，并保存在0度使

16、其長(zhǎng)時(shí)間保持穩(wěn)定。*如果該底物具有明顯的藍(lán)顏色，可能是在檢測(cè)之前已被污染。如果100µL底物的吸光度加上以100µL水為空白對(duì)照時(shí)的吸光度超過(guò)0.1，我們就需要更換新的底物，否則實(shí)驗(yàn)的敏感性會(huì)受影響。*應(yīng)在加入終止液后的30min內(nèi)讀板，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)著色會(huì)隨著時(shí)間的推移而褪色。質(zhì)量控制*重復(fù)樣品的精確度用兩者的平均百分比計(jì)算。在8-200ngmL的樣品范圍內(nèi)，變異系數(shù)小于10%，而樣品8 ng/ml時(shí)，變異系數(shù)可大于10%。*當(dāng)以水為底物進(jìn)行空白對(duì)照時(shí)，最佳吸光度應(yīng) < 0.1.*建議各實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)每個(gè)過(guò)程中的的質(zhì)量控制樣品，以確保所有試劑和程序是正確的。結(jié)果計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)液可

17、用于制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)液濃度相當(dāng)于免疫反應(yīng)HCP總濃度。根據(jù)測(cè)定的小孔中標(biāo)準(zhǔn)液吸光值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。數(shù)據(jù)分析可以使用計(jì)算機(jī)選配曲線，例如點(diǎn)到點(diǎn)、三次樣本函數(shù)或四參數(shù)邏輯曲線。不要使用線性回歸分析修改樣品吸光值，這樣會(huì)出現(xiàn)顯著誤差。也可以手工繪圖，Y軸標(biāo)注吸光度，X軸標(biāo)注濃度。然后根據(jù)樣品吸光值計(jì)算出樣品中HCP濃度。 實(shí)驗(yàn)步驟1. 分別移取50µL標(biāo)準(zhǔn)液、對(duì)照物和樣品至待測(cè)孔2. 移取100µl anti-Vero Cell:HRP(#F501)至每孔3. 密封滴定板，搖床室溫(24°C + 4°)溫育2小時(shí)，180rmp4.直接傾到或用移液管輕輕吸走孔內(nèi)

18、溶液，并用吸水紙吸干殘留液。350 µL的清洗緩沖液沖洗四次。擦干微量滴定板外的液體，因?yàn)槿魏螝埩粑锒紩?huì)影響讀數(shù)。清洗緩沖液不能長(zhǎng)時(shí)間停留在孔內(nèi)。加TMB前不能讓孔內(nèi)干燥。5. 加100µl TMB 作用物(#F005)6. 室溫靜置30min,不需搖床7. 加100µl反應(yīng)終止液(#F006)8. 分光光度計(jì)450/650nm讀數(shù)，以空白對(duì)照調(diào)零。范例孔含量抗體 450nm抗體量1A0標(biāo)準(zhǔn)品0.1121B0標(biāo)準(zhǔn)品0.1090.1111C2ng/mL0.1421D2ng/ml0.1410.1421E8ng/ml0.2051F8ng/ml0.2080.2071G25

19、ng/ml0.4001H25ng/ml0.4210.4112A75ng/ml0.9572B75ng/ml1.0130.9852C200ng/ml2.2992D200ng/ml2.3162.3082E樣品A0.2132F樣品A0.2090.2118.42G樣品B0.9392H樣品B0.9820.96172.9性質(zhì) Cygnus Technologies用傳統(tǒng)方法對(duì)試劑盒性能進(jìn)行了如下驗(yàn)證。如果需要的話，認(rèn)證報(bào)告可從公司網(wǎng)站獲得。此驗(yàn)證在本質(zhì)上是通用的，并且是為了補(bǔ)充而不是替換某些用戶和產(chǎn)品應(yīng)該具有的由每個(gè)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行的資格驗(yàn)證。但這些實(shí)驗(yàn)室必須對(duì)他們自己的樣本做一次實(shí)驗(yàn)矯正。另外，本試驗(yàn)范圍內(nèi)產(chǎn)生

20、的來(lái)源于HCPs的任何樣品類型均應(yīng)進(jìn)行稀釋線性以確保檢測(cè)的準(zhǔn)確性，并確定具有足夠的抗體與你的HCPs充分反應(yīng)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)室和技術(shù)人員在要求精確性的檢測(cè)過(guò)程中應(yīng)該具有如下描述的能力。更多的建議做的驗(yàn)證程序可在公司服務(wù)部門或網(wǎng)站獲得。敏感度最低檢測(cè)限（LOD）定義為比空白對(duì)照的平均值高兩倍的樣品濃度。LOD是 0.7 ng/mL.最低定量限（LOQ）被定義為濃度變化系數(shù)（CVS）是小于20%時(shí)可測(cè)到的最低濃度。 LOQ is <2 ng/mL。精確度組內(nèi)（20個(gè)重復(fù)）和組間（10個(gè)實(shí)驗(yàn)）的精確度有3個(gè)水平（ 8ngml）、中（ 25ng/ml）、高濃度（ 75ngml）的檢測(cè)結(jié)果決定。CV百分

21、比為三個(gè)水平所測(cè)的平均值除以標(biāo)準(zhǔn)偏差再乘以100。水平組內(nèi)CV組間CV低6.9% 4.4%中5.5% 3.7%高3.5% 3.6%特異性/交叉反應(yīng)對(duì)4中商用的商業(yè)Vero細(xì)胞株進(jìn)行1D Western blot and ELISA分析 表明，在所有細(xì)胞系中大多數(shù)的蛋白質(zhì)是保守的。因此此方法也可用來(lái)檢測(cè)其他Vero細(xì)胞株的HCP。1D/2D Western blot與ELISA無(wú)關(guān)，且不能用銀染或膠體金染色技術(shù)對(duì)非特異的蛋白進(jìn)行染色。即使如此，銀染結(jié)果和western blot結(jié)果不一致并不一定意味著沒(méi)有抗那種蛋白的抗體或用 ELISA 不能檢測(cè)到那種蛋白質(zhì)。如果你想在檢測(cè)試劑盒中抗體與 HCPs的反應(yīng)時(shí)用比western blot更為敏感和特異的方法， Cygnus很高興能夠提供的服務(wù)和/或基于2D高效液相色譜法的 ELISA分析 HCPs的咨詢。這種方法已被證明在檢測(cè)HCP時(shí)具有更高的靈敏度和精確度。同樣的用于捕獲的抗體和HRP標(biāo)簽可以單獨(dú)購(gòu)買 如# VC 807-AF。 沒(méi)有用這個(gè)試劑盒對(duì)非HCP成分的交叉反應(yīng)進(jìn)行廣泛的研究。因?yàn)榇嬖谡蚋蓴_，如交叉反應(yīng)