重組蛋白多肽藥物的臨床藥代動(dòng)力學(xué)解析

1、綜述*基金項(xiàng)目：國(guó)家自然基金資助重點(diǎn)項(xiàng)目(39930180重組蛋白多肽藥物的臨床藥代動(dòng)力學(xué)*湯仲明，劉秀文,宋海峰,朱寶珍(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所生物技術(shù)藥物代謝實(shí)驗(yàn)室,北京100850摘要扼要介紹重組蛋白多肽類藥物的臨床藥代動(dòng)力學(xué)研究的內(nèi)容、方法和特 點(diǎn)。綜述了重組內(nèi)皮抑制素、重組糖基化血小板生成素、改構(gòu)腫瘤壞死因子、重組 糖基化尿激酶原、人源化單抗trastuzumab和重組人腫瘤壞死因子受體臨床藥代動(dòng) 力學(xué)研究的方法學(xué)、內(nèi)容和結(jié)果。關(guān)鍵詞基因重組蛋白多肽藥物；臨床藥代動(dòng)力學(xué)；酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定中圖分類號(hào)R969. 1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A 文章編號(hào)1003-3734(2002 10-0750

2、-07Cli nical pharmacok in etics of recomb inant protein or peptidesTANG Zho ng -mi ng , LIU Xiu -w en, SONG Ha-i fe ng, ZHU Bao -zhe n(L aboratory f or Metabolism o f Biotech no logy -Derived Dr ugs , I n stitute of Radiati onM edicine, Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100850, ChinaAbst

3、ract The cli nical pharmacok in etics on recomb inant protein or peptides, in clud ing the methodolog y, conten ts, and characteristics w ere in troduced in brief. The recomb inant en dostat in, re -comb inant glycosylated throm bopoeit in, recomb inant modified tumor n ecrosis factor alpha, recomb

4、inant g ly cosy lated prourok in ase, huma ni zed monoclonal an tibody trastuzumab, and recomb inant huma n tumor n ecrosisfactor receptor were review ed w ith respect to their methodolog y and pharmacok in etic behav -ior.Keywords recomb inant prote in or peptides; cli ni cal pharmacok in etics; en

5、 zyme - lin ked im -muno sorbe nt assay由于分子生物學(xué)、基因工程技術(shù)和基因組學(xué)研究的飛速發(fā)展，蛋白多肽類藥物的數(shù)目日益增長(zhǎng)，治療疾病種類越來(lái)越多，其療效越來(lái)越好。如近年新批準(zhǔn)上市的人鼠嵌合抗體、人源化抗體、受體藥物、蛋白毒素融合蛋白和放射 免疫治療等，其相對(duì)分子質(zhì)量從幾個(gè)氨基酸的小肽至巨大的免疫球蛋白。蛋白多肽類藥物的臨床藥代動(dòng)力學(xué)是藥物臨床研究的重要內(nèi)容。與化學(xué)藥物不同,蛋白多肽有些是內(nèi)源性物質(zhì)，藥代動(dòng)力學(xué)研究時(shí)首先需考察基線水平；蛋白可能 引發(fā)抗體干擾藥代動(dòng)力學(xué)過(guò)程。最突出特點(diǎn)是蛋白多肽和內(nèi)源性蛋白多肽都由氨基 酸組成,結(jié)構(gòu)相似不易區(qū)別。藥代動(dòng)力學(xué)研究

6、中，目標(biāo)蛋白給藥量小，血漿濃度極低, 在 pg mL-1或ngmL -1水平，而各種內(nèi)源性蛋白含量要高出數(shù)千上萬(wàn)倍，這種干擾使目標(biāo)分子的 準(zhǔn)確測(cè)量非常困難，其藥代動(dòng)力學(xué)研究測(cè)定方法必須有高度專屬性、靈敏度及較高 日內(nèi)和日間精密度及準(zhǔn)確度。這是蛋白多肽類藥物藥代動(dòng)力學(xué)研究的困難和特殊性15。1臨床藥代動(dòng)力學(xué)研究的目的和內(nèi)容蛋白多肽類藥物藥代動(dòng)力學(xué)研究的目的和內(nèi)容與化學(xué)藥物研究沒(méi)有很大差別。下面以美國(guó) FDA新批準(zhǔn)上市的重組人腫瘤壞 死因子受體（Enbrel, rhu TNFR Fc為例（這是嶄新類型的受體藥物,說(shuō)明蛋白臨床藥 代動(dòng)力學(xué)研究在新蛋白多肽藥物研究中的內(nèi)容、地位和作用。1. 1研究背景

7、TNFR Fc （通用名etanercept是人腫瘤壞死因子受體（TNFR細(xì)胞外配基-結(jié)合部分75 103（p75組成的二聚體融合蛋白。T NFR Fc的Fc部分含IgG 1的CH 2結(jié)構(gòu)區(qū)、CH 3結(jié)構(gòu)區(qū)和鉸鏈區(qū),無(wú)CH 1結(jié)構(gòu)區(qū),用重組DNA技術(shù)在中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞 （CHO表達(dá)系統(tǒng)中產(chǎn)生，由934個(gè)氨基酸組成，相對(duì)分子質(zhì)量約150 103o TNFR Fc 是腫瘤壞死因子的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，可抑制TNF與細(xì)胞表面受體結(jié)合，淋巴毒素（LT 也可與融合蛋白結(jié)合，在治療活性中也有作用。TNFR Fc與細(xì)胞表面受體親和力約為1010L mol -1, 與TNF的親合力接近,TN -FR Fc可中和外源

8、性給予TNF的致死性活性。1.2臨床藥代動(dòng)力學(xué)研究?jī)?nèi)容13例健康受試者靜注單劑量1,5, 10, 15, 30,60mg m -2的開(kāi)放平行設(shè)計(jì)/期研究，在內(nèi)毒素所致實(shí)驗(yàn)性內(nèi)毒素血癥模型上評(píng)價(jià)rh-TNFR Fc的安全性和有效性。12例患者給予10或60mg m -2和內(nèi)毒素評(píng)價(jià)T NFR Fc的藥代動(dòng)力學(xué)。85例敗血癥患者 期多中心試驗(yàn)，靜注給予單劑量0. 15, 0. 45或1.5mg kg -1的雙盲、隨機(jī)、安慰劑對(duì)照、平行設(shè)計(jì)研究，評(píng)價(jià)其安全性和有 效性。7例HIV陽(yáng)性患者/期開(kāi)放平行試驗(yàn)，皮下注射單劑量0. 25, 1或2. 5mg m -2,而后每周2次皮下注射0. 125, 0.

9、 5或1.25mg m -2,共8周，在HIV -1感染中評(píng)價(jià)安全性和有效性。正常志愿者（n =8、活動(dòng)性類風(fēng)濕樣關(guān)節(jié)炎（n =6或Crohn s病（n =1中的一項(xiàng)開(kāi)放平行設(shè)計(jì)I期研究,評(píng)價(jià)藥代動(dòng)力學(xué)和生物利用度。用放射性 標(biāo)記藥物或ELISA測(cè)定藥物水平。健康志愿者 8例單次皮下注射1,2, 4, 8或16mg m -2的I標(biāo)記藥物；Crohn氏病患者1例單次靜脈注射16mg m -2125I標(biāo)記藥物；活動(dòng)性類風(fēng)濕樣關(guān)節(jié)炎患者6例分2組，每組3例,分別單次皮下注 射 6, 16mg m -2125I標(biāo)記藥物。重復(fù)用藥治療活動(dòng)性類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的開(kāi)放平行設(shè)計(jì)多中心研究 中,在28例用改變病情的

10、抗風(fēng)濕藥（DMARD失敗的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者,皮下注射 25mg m -2每周2次，共6個(gè)月。正常志愿者給予冷凍干燥的 TNFR Fc的藥代動(dòng)力 學(xué)和生物利用度研究。26例健康志愿者中，皮下給予25mg m -2TNFR Fc的開(kāi)放交 叉研究，比較2個(gè)廠家的藥物的生物等效性研究。由此可見(jiàn)，蛋白多肽類藥物臨床藥 代動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)包括：各種治療適應(yīng)證條件下的I期劑量遞增藥代動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)、多次 給藥藥代動(dòng)力學(xué)研究、生物利用度試驗(yàn)和改變制劑的生物等效性試驗(yàn)。這些內(nèi)容是 藥物臨床研究中保證有效性和安全性的基本要求 ，和化學(xué)藥物沒(méi)有本質(zhì)的不同。2 臨床藥代動(dòng)力學(xué)研究的方法學(xué)建立專屬性強(qiáng)、靈敏度高的測(cè)定方法是藥代

11、動(dòng)力學(xué)研究的前提和關(guān)鍵。3種常用方法是：同位素標(biāo)記結(jié)合物理化學(xué)的分離分析法、免疫學(xué)分析法及生物檢定分析 法。應(yīng)按具體情況選用1種或多種分析方法，提供方法學(xué)可靠性的科學(xué)依據(jù)。非臨 床研究時(shí)最好選用或建立臨床藥代動(dòng)力學(xué)分析方法，這將有利于比較動(dòng)物與人藥代動(dòng)力學(xué)的差異。雖然國(guó)外有用同位素標(biāo)記方法進(jìn)行 臨床藥代動(dòng)力學(xué)研究的報(bào)道，但是臨床研究一般多選用免疫學(xué)測(cè)定方法及生物檢定 測(cè)定方法。2. 1方法學(xué)的建立和確證 可行性和可靠性驗(yàn)證中應(yīng)包括監(jiān)測(cè)質(zhì)控樣品（QC ,目 的是不斷檢驗(yàn)方法是否有效。基本要求是檢驗(yàn)測(cè)定方法的特異性、最低定量限 （LOQ、標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍、精密度與準(zhǔn)確度、樣品保存條件和穩(wěn)定性等。

12、2. 2免疫分析方法Piscitelli等125總結(jié)1997年前重組細(xì)胞因子臨床藥代動(dòng)力學(xué)的研究后指出：ELISA已成為最 常用的檢測(cè)方法，而且可買(mǎi)到測(cè)定大范圍的各種細(xì)胞因子商品藥盒。單克隆抗體產(chǎn) 品交叉反應(yīng)很小,價(jià)格也比H PLC便宜;雖然,生物檢定可測(cè)量某種生物學(xué)事件（如 增殖或細(xì)胞毒，但因耗費(fèi)高，完成時(shí)間長(zhǎng)，缺乏專屬性，靈敏度差且結(jié)果易受環(huán)境條 件影響,故一般不用于細(xì)胞因子分析。我們查閱了 1997年以后的文獻(xiàn)，這種情況依 然如此。目前有多個(gè)免疫學(xué)測(cè)定方法可供選擇，能否正確選擇適宜的方法是臨床藥 代動(dòng)力學(xué)研究成敗的關(guān)鍵之一。2. 2. 1酶免疫測(cè)定（EIA是最簡(jiǎn)單的免疫分析法,只需一個(gè)多

13、克隆抗體。放射免 疫分析法（RIA因涉及設(shè)備及放射性污物的處理和防護(hù)等缺點(diǎn)逐漸被EIA替代。原理是將俘獲抗體包被在微孔板孔內(nèi)，與隨后加入的標(biāo)準(zhǔn)品或樣品內(nèi)抗原和生物素化 抗原形成特異性抗原抗體復(fù)合物。生物素化抗原和標(biāo)準(zhǔn)品或樣品內(nèi)抗原競(jìng)爭(zhēng)抗體結(jié) 合位點(diǎn),抗原濃度增加時(shí)，抗體俘獲生物素化抗原量降低。加入鏈親合霉素偶聯(lián)堿性 磷酸酶（只和生物素化抗原結(jié)合和顯色試劑后，產(chǎn)生的吸光度和被測(cè)定抗原濃度呈 負(fù)相關(guān),吸光度越高，抗原濃度越低。2. 2. 2酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA此法最為常用,利用2個(gè)對(duì)被測(cè)定抗原的抗體 組成定量夾心餅干免疫技術(shù)。一個(gè)抗原單抗預(yù)先包被在微孔板上，當(dāng)含抗原的標(biāo)準(zhǔn) 品或樣品加入至孔

14、內(nèi)時(shí)，抗原與固化在孔內(nèi)的第一抗體結(jié)合。徹底洗去未結(jié)合物后 再加入與顯色反應(yīng)酶偶聯(lián)的第二抗體。洗掉未結(jié)合的第二抗體-酶試劑后,加入起顯色作用的酶底物溶液，反應(yīng)產(chǎn)生的顏色產(chǎn)物的量與第一抗體結(jié)合的抗原量成比例。 用終止液中止顏色反應(yīng)，測(cè)定顏色反應(yīng)強(qiáng)度（光吸收。用同一板上生成的標(biāo)準(zhǔn)曲線 計(jì)算未知樣品內(nèi)被檢測(cè)的抗原濃度。2. 2. 3高靈敏度（HS-ELISA法此法與ELISA不同的是增加了一個(gè)增色放大系統(tǒng),如R&D Sys -tems公司生產(chǎn)的檢測(cè)TNF - 的高靈敏度免疫放大系統(tǒng)堿性磷酸酶。將還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 （NADP在底物存在時(shí)脫磷酸形成還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸 （NAD

15、H , NADH作為特異性輔助因子，激活醇脫氫酶和放大因子硫辛酰胺脫氫酶,組成第2個(gè)酶系統(tǒng)。 硫辛酰胺脫氫酶催化NADH還原四唑鹽產(chǎn)生顏色很強(qiáng)的四唑鹽和 NAD +,乙醇還原在醇脫氫酶催化下，NAD +又被生成NADH,形成氧化還原循環(huán)。四唑鹽的還原速率和生成的顏色產(chǎn)物量 與第一步結(jié)合的TNF -量成正比。這種方法靈敏度極高，但必須注意：無(wú)機(jī)磷酸鹽也 是堿性磷酸酶的強(qiáng)競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，應(yīng)避免被磷酸鹽緩沖液和其他無(wú)機(jī)磷酸鹽污染。 用獨(dú)立吸管和玻璃器皿以避免交叉污染。為減低非特異性結(jié)合，小心洗滌微孔板極為重要。2. 2. 4化學(xué)發(fā)光ELISA法用定量夾心餅干免疫技術(shù) 將被測(cè)定抗原特異的單抗 預(yù)包被在微

16、孔板上，含被測(cè)定抗原的標(biāo)準(zhǔn)品和樣品加入孔內(nèi)，抗原與固化抗體結(jié)合。 洗去未結(jié)合物質(zhì)后，將對(duì)抗原特異的酶聯(lián)多抗加至孔內(nèi)。洗去未結(jié)合抗體 -酶試劑， 孔內(nèi)加入增強(qiáng)劑魯米諾（luminol /過(guò)氧化氫底物溶液，產(chǎn)生光強(qiáng)度與最初結(jié)合的抗原 量成比例。用微孔板發(fā)光讀入儀測(cè)定發(fā)射光強(qiáng)度。不同免疫分析方法的靈敏度和測(cè)定范圍差異很大，如表1。表1普通ELISA法、高靈敏度 EL I S A和化學(xué)發(fā)光ELISA法靈敏度和線性范圍比較被測(cè)定抗原參數(shù)普通ELISA高靈敏度EL ISA化學(xué)發(fā)光EL ISA T NF -靈敏度/pg mL -14. 40. 180. 5測(cè)定范圍/pg mL -115. 610000. 5

17、320. 77000IL -12靈敏度/pg mL -150. 50. 6測(cè)定范圍 /pg mL -7. 85000. 781500. 77000藥盒均是R&Dsystems公司生產(chǎn)本實(shí)驗(yàn)室曾用高靈敏度ELISA解決了肌內(nèi)注射低劑量改構(gòu) T NF -后測(cè)不到濃 度的問(wèn)題?；瘜W(xué)發(fā)光ELISA的特點(diǎn)是靈敏度高和測(cè)量范圍大,適于藥-時(shí)曲線變動(dòng) 較大的樣品測(cè)定。高靈敏度 ELISA和化學(xué)發(fā)光ELISA所需儀器價(jià)格昂貴,需根據(jù) 需求,權(quán)衡利弊后決定采用什么方法。2. 2. 5注意事項(xiàng) 不同廠家生產(chǎn)的相同蛋白的免疫反應(yīng)很不相同，首先必須在體 外實(shí)驗(yàn)證明藥代動(dòng)力學(xué)測(cè)定的蛋白多肽樣品（抗原的免疫性反應(yīng)

18、和藥盒標(biāo)準(zhǔn)品相 同。實(shí)驗(yàn)需設(shè)置2條標(biāo)準(zhǔn)曲線，一是藥盒標(biāo)準(zhǔn)曲線，另一是受試品抗原標(biāo)準(zhǔn)曲線。2 條標(biāo)準(zhǔn)曲線必須平行才能用藥盒標(biāo)準(zhǔn)曲線，否則應(yīng)采用受試品標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算未知樣 品中的濃度。2. 3生物檢定測(cè)定方法 生物檢定是測(cè)定樣品中蛋白多肽的特異生物學(xué) 活性的濃度，如依賴細(xì)胞株的增殖或抑制活性，特異性酶水解反應(yīng)，甚至整體動(dòng)物特 異和靈敏的量效反應(yīng)等，從中獲得血目標(biāo)蛋白濃度-時(shí)間曲線和藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。生 物檢定法的優(yōu)點(diǎn)是反映藥物療效相關(guān)的生物活性，缺點(diǎn)是專屬性差，受實(shí)驗(yàn)條件影響大，費(fèi)時(shí)費(fèi)事和實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)。生物檢定測(cè)得的量不是物理量，常用該蛋白的活性單位或等效量表示。尿激酶原的血藥濃度曾采用纖溶酶水解生色

19、小肽S2444的活性濃度。3新蛋白多肽藥物臨床藥代動(dòng)力學(xué)研究實(shí)例3. 1大腸桿菌表達(dá)重組內(nèi)皮抑制素臨床/期試驗(yàn)的藥代動(dòng)力學(xué)研究此研究是中 國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院進(jìn)行的/期臨床試驗(yàn)組成部分，本實(shí)驗(yàn)室完成藥物濃度測(cè)定 和分析。重組人內(nèi)皮抑制素(YH-16由榮昌生物工程有限公司生產(chǎn)，批號(hào):980925,比 活性1.0 105IU mg -1,2. 0 105IU/瓶，生理氯化鈉溶液溶解后立即靜滴。藥物由大腸 桿菌表達(dá),氨基酸序列與天然及國(guó)外臨床試驗(yàn)酵母表達(dá)重組內(nèi)皮抑制素結(jié)構(gòu)不同，其N端為多9個(gè)氨基酸殘基的His -tag。EIA方法學(xué)確證表明,測(cè)定血清YH -16抗原濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線和藥盒提供的標(biāo)準(zhǔn)品 (

20、為酵母表達(dá)產(chǎn)品 的標(biāo)準(zhǔn)曲線不同，曲線右移和斜率不同。為此每塊免疫分析板上 均采用YH -16的標(biāo)準(zhǔn)曲線，用來(lái)計(jì)算相同板上血漿樣品未知濃度。方法學(xué)結(jié)果表明 測(cè)定血清YH -16的靈敏度、特異性、線性范圍、精密度和準(zhǔn)確度均符合我國(guó)生物 制品臨床藥代動(dòng)力學(xué)研究要求。12例健康志愿者隨機(jī)分為4組,每組3例,分別靜脈滴注YH -16注射液30, 60, 120和210mg m -2; 10例腫瘤患者分為3組,每組分別為4, 3和3例,分別靜脈滴注 YH -16注射液7. 5, 15和30m g m -2 d -1,連續(xù)28d。用E IA藥盒測(cè)定血藥濃度，以 靜脈滴注一房室線性模型和統(tǒng)計(jì)矩法估算藥代動(dòng)力學(xué)

21、參數(shù)。健康志愿者30m in內(nèi)單次靜滴30和60m g m -2,及120m in內(nèi)靜滴120和 210mg m -2 的 C max 分別為(4. 30 0. 69 , (13. 87 0. 61 , (11.49 3. 29和 (29. 23 13. 98 g mL -1; A UC 0-24h分別為(9. 64 1.29, (18. 67 4. 99, (58. 94 22. 52和 (124.78 42. 94 g h mL -1; t 1/2末端分 別為(9. 9 1.5 , (8. 2 1.9 , (9. 8 0. 1 和(9. 5 1. 1 h; Cl S 分別為(2. 8 0.

22、 6 , (3. 2 0. 9 , (2. 1 0. 7和(1. 7 0. 6 L h -1 m -2。滴注速率、時(shí)間和總 劑量均可影響AUC和C max水平,相同速率延長(zhǎng)滴注時(shí)間，不增高C max ,但增加AUC。在研究劑量范圍內(nèi)，YH -16的藥代動(dòng)力學(xué)行為近似線性，可用于預(yù)測(cè)不同劑 量、滴注速率和時(shí)間的血藥濃度。腫瘤患者 120min 內(nèi)靜滴 YH -167. 5, 15 和 30mg m -2 d -1,連續(xù) 28d。 di 的 C mi n 分別為（159 119 , （224 60和（61 48 ng mL -1; C max 分別為（619 422 , （1812 332 和（1

23、735 432 ng mL -1; A UC 024h分別為（3. 21 2. 66 , （6. 752. 91 和（6. 92 0. 96 g h mL -1; d7的 C mi n 分別為（216 117 , （241 114和（160 42 ng mL -1JC max 分別為（869 473 , （1610 179和 （1614438 ng mL-1;A UC 024h分別為（2. 66 1. 76 ,（6. 32 1.28 和（5. 89 1.92 ng h mL -1,蓄積因子分別為（0. 90 0. 39 , （1. 00 0. 23和（0. 87 0. 36 ,谷濃度隨給藥次數(shù)

24、有持 續(xù)增高的趨勢(shì)。總劑量和滴注次數(shù)可影響 C max和C m i n水平。在研究劑量?jī)?nèi)連 續(xù)給藥28d未觀察到明顯的藥物蓄積。3. 2 rhTPO臨床I期試驗(yàn)的藥代動(dòng)力學(xué)研究 血小板生成素（TPO可與受體Mpl 結(jié)合,調(diào)節(jié)生成血小板的骨髓巨核細(xì)胞的增殖、分化、成熟并分裂釋血小板。TPO能明顯刺激血小板生成，增加外周血中血小板計(jì)數(shù)。TPO與紅細(xì)胞生成素、干細(xì)胞 因子、白介素-3、粒細(xì)胞集落刺激因子等有協(xié)同作用，促進(jìn)紅系和粒系祖細(xì)胞的增 殖，促進(jìn)干細(xì)胞進(jìn)入增殖周期。沈陽(yáng)三生制藥股份有限公司研制的rhTPO是由CHO細(xì)胞表達(dá)的全長(zhǎng)糖基化rhT PO蛋白，其臨床試驗(yàn)在北京協(xié)和醫(yī)院進(jìn)行。按GCP原則進(jìn)

25、行劑量擴(kuò)大耐受性試驗(yàn)。合格受試者隨機(jī)分為0. 5, 1和2 g kg -1劑量組,各8例,皮下單次注射。用 R&D Systems公司生產(chǎn)的ELISA藥盒測(cè)定血清rhTPO,每 個(gè)藥盒設(shè)置受試品rhTPO標(biāo)準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，用以計(jì)算未知血樣品內(nèi)的濃度。藥盒抗體與106種人或鼠的細(xì)胞因子、受體或相關(guān)蛋白無(wú)交叉反應(yīng)，特異性好。標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)均大于 0. 998,最低可靠檢出量為15pg mL -1,批內(nèi)精密度6. 8%,批間9. 1%;加藥血清在20800pg mL-1范圍內(nèi)回收率為89. 9%122. 8%。結(jié)果表明，受試者內(nèi)源性TPO水平為（61. 7 34. 8 pg mL -1。皮下

26、注射0. 5, 1和 2 g kg -1的rhTPO后，抗原濃度-時(shí)間曲線符合一房室模型。吸收速率t 1/2K a分別為（2. 5 1. 1 , （3. 2 2. 6和（4. 2 2. 4 h,隨劑量有延長(zhǎng)趨勢(shì)，但 無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。T max分別為（9. 0 1.9 , （10. 8 2. 4和（11.8 5. 4 h。AUC分別為（17. 6 2. 9 , （31.7 12. 9 和（55. 6 21.2 ng h mL -1,與劑量成正比（n =3, r =0. 998, P =0. 029，而全身清除率 分別為（0. 0296 0. 004 , （0. 0398 0. 014和（0. 04

27、14 0. 008 L kg -1 h -1,隨劑量有延緩趨 勢(shì)。末端消除半衰期分別為（46. 3 6. 9 , （40. 2 9. 4和（38. 7 11. 9 h。3. 3改構(gòu)TNF突 變體的臨床I期試驗(yàn)的藥代動(dòng)力學(xué)研究 解放軍空軍總醫(yī)院生產(chǎn)的rhTNF D11a是人天然T NF的突變體，天然TNF的N -端缺失7個(gè)殘基，Asp 8Arg, Ser 9Lys, Asp 10Arg和Leu 157 Phe。與天然TNF有11個(gè)殘基差異故稱rhT NF D11a。修飾結(jié)構(gòu)后動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明毒性減低，療效較好。在中日友好醫(yī)院進(jìn)行了I期臨床研究和藥代動(dòng)力學(xué)研究。預(yù)試驗(yàn)中用國(guó)產(chǎn)某 ELISA藥盒測(cè)定血清

28、濃度，未能測(cè)得。本實(shí)驗(yàn) 室改用Quan -tikine高靈敏ELISA藥盒，測(cè)得個(gè)體內(nèi)源性TNF波動(dòng)，同時(shí)引入內(nèi)源 性干擾問(wèn)題。實(shí)驗(yàn)各板設(shè)受試品rhTNF D11a校正曲線，計(jì)算同一板內(nèi)未知樣品濃 度。觀察腫瘤患者單次肌內(nèi)注射160 104和240 104U藥物（相當(dāng)于100 104和150 104U m -2及連續(xù)7d肌內(nèi)注射160104U d -1后的血清抗原濃度-時(shí)間變化和計(jì)算藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。方法學(xué)可靠性檢驗(yàn)結(jié)果顯示，血清中rhT NF D11a標(biāo)準(zhǔn)曲線與藥盒重組TNF標(biāo) 準(zhǔn)曲線重疊，表明可用該藥盒測(cè)定結(jié)構(gòu)修飾的藥物；靈敏度、特異性、線性、線性 范圍、精密度和回收率均符合我國(guó)藥代動(dòng)力學(xué)研

29、究要求。肌注0. 5h后，血清rhTNF D11a濃度顯著高于給藥前內(nèi)源性水平（P 0. 050.001 , 160 104U劑量組藥后24h 11例患者中有7例的抗原水平已下降至等于或低于 給藥前水平，其中2例在8h已下降至給藥前水平；240 104U組4例患者24h均高于 給藥前。160 104和 240 104U兩劑量組的C m ax分別為（10. 5 8. 3和（14. 7 5. 3 pg mL -1, AU C分別為（50.1 35. 0 和（106. 1 52. 9 ng h mL -1。隨劑量增加，C max , T m a x 和 AUC 有延長(zhǎng)趨勢(shì)， 但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在此劑量

30、范圍內(nèi)近似線性藥代動(dòng)力學(xué)。連續(xù)注射第7次后濃度低于首次注射后濃度,注射后2和3h差異有顯著性（P 0. 05。首次注射后AUC為（50.1 35. 0 g h mL -1,第 7 次注射后為（32. 7 21.0 ng h mL -1（t =0. 179 ;而蓄積因子（A UC第7次/A UC第1次為0. 65。提示連續(xù)注射存在抗原濃度降 低趨勢(shì)，有可能加強(qiáng)藥物消除。這是必須選用高靈敏度ELISA的實(shí)例。3. 4糖基化尿激酶原臨床I期試驗(yàn)的藥代動(dòng)力學(xué)研究軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程 研究所研制的CHO細(xì)胞表達(dá)的單鏈尿型纖溶酶原激活劑（scu -PA,或尿激酶原pro - U K與纖維蛋白親和力高，而

31、與纖維蛋白原親和力較低，因此具有出血少和重新梗死 率低等優(yōu)點(diǎn)，是國(guó)內(nèi)外關(guān)注的尚未上市的新溶栓藥物。I期臨床試驗(yàn)在解放軍總醫(yī) 院心內(nèi)科進(jìn)行，由本實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行藥代動(dòng)力學(xué)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、血藥濃度測(cè)定和總結(jié)。3. 4. 1測(cè)定方法原理 選擇測(cè)定方法是完成本研究關(guān)鍵。因Pro -UK和UK氨基酸組成和序列完全相同,相對(duì)分子質(zhì)量都是54000。Pro -U K在Lys 158與Ile 159 肽鏈結(jié)構(gòu)區(qū)被纖溶酶或激肽釋放酶水解斷裂形成U K,兩鏈間的12對(duì)雙硫鍵斷裂后表現(xiàn)為單鏈或雙鏈。Pro -UK和U K水解生色小肽S2444的酶活性不同,釋放對(duì)硝 基苯胺的速率也不同。利用這些細(xì)微差別分別測(cè)定Pro -UK和

32、U K。選用Technoclone公司的2個(gè)ELISA試劑盒，分別測(cè)定血漿Pro -UK抗原及總u -PA抗原 （Pro -U K+U K濃度,同時(shí)測(cè)定纖溶酶水解S2444的活性濃度。3. 4. 2測(cè)定生物樣品 各抗原組分和纖溶酶活性的方法學(xué)確證 結(jié)果表明,測(cè)定Pro -UK的檢測(cè)低限（LOQ 為2. 5ng mL -1?？贵w與100ng mL -1天然U K無(wú)交叉免疫反應(yīng)。1.2510ng m L -1 范圍內(nèi)濃度對(duì)數(shù)值與吸光度對(duì)數(shù)值呈線性關(guān)系,批內(nèi)精密度10%,在2. 5100ng m L -1范圍內(nèi)加藥血漿回收率為（91.5 9. 8 %。測(cè)定總u -PA的LOQ為2. 5ng m L

33、- 1。2. 5100ng mL -1范圍內(nèi)濃度對(duì)數(shù)與吸收度對(duì)數(shù)值呈線性，精密度10%。測(cè)定纖 溶酶活性濃度在0. 1251IU mL -1范圍內(nèi)濃度對(duì)數(shù)與吸收度對(duì)數(shù)值呈線性，批內(nèi)精 密度10%;受試品在2. 5100ng mL -1范圍內(nèi)均未測(cè)到生物活性。方法學(xué)確證表明,測(cè)定血漿Pro -UK, u -PA抗原和 活性濃度的靈敏度、特異性、線性范圍、精密度和回收率均符合藥代動(dòng)力學(xué)研究要 求。3. 4. 3健康受試者靜注重組u -PA后的藥代動(dòng)力學(xué)19例健康受試者（男10例, 女9例靜脈推注+滴注20, 35和50m g推注與恒速滴注劑量比為0. 25 0. 75后，血 漿Pro -U K、總

34、u -PA和活性濃度依賴劑量明顯增高。滴注期間20mg組u -PA,Pro -UK 和活性濃度分別穩(wěn)定在 9196, 8287ng mL -1 和 0. 620. 70IU mL -1; 35mg 組分別為 195204, 162168ng mL -1 和 2. 13. 0IU mL -1;50mg 組分別為 340360, 246296ngmL -1和2325IU mL -1,劑量間差異有非常顯著性（P <0. 001。滴注結(jié)束后濃度迅速下降，給藥后6h恢復(fù)至藥前水平。20mg時(shí)u -PA和Pro -UK濃度接近,劑量 增加Pro -U K濃度明顯低于u -PA濃度（P <0.

35、001。劑量增大后部分Pro -UK轉(zhuǎn)化 為UK。20mg時(shí)只有很弱的纖溶酶活性濃度，而隨劑量增加UK生成量增加，纖溶 酶活性呈數(shù)量級(jí)增強(qiáng)。在研究劑量范圍內(nèi)，血漿u -PA, Pro -UK和活性濃度的AUC 和C max依賴劑量明顯增高。劑量比為 1 1. 75 2. 5時(shí)，u -PA的AUC （06h分別為 （217 51 , （501 152和（638 63 ng h mL -1（1 2. 3 2. 9 ; Pro -U K 分別為（227 43 , （425 134 和（457 26 ng h mL -1（1 1. 9 2. 0 ;活性濃度分別為（0. 90 0. 33 , （3. 2

36、 1.0和（37. 8 7. 8 IU h mL -1（1 3. 6 42。Cis隨劑量明顯減慢，呈非線性消除特點(diǎn)。20mg時(shí)未見(jiàn)Pro -UK向 UK轉(zhuǎn)化。35和50mg組UK的生成率分別為（15. 4 4. 2 %和（27. 9 7. 0 %,轉(zhuǎn)化率明 顯增高。平均駐留時(shí)間（M RT , t 1/2和T max等時(shí)間參數(shù)差別相對(duì)較小，50mg時(shí)u - PA和scu -PA的MRT和t 1/2比20或35mg有略微縮短（P <0. 05?？刂旗o脈注入 總量、推注分量、滴注速率和滴注時(shí)間可控制Pro -UK和活性UK的轉(zhuǎn)化比例，可保持滴注期間的恒定水平控制纖溶酶活性。這對(duì)充分發(fā)揮Pro

37、-UK特有的親血栓纖維蛋白纖溶活性，避免過(guò)量UK引起出血，有重要臨床和理論意義。試驗(yàn)證明，在蛋 白多肽的臨床藥代動(dòng)力學(xué)研究中也有原藥和活性代謝物生物轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化率的問(wèn)題。3. 5抗腫瘤人源化trastuzumab單抗臨床藥代動(dòng)力學(xué)研究 trastuzum ab商品 名:Herceptin ,是美國(guó)FDA在1998年批準(zhǔn)治療轉(zhuǎn)移性乳癌患者的重組人源化靶向 ErbB -2/HER 2/neu的治療用單抗，治療超表達(dá)HER 2蛋白的腫瘤在接受1種或多種 化療治療后的轉(zhuǎn)移。乳癌超表達(dá) HER 2蛋白時(shí)轉(zhuǎn)移瘤可用trastuzumab與紫杉醇聯(lián) 合治療。HER 2是EGF受體2蛋白的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)區(qū)。單抗是I

38、gG 1,含有人網(wǎng)狀結(jié) 構(gòu)區(qū)域及鼠類抗體結(jié)合 H ER 2的CDR部分。trastuzumab與 HER 2蛋白具高親和 力，抑制在體外和體內(nèi)過(guò)度表達(dá) H ER 2的人腫瘤細(xì)胞的增殖，而且是抗體依賴性細(xì) 胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC的強(qiáng)有力介導(dǎo)物質(zhì)7。3. 5. 1研究?jī)?nèi)容包括3個(gè)期,3個(gè)期和2個(gè)Chinese Journal of N ew D rugs 2002, Vol. 11 No. 10中國(guó)新藥雜志 2002 年第 11 卷第10期期試驗(yàn),受試者都是過(guò)度表達(dá)H ER 2的轉(zhuǎn)移乳癌 患者,未進(jìn)行特殊人群 和制劑的專門(mén)藥代動(dòng)力學(xué)研 究。3個(gè)I期研究：?jiǎn)未谓o予10, 50, 100, 250

39、和500mg ; 每周1次,多 次給予10, 50, 100, 250或500mg ;每 周1次,多 次給予10, 50, 100, 250或500mg和順鉑聯(lián)合應(yīng)用。3個(gè)期研究:每周1次,多次給藥,首次負(fù)荷量 250mg和維持劑量100mg ;每周1次，多次給藥，首次量為250mg和維持量 100mg與順鉑合用。2個(gè)期研究：每周1次，多次給藥，首次4mg kg - 1現(xiàn)多次給藥 后穩(wěn)態(tài)血清水平上升，而清除率又無(wú)變化,提示多次給藥血清穩(wěn)態(tài)濃度的升高可能 是分布變化，而不是消除的變化。3. 5. 5血清脫落抗原的影響trastuzumab清除率- 1增加與患者血清脫落抗原水平相關(guān)。發(fā)現(xiàn)脫落抗原是

40、具有特異性截距500 g mL的函數(shù)。期給予選定劑量，隨多次給藥C min升高,只有約9%患者濃度未達(dá)到20 g mL - 1。不同研究中脫落抗原水平 > 500 g mL 3. 5. 6 - 1和維持量2mg kg - 1的患 者百分比在0 24%之間。期研究的前8周期時(shí)，采集血清,觀察到-1最低有效濃 度水平 與化療合用；每周1次,多次給藥,首次4mg kg - 1和維持量2mg kg - 1。研 究設(shè)計(jì)是依據(jù)藥代動(dòng)力學(xué)模 擬分析的結(jié)果確定的：即每周1次,100mg可達(dá)到動(dòng)物 研究的C min ( 10 20 g mL- 1。增加首次 負(fù)荷量250mg,能更快達(dá)到有效濃度水 平。臨床

41、開(kāi)發(fā)階 段經(jīng)驗(yàn)表明：按體重給藥可使治療反應(yīng)更一致。3. 5. 2單次靜脈滴注 t rast uzumab 90min靜脈滴注 10, 50, 100, 250和 500mg 劑量后（每組 9 11 例, 11/ 2 分別為 1.5, 4. 3, 6. 5, 10. 1 和 15. 5d; Cis 分別為 26. 5, 10. 3, 7. 5, 5. 72和 5. 0mL d3. 5. 3多次靜脈滴注t rast uzumab - 1 1間,在給予 維持量2mg kg期研究前8 周的結(jié)果大于91% （ 177/ 195患者C min達(dá)到20 g m L- 1以上。期數(shù)據(jù)模擬的預(yù) 測(cè)值。尚未確定血

42、清水平能否指示臨床結(jié)果，其相互關(guān)系很可能與多種臨床因素有 關(guān)。尚未得 到腫瘤負(fù)荷 量、脫落抗體和藥代動(dòng)力學(xué)之間相互關(guān)系的資料。3. 5. 7trastuzumab與化療藥物合用時(shí)的藥代動(dòng)力t rast uzum ab與常用化 學(xué)及藥物 之間的 相互作用療藥物順鉑、阿霉素或表柔比星加環(huán)磷酰胺、或紫杉醇聯(lián)合用藥時(shí)未觀 察到藥代動(dòng)力學(xué)相互作用。非臨 床靈長(zhǎng) 類研究中曾提示，t rast uzumab與阿霉素 和Cytox in合用不影響t rast uzum ab或化療藥物的藥代 動(dòng)力學(xué)，但紫杉醇可 改變t rast uzumab的藥代動(dòng)力 學(xué)。紫杉醇能降低trast uzumab在猴中的Cis 5

43、0% ,因而血 清水平增高。3. 5. 8改變制劑的影響改變制劑不影響trastuzumab的藥代動(dòng)力 學(xué)。從單劑量液體改變成為多劑量冷凍干燥制劑未出現(xiàn)trastuzumab的藥代動(dòng)力學(xué) 變化，給予患者任何制劑后AUC和C max相似。3. 6重組人腫瘤壞死因子受體rhu TNFR Fc的臨床藥代動(dòng)力學(xué)3. 6. 1數(shù)健康受試者靜脈注射的主要藥代動(dòng)力學(xué)參-1kg - 1 ,而 V d 分別為 53. 6, 51.5, 55. 3, 48. 5和 65. 6m L kg - 1。每周 1 次,首；V d 為51mL - 1次250mg和維持量100mg共82例的平均值為：t 1/ 2為9. 1d

44、; Cis為6.2 mL d kg - 1 kg - 1 ; C min 為 18. 3 g mL - 1 - 1 - 1 ; C max 為 117 g mL - 1 和 C SS 為102 g m L次量4mg kg。多次靜脈滴注t rast uzum ab,首共159例的平均，維持 量2mg kg值,包括同時(shí)用化療藥物阿霉素或表柔紅霉素加環(huán)磷酰胺或紫杉醇。重復(fù)給藥第8周的觀察值為：t 1/ 2為5. 9d; Cis為5. 08mL d 1 kg - 1 ; V d為36. 3mL 1 kg - 1 ; C m in 為 53. 6 g mL- 1 ; C max 為 99. 8 g mL

45、-和 C SS 為 55. 6 g mL- 1。未 觀察到化療藥物對(duì)trast uzumab藥代動(dòng)力學(xué)的影響。I期單劑量研究期 間確定 了藥代動(dòng)力學(xué)圖形特征。期多次給藥研究 僅觀察了 C min和C max :在1h滴注結(jié)束時(shí) 達(dá)C max。除定量trast uzumab水平外，還分析了血清的庫(kù)抗原（shed ant ig en和抗t rast uzum ab抗體對(duì)t rast uzumab藥代動(dòng)力學(xué)的影響。 3. 5. 4給藥劑量 的 影響早期研究顯示，trast uzumab的清除率隨劑量增大 而降低。劑 量增加時(shí)，半 衰期延長(zhǎng)，全身清除率降低。劑量增加時(shí)分 布容積基本不變，清除率和半衰期

46、的變化很可能反 映單抗消除途徑發(fā)生改變，而不是分布的變化。發(fā) 劑量分別為1,5,10, 15, 30 和 60mg m - 2 , C max ,分別為 0. 4, 2. 1,3. 8, 8. 8, 14. 3和 42. 4 g mL mL - 1 AUC 分別是 45, 159, 305, 586, 1 006和 2 056 g h , t 1/ 2分別是 86, 71,63, 58, 77和 82h，總清除1率C Is分別是23, 32, 33, 26, 30和29m L h表現(xiàn)基本上為線性藥代動(dòng) 力學(xué)7。 3. 6. 2 m- 2。健康志愿者皮下注射的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)劑量分別為1,2, 4

47、,8 和 16mg m - 2 , AUC 分別為 11,50, 119, 182和 304 g h mL- 1 , C max 分別是 0. 05, 0. 28, 0. 51, 0. 94和 1.89 g mL - 1 , C Is 分別為 234, 135, 104, 88和 100mL h1 m -2。皮下注射755Ch inese Journal of New Drugs 2002, V ol. 11 N o. 10中國(guó)新藥雜志 2002 年第 11 卷第10期后C max常出現(xiàn)在d3 d4。t 1/ 2范圍是84 171h。藥物分布至全身 器官包括：骨、肺、肝、脾和腎。劑量為1,2,

48、 4和8 mg m ,表現(xiàn)出依賴于劑量的 CIs減低在8mg m - 2達(dá)到最低值；在8和16mg m - 2之間差異無(wú)顯著性。由于受 試者數(shù)目很少，目前不能得 到C Is和劑量相互關(guān)系的確定結(jié)論。注射部位吸收的相對(duì)程度的變化可能是減低表觀清除率所致。3. 6. 3 RA患者的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù) 正常人單劑 量靜注16mg m - 2 - 2的模型分析比化學(xué)藥物更加復(fù)雜，可能會(huì)涉及模型 不容易描述其特征的非線性過(guò)程并造成不易預(yù)測(cè)的后果。給藥途徑也是重要變量，皮下給藥有可能被皮下注射部位的蛋白水解酶部分代謝。目前正在積極研究各種新給藥途徑。為了優(yōu)化給藥方案設(shè)計(jì)，深入了解影響蛋白多肽類藥物分析和藥代動(dòng)

49、 力學(xué)的各種因素是極其重要的。作者簡(jiǎn)介湯仲明（1930-,男,研究員，博士生導(dǎo) 師。研究方向?yàn)榭馆椛渌幬锼幚?、分子藥理、藥代?dòng)力學(xué)，近年來(lái) 從事生物技術(shù)藥物藥理和藥物代謝研究。聯(lián)系 電話：（010 66931230, E mail: tang- zhong- ming hotmail. co m。 1,活動(dòng)性RA患者中單劑量皮下-2注射16或25mg m 的藥代動(dòng)力 學(xué)參數(shù)：AU C分別為267, 80和296 g h mL - 1 ,全身總清除率C ls分 別為 100, 69 和 45mL h 1 m - 2 , C m ax 分別是 6. 3,參考文獻(xiàn)0. 4 和 1.2 g mL- 1 , t 1/ 2分別是41, 102和171h。3. 6. 4生物利用度研究 正常志愿者中給予冷凍 干燥 藥物，皮下和靜脈分別給予10mg （ n = 6。AUC分別是82和139 g h mL - 1 , T m ax分別是66和0. 8h, t 1/ 2分別是92和72h,皮下注射的生物利用 度是58%。 4蛋白多肽藥代動(dòng)力學(xué)的特點(diǎn) EL ISA分析法目前已成為 最常用的臨床 藥代動(dòng)力學(xué)測(cè)定方法。本文強(qiáng)調(diào)了選擇免疫藥盒的原則和重要性。在新蛋白多肽臨床研究前開(kāi)發(fā)階段，需注意盡