質(zhì)粒DNA提取及定量定性分析PPT課件

1、膠融！外溢膠融！外溢非特異性！非特異性！第1頁/共18頁質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA的提取的提取及其定性定量分析及其定性定量分析 第2頁/共18頁主要內(nèi)容主要內(nèi)容一、質(zhì)粒一、質(zhì)粒DNADNA提取提取二、瓊脂糖電泳鑒定及半定量二、瓊脂糖電泳鑒定及半定量三、紫外吸收定量及純度檢測三、紫外吸收定量及純度檢測第3頁/共18頁基本原理基本原理結(jié)構(gòu)差別結(jié)構(gòu)差別分子量差別分子量差別變性復(fù)性變性復(fù)性SDS堿裂解堿裂解第4頁/共18頁堿變性堿變性一、質(zhì)粒一、質(zhì)粒DNADNA的提取流的提取流 程程接含接含pETBlue-2pETBlue-2質(zhì)粒的單菌落于質(zhì)粒的單菌落于4mL LB 4mL LB 羧芐羧芐（50ug/mL

2、50ug/mL ）和四環(huán)素（）和四環(huán)素（12.5ug/mL12.5ug/mL）液體培養(yǎng)基）液體培養(yǎng)基中中37370 0C C，190rpm190rpm振蕩培養(yǎng)過夜振蕩培養(yǎng)過夜4000rpm4000rpm、離心、離心1min1min，收集所有菌體，收集所有菌體150uL150uL溶液溶液I I懸浮菌體（旋渦混勻），室溫懸浮菌體（旋渦混勻），室溫10min10min加入加入200uL200uL溶液溶液IIII（輕輕混勻（輕輕混勻! !），室溫靜置菌液裂解），室溫靜置菌液裂解變清變清 接菌接菌培養(yǎng)培養(yǎng)收菌收菌堿裂解堿裂解第5頁/共18頁加入加入200uL200uL溶液溶液IIIIII（輕輕混勻輕輕混

3、勻! !），冰上靜置），冰上靜置15min15min質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA復(fù)性復(fù)性12000rpm12000rpm，離心，離心10min10min上清加上清加等體積等體積的酚：氯仿：異戊醇（的酚：氯仿：異戊醇（旋渦混勻旋渦混勻）12000rpm12000rpm，離心，離心5min5min上清加上清加等體積等體積的氯仿：異戊醇（的氯仿：異戊醇（旋渦混勻旋渦混勻）12000rpm12000rpm，離心，離心5min5min復(fù)性回收復(fù)性回收純化純化第6頁/共18頁上清加上清加2 2倍體積的無水乙醇（倍體積的無水乙醇（旋渦混勻旋渦混勻），室溫），室溫 30min30min12000rpm12000rpm

4、，離心，離心10min10min沉淀用沉淀用75%75%乙醇乙醇1mL1mL洗滌兩次（洗滌兩次（振蕩混勻、離心振蕩混勻、離心）12000rpm12000rpm，離心，離心5min5min沉淀于超凈臺中風(fēng)干沉淀于超凈臺中風(fēng)干（5min5min20min20min）沉淀加入沉淀加入20uL RTE20uL RTE，60600 0C C水浴水浴3030分鐘溶解分鐘溶解-20-200 0C C保存保存醇沉回收醇沉回收溶解溶解保存保存離心離心標(biāo)識標(biāo)識第7頁/共18頁堿裂解堿裂解溶液溶液冰浴冰浴pH 8.0pH 8.0劇烈振蕩劇烈振蕩10 min10 min溶液粘稠混濁溶液粘稠混濁第8頁/共18頁堿裂解堿

5、裂解溶液溶液現(xiàn)用現(xiàn)配現(xiàn)用現(xiàn)配切勿振蕩！顛倒混勻切勿振蕩！顛倒混勻T 5minT 5minSDSSDS包被包被 ！第9頁/共18頁復(fù)性回收復(fù)性回收溶液溶液冰上預(yù)冷冰上預(yù)冷切勿振蕩！顛倒混勻切勿振蕩！顛倒混勻15min15min僅質(zhì)粒復(fù)性？在哪相？僅質(zhì)粒復(fù)性？在哪相？ ！第10頁/共18頁制制 膠：膠：1%1%瓊脂糖（瓊脂糖（30 mL/30 mL/組組，1xTAE)1xTAE)緩沖液：緩沖液：1xTAE1xTAE，300 mL/300 mL/兩組兩組制制 樣：質(zhì)粒樣：質(zhì)粒DNA 2L DNA 2L 10 xloading 0.5L 10 xloading 0.5L TAE 2.5L TAE 2.

6、5LMarkerMarker：5L5L電電 泳：恒壓泳：恒壓8080伏，結(jié)束后成像保存伏，結(jié)束后成像保存結(jié)果分析：鑒定（定性，純度）；半定結(jié)果分析：鑒定（定性，純度）；半定量量二、質(zhì)粒DNA的電泳第11頁/共18頁測定流程：測定流程：3L3L質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA 297L TE 297L TE緩沖液緩沖液雙波長檢測：雙波長檢測：定量：定量：C=ODC=OD260260* *5050* *稀釋倍數(shù)（稀釋倍數(shù)（g/mL g/mL ）純度指標(biāo)：純度指標(biāo)：三、質(zhì)粒DNA的紫外吸收檢測260nm260nm核酸核酸280nm280nm蛋白蛋白 OD OD260260/OD/OD280280比值范圍：比值范

7、圍：1.81.82.02.0污染成分：蛋白污染成分：蛋白, ,酚酚 質(zhì)粒質(zhì)粒DNA RNADNA RNA混勻混勻第12頁/共18頁下次實驗的簡介與準(zhǔn)備下次實驗的簡介與準(zhǔn)備第13頁/共18頁DNA DNA 重重 組組酶切和連接酶切和連接第14頁/共18頁預(yù)習(xí)：在實驗中如何進(jìn)行對照？預(yù)習(xí)：在實驗中如何進(jìn)行對照？思考：工程菌的常用種類及用途？思考：工程菌的常用種類及用途？ 質(zhì)粒的種類及特性？質(zhì)粒的種類及特性？ 分子生物學(xué)中常用的內(nèi)切酶？連接酶？分子生物學(xué)中常用的內(nèi)切酶？連接酶？ 抗生素種類？為什么應(yīng)用抗生素？抗生素種類？為什么應(yīng)用抗生素？滅菌：滅菌：1mL1mL、200L200L、 10L10L槍頭各一盒槍頭各