最新定量PCR基本原理及方法

1、定量定量pcr基本原理及方法基本原理及方法基因有限公司基因有限公司 黃妤黃妤一一 熒光定量熒光定量pcr基本原理基本原理二二 熒光定量熒光定量pcr標(biāo)記方法標(biāo)記方法三三 熒光定量熒光定量pcr不同方法學(xué)的應(yīng)用不同方法學(xué)的應(yīng)用內(nèi)容內(nèi)容 定量定量pcr技術(shù)的產(chǎn)生技術(shù)的產(chǎn)生1992年由higuchi等人第一次報(bào)告：使用eb加入pcr反應(yīng)體系，經(jīng)改裝的帶有冷ccd的pcr儀檢測(cè)樣品的熒光強(qiáng)度核酸 染料熒光后來用與雙鏈dna有更強(qiáng)結(jié)合力的sybr green i取代eb一一熒光定量熒光定量pcr基本原理基本原理real-time chemistriespcr的理論方程：的理論方程：y=x(1+ ev)n

2、 y：擴(kuò)增物數(shù)量； x ：起始模板數(shù)量；ev：擴(kuò)增效率；n：擴(kuò)增循環(huán)數(shù)1. 終點(diǎn)法定量原理終點(diǎn)法定量原理前提：在最佳實(shí)驗(yàn)、循環(huán)次數(shù)n一定、ev相同原理：根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的量計(jì)數(shù)反應(yīng)物中原始分子數(shù)，即：lnx=lny-nln(1+ev)=lny - b (b為常數(shù))2. 實(shí)時(shí)檢測(cè)法定量原理實(shí)時(shí)檢測(cè)法定量原理前提：在最佳實(shí)驗(yàn)、相同ev以、擴(kuò)增產(chǎn)物量相同原理：反應(yīng)物中原始分子數(shù)（x）與其所需要的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)（n）成反比，由此計(jì)算出標(biāo)本中靶分子的準(zhǔn)確含量，即：lgx=lgynlg(1+ev)=b - na (a、b為常數(shù)) 熒光定量熒光定量pcr的定量原理的定量原理閾值閾值：pcr擴(kuò)增信號(hào)進(jìn)入相對(duì)穩(wěn)定的對(duì)

3、數(shù)增長(zhǎng)期時(shí)的熒光值。閾值（閾值（threshold）的設(shè)定）的設(shè)定pcr efficiency=10(-1/slope)-1where slope=1/mslope -3.322100%efficiencypcr循環(huán)在到達(dá)ct值所在的循環(huán)數(shù)時(shí)，剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴(kuò)增期（對(duì)數(shù)期），此時(shí)微小誤差尚未放大，因此ct值的重現(xiàn)性極好，即同一模板不同時(shí)間擴(kuò)增或同一時(shí)間不同管內(nèi)擴(kuò)增，得到的ct值是恒定的。ct值值n：擴(kuò)增循環(huán)數(shù)：擴(kuò)增循環(huán)數(shù) n: 擴(kuò)增循環(huán)數(shù)擴(kuò)增循環(huán)數(shù)的確定的確定logn=log n0 +nloge n=ct每個(gè)模板的ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品作出

4、標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)未知樣品的ct值，即可計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)。 ct值值與起始模板的關(guān)系與起始模板的關(guān)系y軸ct值x起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)準(zhǔn)曲線 由系列稀釋的已知濃度的樣品做標(biāo)準(zhǔn)曲線 計(jì)算待測(cè)樣品的初始模板濃度log n0 =-ct loge+logn 絕對(duì)定量絕對(duì)定量未知濃度的樣品與標(biāo)準(zhǔn)曲線相比較未知濃度的樣品與標(biāo)準(zhǔn)曲線相比較 內(nèi)摻式染料內(nèi)摻式染料 sybr green i, lc green 序列特異性探針序列特異性探針 taqman molecular beacons fret 引物特異性探針引物特異性探針amplifluor (intergen) lux二二熒光定量熒光定量 pcr

5、 標(biāo)記方法標(biāo)記方法5353sgexcitationsgsgsgsgemission 5353sgsgsgsgsgexcitationemission rq53535353excitationrqqrqrexcitationrqexcitationrqqrexcitationemissionoligo 1: fluoresceinoligo 2: lc red 640excitationemissiontransfer三三熒光定量熒光定量pcr不同方法學(xué)的應(yīng)用不同方法學(xué)的應(yīng)用 研究目的研究目的 標(biāo)記方法標(biāo)記方法 定量分析（基因拷貝數(shù)的絕對(duì)定量，基因表達(dá)調(diào)控的相對(duì)定量）定量分析（基因拷貝數(shù)的絕對(duì)定

6、量，基因表達(dá)調(diào)控的相對(duì)定量） sybr-green (lc green), taqman, molecular beacon, etc 研究目的研究目的 基因型分析（基因型分析（snp、突變型分析）、突變型分析） taqman, molecular beacon, fret, lc green 熔解曲線分析熔解曲線分析 sybr-green, lc green, molecular beacon, fret某科研用戶使用rotor-gene 3000進(jìn)行基因表達(dá)檢測(cè)結(jié)果 （自備標(biāo)準(zhǔn)品，檢測(cè)樣品做復(fù)管） 絕對(duì)定量絕對(duì)定量某科研用戶使用rotor-gene 3000進(jìn)行基因表達(dá)相對(duì)定量分析，下圖為

7、用ct法得出的分析結(jié)果 。（自備標(biāo)準(zhǔn)品，檢測(cè)樣品做3次重復(fù)復(fù)管）housekeeper genegene of interest 相對(duì)定量相對(duì)定量利用溶解曲線進(jìn)行實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化（rg3000） 熔解曲線分析熔解曲線分析deg.737475767778798081828384858687888990919293949596979899100df/dt.35.3.25.2.15.1.05bin abin bannealing at 60deg.737475767778798081828384858687888990919293949596979899100df/dt1.21.11.9.8.7.6.

8、5.4.3.2.10bin aannealing at 63 標(biāo)記方法標(biāo)記方法 taqman 定量分析，基因型分析 sybr-green 定量分析，熔解曲線分析，基因型分析 (lc green) molecular beacon 定量分析，熔解曲線分析，基因型分析 fret 定量分析，熔解曲線分析，基因型分析 ampliflour probe，lux 定量分析 基因型分析基因型分析l 利用擴(kuò)增信號(hào)的種類來分型利用擴(kuò)增信號(hào)的種類來分型 taqmanl 根據(jù)熔解曲線的不同來分型根據(jù)熔解曲線的不同來分型 fret, molecular beacon lc green雙taqman探針法檢測(cè)野生型和突

9、變型 在基因型分析中，可采用兩種不同的taqman探針（分別針對(duì)野生型和突變型)，即一個(gè)突變型探針以一種熒光素（flr）標(biāo)記，而野生型探針則用不同的熒光物（tet）標(biāo)記。如果只有一種信號(hào)被擴(kuò)增出來，則樣本為對(duì)應(yīng)的基因型（野生型或突變型）的純合子；如二者都被有效地?cái)U(kuò)增出來，則樣本為雜合型。 利用擴(kuò)增信號(hào)的種類來分型利用擴(kuò)增信號(hào)的種類來分型雜合型野生型突變型 fret探針進(jìn)行熔解曲線分析確定基因型 fret探針與模板結(jié)合時(shí)，因共振能量的傳遞而信號(hào)增強(qiáng)，而當(dāng)在tm 值時(shí)，fret探針與pcr產(chǎn)物分開，熒光信號(hào)減弱。通過實(shí)時(shí)捕捉到的pcr產(chǎn)物在熔解過程中熒光信號(hào)的變化，得到pcr產(chǎn)物的熔解曲線。因?yàn)榘l(fā)生基因突變的pcr產(chǎn)物有特定的tm 值，通過測(cè)定探針與pcr產(chǎn)物分開時(shí)的熔解溫度tm值，就能確定樣品的基因型。 利用熔解曲線檢測(cè)基因突變利用熔解曲線檢測(cè)基因突變雜合型野生型突變型利用內(nèi)摻式染料進(jìn)行高分辨率熔解曲線（hrm）分析基因型hrm根據(jù)序列長(zhǎng)度、gc含量和互補(bǔ)性分析樣品，可精確到單堿基差異。相比其它方法節(jié)約了探針和標(biāo)記的費(fèi)用。上