PCR技術(shù)的原理及應(yīng)用

1、整理課件1PCR技術(shù)的原理及應(yīng)用技術(shù)的原理及應(yīng)用整理課件2PCR技術(shù)簡史DNA的復(fù)制核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35解旋酶解鏈酶DNA解旋解鏈合成引物子鏈延長整理課件3PCR技術(shù)簡史DNA的復(fù)制核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35DNA解旋解鏈合成引物子鏈延長GGAUCG5AUCGCG5引物酶引物酶RNA引物RNA引物整理課件4PCR技術(shù)簡史DNA的復(fù)制核酸體外

2、擴(kuò)增的設(shè)想聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35DNA解旋解鏈合成引物子鏈延長GGAUCG5AUCGCG5TAGCGCTATCGCATCGACGCT3ATAGCGTAGCTGCGAGGATCG3DNA聚合酶DNA聚合酶整理課件5PCR技術(shù)簡史DNA的復(fù)制核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明1971年，Khorana提出：經(jīng)過DNA變性，與合適引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復(fù)該過程便可克隆tRNA基因。但由于測序和引物合成的困難，以及70年代基因工程技術(shù)的發(fā)明使克隆基因成為可能，所以，Kh

3、orana的設(shè)想被人們遺忘了整理課件6PCR技術(shù)簡史DNA的復(fù)制核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明1985年，美國PE-Cetus公司的Mullis等人發(fā)明了聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）基本原理是在試管中模擬細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制最初采用E-coli DNA聚合酶進(jìn)行PCR，由于該酶不耐熱，使這一過程耗時(shí)，費(fèi)力，且易出錯(cuò)耐熱DNA聚合酶的應(yīng)用使得PCR能高效率的進(jìn)行，隨后PE-Cetus公司推出了第一臺(tái)PCR自動(dòng)化熱循環(huán)儀1993年，Mullis等因此項(xiàng)技術(shù)獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)?wù)碚n件7 整理課件8整理課件9整理課件10引物引物整理課件11引物引物引物引物整理課件12XX整理課件13整理課件14()40 5

4、0 60 70 80 90 100100 80 60 40 20整理課件15整理課件16PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)的PCRPCR反應(yīng)體系反應(yīng)體系4種dNTP混合物 各200umol/L引物 各10100pmol模板DNA 0. .12ugTaq DNA聚合酶 2. .5uMg2+ 1. .5mmol/L整理課件171234522557294時(shí)間（min）溫度（）PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)13步2530輪目的DNA片段擴(kuò)增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性DNA變性形成2條單鏈子鏈延伸DN

5、A加倍整理課件18PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)1234522557294時(shí)間（min）溫度（）適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)13步2530輪目的DNA片段擴(kuò)增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性子鏈延伸DNA加倍DNA變性形成2條單鏈模板DNA95整理課件19PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)9550引物1引物2DNA引物整理課件20PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)50引物1引物2DNA引物72Taq酶Taq酶整理課件21PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)72第1輪結(jié)束95第2輪開始整理課件22PCR

6、的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)955072TaqTaqTaqTaq整理課件23PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)72第2輪結(jié)束整理課件24PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)模板DNA第1輪擴(kuò)增第2輪擴(kuò)增第3輪擴(kuò)增第4輪擴(kuò)增第5輪擴(kuò)增第6輪擴(kuò)增整理課件25q 實(shí)時(shí)熒光定量實(shí)時(shí)熒光定量PCRPCR原理原理q 實(shí)時(shí)熒光定量實(shí)時(shí)熒光定量PCRPCR的幾種方法介紹的幾種方法介紹q 實(shí)時(shí)熒光定量實(shí)時(shí)熒光定量PCRPCR在醫(yī)學(xué)和科研中的應(yīng)用在醫(yī)學(xué)和科研中的應(yīng)用提提 綱綱整理課件26 在在PCRPCR反應(yīng)體系中加入反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)熒光基團(tuán)，利用熒光，利

7、用熒光信號(hào)累積信號(hào)累積實(shí)時(shí)監(jiān)測實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)整個(gè)PCRPCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。 實(shí)時(shí)熒光定量實(shí)時(shí)熒光定量PCR定義定義整理課件27常常 規(guī)規(guī) PCRPCR技術(shù)：技術(shù)： 對(duì)對(duì)PCRPCR擴(kuò)增反應(yīng)的擴(kuò)增反應(yīng)的終點(diǎn)產(chǎn)物終點(diǎn)產(chǎn)物進(jìn)行定量和定性分析。進(jìn)行定量和定性分析。無法對(duì)起始模板準(zhǔn)確定量，無法對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)實(shí)時(shí)檢無法對(duì)起始模板準(zhǔn)確定量，無法對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)實(shí)時(shí)檢測。測。實(shí)時(shí)熒光定量實(shí)時(shí)熒光定量PCR PCR 原理原理整理課件28實(shí)時(shí)定量實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)：技術(shù)： 利用利用熒光信號(hào)的變化實(shí)時(shí)檢測熒光信號(hào)的變化實(shí)時(shí)檢測PCR擴(kuò)增反

8、應(yīng)中擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，通過，通過Ct值值和標(biāo)準(zhǔn)曲和標(biāo)準(zhǔn)曲線的分析對(duì)線的分析對(duì)起始模板起始模板進(jìn)行進(jìn)行定量分析。定量分析。 整理課件29如何對(duì)起始模板定量？如何對(duì)起始模板定量？通過通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)值和標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)起始模板起始模板進(jìn)行定量分析進(jìn)行定量分析三個(gè)概念：三個(gè)概念： 擴(kuò)增曲線、熒光閾值、擴(kuò)增曲線、熒光閾值、CtCt值值實(shí)時(shí)熒光定量實(shí)時(shí)熒光定量PCR PCR 原理原理整理課件30整理課件31實(shí)時(shí)熒光定量實(shí)時(shí)熒光定量PCR PCR 原理原理 - - 擴(kuò)增曲線擴(kuò)增曲線擴(kuò)增曲線圖：擴(kuò)增曲線圖： 橫坐標(biāo)：橫坐標(biāo)：擴(kuò)增循環(huán)數(shù)（擴(kuò)增循環(huán)數(shù)（CycleCy

9、cle）；）；縱坐標(biāo)：縱坐標(biāo)：熒光強(qiáng)度熒光強(qiáng)度 每個(gè)循環(huán)進(jìn)行一次熒光信號(hào)的收集每個(gè)循環(huán)進(jìn)行一次熒光信號(hào)的收集熒光基團(tuán)熒光基團(tuán)熒光檢測元件熒光檢測元件整理課件32實(shí)時(shí)熒光定量實(shí)時(shí)熒光定量PCR PCR 原理原理 -熒光閾值熒光閾值熒光信號(hào)閾值熒光信號(hào)閾值 （threshold threshold ）：q 前15個(gè)循環(huán)信號(hào)作為熒光本底信號(hào)（baseline），即樣本的熒光背景值和陰性對(duì)照的熒光值q 熒光域值的缺省設(shè)置是315個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)差的10倍q 手動(dòng) 設(shè)置：原則要大于樣本的熒光背景值和陰性對(duì)照的熒光最高值，同時(shí)要盡量選擇進(jìn)入指數(shù)期的最初階段，并且保證回歸系數(shù)大于0.99q 真正的信號(hào)

10、:熒光信號(hào)超過域值整理課件33實(shí)時(shí)熒光定量實(shí)時(shí)熒光定量PCR PCR 原理原理 -Ct值CtCt值的定義值的定義： PCR擴(kuò)增過程中，擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)過的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)。C(t) value 整理課件34實(shí)時(shí)熒光定量實(shí)時(shí)熒光定量PCR PCR 原理原理 -Ct值的重現(xiàn)性橫軸：橫軸：PCR反映循環(huán)數(shù)反映循環(huán)數(shù)縱軸：熒光信號(hào)量縱軸：熒光信號(hào)量CtCt值的特點(diǎn)值的特點(diǎn)：相同模板進(jìn)行96次擴(kuò)增，終點(diǎn)處產(chǎn)物量不恒定； Ct值則極具重現(xiàn)性整理課件35實(shí)時(shí)熒光定量實(shí)時(shí)熒光定量PCR PCR 原理原理 - - 定量原理定量原理理想的PCR反應(yīng)： X=X0*2n非理想的PCR反應(yīng)： X=X0

11、 (1+Ex)n n：擴(kuò)增反應(yīng)的循環(huán)次數(shù) X：第n次循環(huán)后的產(chǎn)物量 X0：初始模板量 Ex：擴(kuò)增效率整理課件36實(shí)時(shí)熒光定量實(shí)時(shí)熒光定量PCR PCR 原理原理 - - 定量原理定量原理在擴(kuò)增產(chǎn)物達(dá)到閾值線時(shí): XCt=X0 (1+Ex)Ct =M (1) XCt:熒光擴(kuò)增信號(hào)達(dá)到閾值強(qiáng)度時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物的量. 在閾值線設(shè)定以后,它是一個(gè)常數(shù),我們設(shè)為M方程式(1)兩邊同時(shí)取對(duì)數(shù)得: lg M=lg X0 (1+Ex)Ct (2)整理方程式(2)得: lg X0= - Ct lg(1+Ex) + lg M (3) Lg Lg濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，根據(jù)樣品擴(kuò)增達(dá)到濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，根據(jù)樣品擴(kuò)增

12、達(dá)到域值域值的循環(huán)數(shù)即的循環(huán)數(shù)即Ct值就可計(jì)算出樣品中所含的模板量。就可計(jì)算出樣品中所含的模板量。整理課件37實(shí)時(shí)熒光定量實(shí)時(shí)熒光定量PCR PCR 原理原理 - - 標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)準(zhǔn)曲線q 模板DNA量越多，熒光達(dá)到域值的循環(huán)數(shù)越少，即Ct值越小。q Log濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，通過已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品Ct值，就可以計(jì)算出樣品中所含的模板量。整理課件38Sample實(shí)時(shí)熒光定量實(shí)時(shí)熒光定量PCRPCR原理原理 絕對(duì)定量絕對(duì)定量25整理課件39提提 綱綱q 實(shí)時(shí)熒光定量實(shí)時(shí)熒光定量PCRPCR原理原理q 實(shí)時(shí)熒光定量實(shí)時(shí)熒光定量PCRPCR的幾種方法介紹的幾種方法介紹q

13、 實(shí)時(shí)熒光定量實(shí)時(shí)熒光定量PCRPCR實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及應(yīng)用實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及應(yīng)用q 實(shí)時(shí)熒光定量實(shí)時(shí)熒光定量PCRPCR原理原理q 實(shí)時(shí)熒光定量實(shí)時(shí)熒光定量PCRPCR的幾種方法介紹的幾種方法介紹q 實(shí)時(shí)熒光定量實(shí)時(shí)熒光定量PCRPCR實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及應(yīng)用實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及應(yīng)用整理課件40非特異性熒光標(biāo)記：非特異性熒光標(biāo)記： 1、 SYBR Green 特異性熒光標(biāo)記：特異性熒光標(biāo)記： 2、TaqMan 3、Molecular Beacon 4、Amplisensor實(shí)時(shí)熒光定量實(shí)時(shí)熒光定量PCR PCR 原理原理 - DNA - DNA 產(chǎn)物的熒光標(biāo)記產(chǎn)物的熒光標(biāo)記QQR整理課件41實(shí)時(shí)熒光定量實(shí)時(shí)熒光定量PCR PC

14、R 方法方法 1 1 SYBR Green 法整理課件42SYBR Green 法q SYBR Green 能結(jié)合到雙鏈DNA的小溝部位q SYBR Green 只有和雙鏈DNA結(jié)合后才發(fā)熒光q 變性時(shí)，DNA雙鏈分開，無熒光q 復(fù)性和延伸時(shí)，形成雙鏈DNA， SYBR Green 發(fā)熒光，在此階段采集熒光信號(hào)（一般設(shè)置在復(fù)性階段）。SYBR Green 整理課件435353SGNo EmissionSGSGSGExcitationExcitationSGSGSGSGSGSGSG5353EmissionExcitationExcitation整理課件44溫度溫度熒光強(qiáng)度熒光強(qiáng)度Tm整理課件45

15、-dIdTTm整理課件46SYBR Green SYBR Green 法法 融解曲線分析融解曲線分析融解曲線分析，單一峰無非特異性熒光定量準(zhǔn)確融解曲線分析，有雜峰其他產(chǎn)物出現(xiàn)非特異性熒光，因此定量不準(zhǔn)確非特異性產(chǎn)非特異性產(chǎn)物物整理課件47Cycle numberFlourescenc 104 102SampleCycle numberLg of DNA concentrationSYBR Green 法 定量原理q 模板DNA量越多，熒光達(dá)到域值的循環(huán)數(shù)越少。q Lg濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，根據(jù)樣品Ct值，就可以計(jì)算出樣品中所含的模板量。整理課件48SYBR Green 法 -PCR反應(yīng)的建立

16、反應(yīng)體系的建立及優(yōu)化反應(yīng)體系的建立及優(yōu)化: :SYBR Green SYBR Green 使用濃度使用濃度: :太高抑制太高抑制TaqTaq酶活性，太低，熒酶活性，太低，熒光信號(hào)太弱，不易檢測光信號(hào)太弱，不易檢測PrimerPrimer：引物的特異性高，否則擴(kuò)增有雜帶，定量不準(zhǔn)：引物的特異性高，否則擴(kuò)增有雜帶，定量不準(zhǔn)MgClMgCl2 2的濃度的濃度: :可以降低到可以降低到1.5mM,1.5mM,以減少非特異性產(chǎn)物以減少非特異性產(chǎn)物反應(yīng)反應(yīng)Buffer Buffer 體系的優(yōu)化體系的優(yōu)化反應(yīng)溫度和時(shí)間參數(shù)反應(yīng)溫度和時(shí)間參數(shù): :由酶和引物決定由酶和引物決定1. 1.其他與常規(guī)其他與常規(guī)PC

17、RPCR相同相同整理課件49SYBR Green SYBR Green 法法 應(yīng)用范圍應(yīng)用范圍q 起始模板的測定q 基因型的分析q 融解曲線分析：可以優(yōu)化PCR反應(yīng)的條件，對(duì)常規(guī)PCR有指導(dǎo)意義，如對(duì)primer的評(píng)價(jià)；可以區(qū)分單一引物、引物二聚體、變異產(chǎn)物、多種產(chǎn)物。整理課件50SYBR Green SYBR Green 法法 優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)缺點(diǎn) q 對(duì)DNA模板沒有選擇性 -適用于任何DNAq 使用方便 -不必設(shè)計(jì)復(fù)雜探針q 非常靈敏q 便宜優(yōu) 點(diǎn)q 容易與非特異性雙鏈DNA結(jié)合，產(chǎn)生假陽性 但可以通過融解曲線的分析，優(yōu)化反應(yīng)條件q 對(duì)引物特異性要求較高缺 點(diǎn)整理課件51本單位目前開展的工作 多

18、種病原體定量和定性多種病原體定量和定性 細(xì)胞因子檢測（人，小鼠，大鼠等）細(xì)胞因子檢測（人，小鼠，大鼠等） 基因表達(dá)水平檢測基因表達(dá)水平檢測 PCR芯片芯片整理課件52實(shí)時(shí)熒光定量實(shí)時(shí)熒光定量PCR PCR 方法方法2 2 -TaqMan -TaqMan法法整理課件53與目標(biāo)序列互補(bǔ)TaqMan-TaqMan-水解型雜交探針?biāo)庑碗s交探針v 55端標(biāo)記有報(bào)告基團(tuán)端標(biāo)記有報(bào)告基團(tuán)(Reporter, R) (Reporter, R) ，如，如FAMFAM、VICVIC等等 v 33端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán) (Quencher, Q)(Quencher, Q)v 探針完整，探針完整，

19、R R所發(fā)射的熒光能量被所發(fā)射的熒光能量被QQ基團(tuán)吸收基團(tuán)吸收 ，無熒光，無熒光， R R與與QQ分開，發(fā)熒光分開，發(fā)熒光 （熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理，（熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理，F(xiàn)RETFRET）v TaqTaq酶有酶有 5353外切核酸酶活性，可水解探針外切核酸酶活性，可水解探針整理課件54TaqManTaqMan法法 工作原理工作原理每擴(kuò)增一條DNA分子，釋放一個(gè)熒光信號(hào)，可以在循環(huán)過程中任一點(diǎn)檢測熒光整理課件55TaqMan TaqMan 法法 PCRPCR反應(yīng)的建立反應(yīng)的建立1 1、引物、探針的設(shè)計(jì)：、引物、探針的設(shè)計(jì)： 探針探針TmTm為為68-70 68-70 ，30 bp, 530 b

20、p, 5不能有不能有G G，G G可能會(huì)淬滅熒光素，可能會(huì)淬滅熒光素， 引物盡量靠近探針，擴(kuò)增片段引物盡量靠近探針，擴(kuò)增片段400 bp400 bp，引物，引物TmTm為為59-60 59-60 2 2、反應(yīng)參數(shù)的確定：、反應(yīng)參數(shù)的確定： 一般為：一般為：94 94 ，10-20S10-20S 60 60，30-60S30-60S（TaqTaq酶酶5353外切核酸酶活性在外切核酸酶活性在60 60 最高）最高） 也可通過溫度梯度優(yōu)化退火溫度也可通過溫度梯度優(yōu)化退火溫度 72 72 ，45 S45 S，3 3、優(yōu)化引物和探針濃度：獲得最小、優(yōu)化引物和探針濃度：獲得最小CtCt值，最大信號(hào)值，最大

21、信號(hào)/ /背景比值背景比值 引物濃度：引物濃度：50-900nM50-900nM 探針濃度：探針濃度：50-250nM50-250nM4 4、其他與常規(guī)、其他與常規(guī)PCRPCR相同相同整理課件56已肝病人血液中已肝病人血液中HBVHBV的絕對(duì)定量的絕對(duì)定量q目的：利用核酸檢測，縮短檢驗(yàn)時(shí)間，提高靈敏度，為診斷用藥提供依據(jù)目的：利用核酸檢測，縮短檢驗(yàn)時(shí)間，提高靈敏度，為診斷用藥提供依據(jù)q方法：從血液中提取病毒方法：從血液中提取病毒DNADNA，擴(kuò)增病毒基因，以，擴(kuò)增病毒基因，以TaqManTaqMan探針進(jìn)行檢測探針進(jìn)行檢測q設(shè)置對(duì)照：濃度為設(shè)置對(duì)照：濃度為10106 6、10105 5 、10

22、104 4 、10103 3 的標(biāo)準(zhǔn)樣品各一個(gè)，設(shè)陰性和空白的標(biāo)準(zhǔn)樣品各一個(gè)，設(shè)陰性和空白對(duì)照對(duì)照q實(shí)驗(yàn)步驟：提取實(shí)驗(yàn)步驟：提取HBV DNAHBV DNA 設(shè)計(jì)特異引物設(shè)計(jì)特異引物 設(shè)計(jì)設(shè)計(jì)TaqManTaqMan探針并標(biāo)記探針探針并標(biāo)記探針 擴(kuò)增程序擴(kuò)增程序q結(jié)果：獲取血液樣品中結(jié)果：獲取血液樣品中HBV DNAHBV DNA的精確的精確copycopy數(shù)數(shù)利用利用TaqManTaqMan法法 檢測血液中的檢測血液中的HBVHBV整理課件57數(shù)據(jù)分析分析結(jié)果： HBV DNA的精確copy數(shù)為 3.7X105利用利用TaqManTaqMan法法 檢測血液中的檢測血液中的HBVHBVsamp

23、lesample整理課件58TaqManTaqMan法法 應(yīng)用范圍應(yīng)用范圍q 起始模板的定量q 基因型分析q 產(chǎn)物鑒定q 單核苷酸多態(tài)性分析 (single nucleotide polymorphism ， SNP)整理課件59TaqManTaqMan法法 優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)缺點(diǎn)q 對(duì)目標(biāo)序列的高特異性 -陰性結(jié)果確定q 設(shè)計(jì)相對(duì)簡單 -與目標(biāo)序列某一區(qū)域互補(bǔ)q重復(fù)性比較好優(yōu) 點(diǎn)q 只適合一個(gè)特定的目標(biāo)q 委托公司標(biāo)記，價(jià)格較高q 不易找到本底低的探針缺 點(diǎn)整理課件60實(shí)時(shí)熒光定量實(shí)時(shí)熒光定量PCR PCR 方法方法 3 3 - Molecular beacon - Molecular beacon

24、法法( (分子信標(biāo)分子信標(biāo)) )整理課件61標(biāo)記熒光的發(fā)夾探針 環(huán)與目標(biāo)序列互補(bǔ)莖由互補(bǔ)配對(duì)序列組成環(huán)莖熒光素 淬滅劑發(fā)夾型雜交探針發(fā)夾型雜交探針整理課件62Molecular beacon (Molecular beacon (分子信標(biāo)分子信標(biāo)) ) 工作原理工作原理q 熒光共振能量轉(zhuǎn)移（熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRETFRET）q 探針與探針與DNADNA雜交時(shí)產(chǎn)生熒光雜交時(shí)產(chǎn)生熒光 -延伸過程：不產(chǎn)生熒光延伸過程：不產(chǎn)生熒光 -退火過程：產(chǎn)生特異性熒光，檢測熒光退火過程：產(chǎn)生特異性熒光，檢測熒光信號(hào)信號(hào)整理課件63Molecular beacon (Molecular beacon (分子信標(biāo)

25、分子信標(biāo)) ) 應(yīng)用范圍應(yīng)用范圍 q 起始模板的定量q 基因型分析q 產(chǎn)物鑒定q SNP分析整理課件64Molecular beacon (Molecular beacon (分子信標(biāo)分子信標(biāo)) ) 優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)缺點(diǎn)q高特異性：高特異性：對(duì)目標(biāo)序列 檢測SNP最靈敏的試劑之一q熒光背景低熒光背景低優(yōu) 點(diǎn)q 只能用于一個(gè)特定目標(biāo)q 設(shè)計(jì)困難q 價(jià)格比較高缺 點(diǎn)整理課件65幾種方法總結(jié)幾種方法總結(jié)化學(xué)試劑化學(xué)試劑工作原理工作原理有否淬滅劑有否淬滅劑信號(hào)檢測信號(hào)檢測主要應(yīng)用范主要應(yīng)用范圍圍SYBR Green I結(jié)合于雙鏈結(jié)合于雙鏈DNADNA的小溝中的小溝中否否復(fù)性復(fù)性/ /延伸延伸熔解曲線分析熔解曲

26、線分析定量和檢測目標(biāo)定量和檢測目標(biāo)基因基因Molecular Beacon發(fā)夾型雜交探針發(fā)夾型雜交探針有有復(fù)性復(fù)性SNPSNP分析分析定量和檢測目標(biāo)定量和檢測目標(biāo)基因基因TaqMan水解型雜交探針?biāo)庑碗s交探針（5-35-3外切）外切）有有任何步驟任何步驟SNPSNP分析分析定量和檢測目標(biāo)定量和檢測目標(biāo)基因基因整理課件66實(shí)時(shí)熒光定量實(shí)時(shí)熒光定量PCR的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)處理的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)處理絕對(duì)定量與相對(duì)定量絕對(duì)定量與相對(duì)定量整理課件67絕對(duì)定量與相對(duì)定量絕對(duì)定量與相對(duì)定量 絕對(duì)定量：精確的計(jì)算初始反應(yīng)的模板絕對(duì)定量：精確的計(jì)算初始反應(yīng)的模板濃度（濃度（DNA，RNA）病毒病毒DNA或或RNA

27、的拷貝數(shù)的拷貝數(shù)轉(zhuǎn)基因的拷貝數(shù)轉(zhuǎn)基因的拷貝數(shù) 相對(duì)定量：計(jì)算初始反應(yīng)模板的相對(duì)含相對(duì)定量：計(jì)算初始反應(yīng)模板的相對(duì)含量量差異表達(dá)分析差異表達(dá)分析芯片評(píng)估芯片評(píng)估轉(zhuǎn)基因生物的檢測轉(zhuǎn)基因生物的檢測基因型檢測基因型檢測整理課件68實(shí)時(shí)熒光實(shí)時(shí)熒光PCR絕對(duì)定量方法絕對(duì)定量方法unknown104103標(biāo)準(zhǔn)品，標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)準(zhǔn)品，標(biāo)準(zhǔn)曲線已知濃度的相應(yīng)已知濃度的相應(yīng)DNA模板，按不同濃度稀釋模板，按不同濃度稀釋根據(jù)實(shí)時(shí)根據(jù)實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)得到相應(yīng)的反應(yīng)得到相應(yīng)的C(t)，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線線樣品樣品與標(biāo)準(zhǔn)品同時(shí)進(jìn)行與標(biāo)準(zhǔn)品同時(shí)進(jìn)行PCR反應(yīng)得到未知濃度樣品的反應(yīng)得到未知濃度樣品的C(t)值值整理課件69

28、使用實(shí)時(shí)熒光定量使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR進(jìn)行絕對(duì)定量的優(yōu)勢進(jìn)行絕對(duì)定量的優(yōu)勢 敏感性高敏感性高 檢測低拷貝數(shù)樣品：單拷貝檢測低拷貝數(shù)樣品：單拷貝 區(qū)分小差異樣品：區(qū)分小差異樣品：24，48，96， 大范圍拷貝數(shù)樣品同時(shí)檢測大范圍拷貝數(shù)樣品同時(shí)檢測 100 1010 省時(shí)有效省時(shí)有效整理課件70實(shí)時(shí)熒光相對(duì)定量實(shí)時(shí)熒光相對(duì)定量 相對(duì)定量的相對(duì)定量的目的目的比較基因在不同情況下的表達(dá)差異（倍數(shù)關(guān)系）比較基因在不同情況下的表達(dá)差異（倍數(shù)關(guān)系） 相對(duì)定量的問題相對(duì)定量的問題解決樣品材料不均一造成的差別解決樣品材料不均一造成的差別解決加樣過程中的差別解決加樣過程中的差別 內(nèi)標(biāo)基因內(nèi)標(biāo)基因內(nèi)標(biāo)通常是內(nèi)標(biāo)通常

29、是b-actin、GAPDH基因等看家基因基因等看家基因它們在細(xì)胞中的表達(dá)量或在基因組中的拷貝數(shù)恒它們在細(xì)胞中的表達(dá)量或在基因組中的拷貝數(shù)恒定，受環(huán)境因素影響較小定，受環(huán)境因素影響較小對(duì)目的基因進(jìn)行均一化：目的基因拷貝每一個(gè)對(duì)目的基因進(jìn)行均一化：目的基因拷貝每一個(gè)內(nèi)標(biāo)基因拷貝內(nèi)標(biāo)基因拷貝整理課件71提提 綱綱q 實(shí)時(shí)熒光定量實(shí)時(shí)熒光定量PCRPCR原理原理q 實(shí)時(shí)熒光定量實(shí)時(shí)熒光定量PCRPCR的幾種方法介紹的幾種方法介紹q 實(shí)時(shí)熒光定量實(shí)時(shí)熒光定量PCRPCR實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及應(yīng)用實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及應(yīng)用整理課件72實(shí)時(shí)熒光定量實(shí)時(shí)熒光定量PCRPCR法法 標(biāo)準(zhǔn)樣品標(biāo)準(zhǔn)樣品相對(duì)定量中的內(nèi)標(biāo)相對(duì)定量中的內(nèi)標(biāo) 內(nèi)

30、標(biāo)通常是內(nèi)標(biāo)通常是-actin、GAPDH基因等看家基因基因等看家基因 在細(xì)胞中的表達(dá)量或在基因組中的拷貝數(shù)恒定，受環(huán)境因素在細(xì)胞中的表達(dá)量或在基因組中的拷貝數(shù)恒定，受環(huán)境因素影響小影響小內(nèi)標(biāo)定量結(jié)果代表了樣本中所含細(xì)胞或基因組數(shù)量內(nèi)標(biāo)定量結(jié)果代表了樣本中所含細(xì)胞或基因組數(shù)量絕對(duì)定量的標(biāo)準(zhǔn)樣品：絕對(duì)定量的標(biāo)準(zhǔn)樣品： 已知拷貝數(shù)的質(zhì)粒已知拷貝數(shù)的質(zhì)粒DNADNA和體外轉(zhuǎn)錄的和體外轉(zhuǎn)錄的RNA RNA 整理課件73實(shí)時(shí)熒光定量實(shí)時(shí)熒光定量PCRPCR法法標(biāo)準(zhǔn)樣品標(biāo)準(zhǔn)樣品用于生成標(biāo)準(zhǔn)曲線的樣品如何設(shè)定？用于生成標(biāo)準(zhǔn)曲線的樣品如何設(shè)定？含有和待測樣品相同擴(kuò)增片段的克隆質(zhì)粒含有和待測樣品相同擴(kuò)增片段的克

31、隆質(zhì)粒含有和待測樣品相同擴(kuò)增片段的含有和待測樣品相同擴(kuò)增片段的cDNAcDNA紫外分光光度計(jì)或熒光酶標(biāo)測定濃度紫外分光光度計(jì)或熒光酶標(biāo)測定濃度根據(jù)質(zhì)?；蚋鶕?jù)質(zhì)?；騝DNAcDNA分子量換算成拷貝數(shù)，做系列稀釋分子量換算成拷貝數(shù)，做系列稀釋整理課件74實(shí)時(shí)熒光定量實(shí)時(shí)熒光定量PCRPCR法法 定量方法定量方法q 絕對(duì)定量檢測起始模板數(shù)的精確拷貝數(shù)，通常用到標(biāo)準(zhǔn)絕對(duì)定量檢測起始模板數(shù)的精確拷貝數(shù)，通常用到標(biāo)準(zhǔn)曲線曲線q 相對(duì)定量確定經(jīng)過不同處理的樣本目標(biāo)轉(zhuǎn)錄本之間基因相對(duì)定量確定經(jīng)過不同處理的樣本目標(biāo)轉(zhuǎn)錄本之間基因的表達(dá)差異（不同時(shí)相）的表達(dá)差異（不同時(shí)相）v 2 2- -C C（t t）v 雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法整理課件75 TaqManTaqMan法舉例法舉例 標(biāo)記探針標(biāo)記探針使用 TaqMan 探針進(jìn)行雙通道熒光定量