細(xì)胞的凍存及復(fù)蘇

1、細(xì)胞凍存與復(fù)蘇細(xì)胞的凍存和復(fù)蘇細(xì)胞的凍存和復(fù)蘇1.1.細(xì)胞凍存細(xì)胞凍存 細(xì)胞凍存與細(xì)胞傳代保存相比優(yōu)勢在于：一，可以減少人力、經(jīng)費投入，減少污染，減少細(xì)胞生物學(xué)特性變化；二，有利于保存那些不立即使用的細(xì)胞系或者將細(xì)胞系轉(zhuǎn)給其他使用者。1.1.細(xì)胞凍存細(xì)胞凍存 目前，動物細(xì)胞一般保存于液氮（-196）。細(xì)胞的凍存和復(fù)蘇細(xì)胞的凍存和復(fù)蘇2.2.細(xì)胞復(fù)蘇細(xì)胞復(fù)蘇 在體外培養(yǎng)工作中，常要將體外培養(yǎng)物進(jìn)行冷凍保存，在需要時再復(fù)溫融解進(jìn)行體外培養(yǎng)（復(fù)蘇）。細(xì)胞的凍存和復(fù)蘇細(xì)胞的凍存和復(fù)蘇為使細(xì)胞復(fù)蘇時存活率最高最佳的凍存條件： 盡可能地降低細(xì)胞內(nèi)的晶體形成，減小細(xì)胞內(nèi)水凝固所形成的高濃度溶質(zhì)對細(xì)胞造成的損

2、傷。A) 緩慢冷凍B) 用親水的低溫保護(hù)劑排除水分C)在盡可能低的溫度保存細(xì)胞D)快速復(fù)蘇細(xì)胞凍存與復(fù)蘇的原理細(xì)胞凍存與復(fù)蘇的原理 要獲得好的凍存與復(fù)蘇效果，必須了解如下幾個問題：冷凍速率、復(fù)蘇速率、冷凍保護(hù)劑，冷凍保存溫度。 細(xì)胞凍存與復(fù)蘇的關(guān)鍵因素細(xì)胞凍存與復(fù)蘇的關(guān)鍵因素冷凍速率：降溫的速度，直接關(guān)系到冷凍效果，對一種細(xì)胞進(jìn)行冷凍保存之前，首先需要測定其最適冷凍速率，以保證獲得最高的冷凍存活率。 細(xì)胞凍存與復(fù)蘇的關(guān)鍵因素細(xì)胞凍存與復(fù)蘇的關(guān)鍵因素冷凍速率冷凍速率細(xì)胞凍存與復(fù)蘇的關(guān)鍵因素細(xì)胞凍存與復(fù)蘇的關(guān)鍵因素不同的冷凍速率使細(xì)胞內(nèi)發(fā)生不同的生理變化，也可以產(chǎn)生不同的損傷。冷凍速度過慢時，細(xì)胞

3、脫水嚴(yán)重，超過一定程度時即失去活性。同時引起細(xì)胞外溶液部分結(jié)冰，未結(jié)冰的溶液中溶質(zhì)濃度增高產(chǎn)生溶質(zhì)損傷。當(dāng)冷凍速度過快時，細(xì)胞內(nèi)水分來不及外滲，會形成冰晶，造成細(xì)胞膜及細(xì)胞器的破壞，產(chǎn)生細(xì)胞內(nèi)冰晶損傷。 冷凍速率冷凍速率復(fù)蘇速率：在細(xì)胞復(fù)蘇時溫度升高的速度。復(fù)溫速率不當(dāng)也會降低凍存細(xì)胞存活率。一般來說，復(fù)溫速度越快越好，速度過慢，細(xì)胞內(nèi)往往重新形成較大冰晶而造成細(xì)胞損傷。復(fù)溫時造成的細(xì)胞損傷非?？?，往往在極短的時間內(nèi)發(fā)生。細(xì)胞凍存與復(fù)蘇的關(guān)鍵因素細(xì)胞凍存與復(fù)蘇的關(guān)鍵因素復(fù)蘇速率復(fù)蘇速率冷凍保護(hù)劑：可以保護(hù)細(xì)胞免受冷凍損傷的物質(zhì)分為滲透性和非滲透性兩類。不同的冷凍保護(hù)劑有不同的優(yōu)、缺點。目前一般

4、多聯(lián)合使用兩種以上冷凍保護(hù)劑組成保護(hù)液。冷凍保護(hù)劑冷凍保護(hù)劑細(xì)胞凍存與復(fù)蘇的關(guān)鍵因素細(xì)胞凍存與復(fù)蘇的關(guān)鍵因素冷凍保存溫度：能長期保存細(xì)胞的超低溫度，在此溫度下，細(xì)胞生化反應(yīng)極其緩慢甚至停止，但經(jīng)過長期保存，在復(fù)蘇后仍能保持正常的結(jié)構(gòu)和功能。液氮溫度（-196）是 目前最佳的冷凍保存溫度。保存溫度保存溫度細(xì)胞凍存與復(fù)蘇的關(guān)鍵因素細(xì)胞凍存與復(fù)蘇的關(guān)鍵因素冷凍速率冷凍速率：慢凍慢凍復(fù)蘇速率復(fù)蘇速率：快融快融冷凍保護(hù)劑冷凍保護(hù)劑：滲透性和非滲透性滲透性和非滲透性冷凍保存溫度冷凍保存溫度：196 196 （液氮）（液氮）冷凍保存方法冷凍保存方法1非玻璃化冷凍 非玻璃化凍存是利用各種溫級的冰箱分階段降溫至

5、-70 -80 ，然后直接投入液氮進(jìn)行保存；或者是利用電子計算機(jī)程控降溫儀以及利用液氮的氣、液，按一定的降溫速率從室溫降至-1000C以下，再直接投入液氮保存的方法該種方法凍結(jié)的細(xì)胞懸液或多或少都有冰晶的形成冷凍保存方法冷凍保存方法 2玻璃化冷凍玻璃化凍存則是指利用多種高濃度的冷凍保護(hù)劑聯(lián)合形成的玻璃化冷凍保護(hù)液保護(hù)懸浮細(xì)胞，直接投入液氮進(jìn)行凍存的方法。以該種方法凍結(jié)的細(xì)胞懸液沒有冰晶的形成。玻璃化凍存法對細(xì)胞活性的保存具有較好的效果，不需要復(fù)雜的儀器設(shè)備，具有液氮儲存設(shè)備即可使用。目前，該方法已在胚胎冷凍方面得到廣泛應(yīng)用，但很少應(yīng)用于一般細(xì)胞的凍存。細(xì)胞復(fù)蘇細(xì)胞復(fù)蘇方法方法 1、液氮中取出冷凍管2738水浴