華東理工 基因工程 PPT學習教案

1、會計學1華東理工華東理工 基因工程基因工程 針對不同的產(chǎn)物表達形式采取不同的策略 采用分泌型戰(zhàn)略表達重組蛋白，通常體積大、濃度低，因此應(yīng)在純化之前采用沉淀或超濾等方法先進行濃縮處理； 采用包涵體型戰(zhàn)略表達重組蛋白，應(yīng)先離心回收包涵體； 采用融合型戰(zhàn)略表達重組蛋白，一般是胞內(nèi)可溶性的，擬首先選用親和層析進行純化 表達在細胞膜和細胞壁之間的間隙中的蛋白質(zhì)，應(yīng)用低濃度的溶菌酶處理，然后再用滲透壓休克法釋放重組蛋白。第1頁/共57頁針對不同性質(zhì)的重組蛋白選擇不同的層析類型 等電點處于極端區(qū)域（pI5 或 pI8）的重組蛋白應(yīng)首選離子交換法進行分離，這樣很容易除去幾乎所有的雜蛋白； 重組蛋白特異性的配體

2、、底物、抗體、糖鏈等都是首選親合層析純化方法的重要條件，原則是它們與目標蛋白之間的解離常數(shù)應(yīng)在合適的范圍內(nèi)（10-8- 10-4 mol / L）； 疏水層析和反相層析是根據(jù)蛋白質(zhì)的疏水性差異進行分離的； 凝膠過濾層析是根據(jù)蛋白的分子量和體積差異進行分離的； 徑向?qū)游鍪墙陙戆l(fā)展起來的集層析分離和膜分離于一體的一種復(fù)合技術(shù)，在流量、負荷量等參數(shù)方面顯示出極大的優(yōu)越性。第2頁/共57頁多種分離純化技術(shù)的聯(lián)合運用 在進行重組蛋白的純化時，通常需要綜合使用多種技術(shù)，一般來說，在選擇分離純化方法時應(yīng)遵循下列原則：應(yīng)選擇不同分離純化機理的方法聯(lián)合使用應(yīng)首先選擇能除去含量最多雜質(zhì)的方法應(yīng)盡量選擇高效的分離

3、方法應(yīng)將最費時、成本最高的分離純化方法安排在最后階段第3頁/共57頁合適分離純化介質(zhì)的選擇 常用的蛋白質(zhì)分離純化介質(zhì)有Sephadex和Seperose。理想的分離純化介質(zhì)應(yīng)具有下列性質(zhì)：對目標蛋白具有較高的分離效率對目標蛋白不會造成變性化學性能和機械性能穩(wěn)定，重復(fù)性好價格低廉第4頁/共57頁分離純化過程的規(guī)?；?蛋白質(zhì)分離純化的實驗室工藝、技術(shù)、方法在大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化過程未必合適，如：實驗室方法在工程上可能難以實現(xiàn)（超聲波破細胞壁）實驗室方法在大規(guī)模生產(chǎn)中可能成本過高（超速離心） 因此，在很多情況下，實驗室的技術(shù)路線不等于生產(chǎn)工藝。第5頁/共57頁10 外源基因表達產(chǎn)物的分離純化離子交換層析的基

4、本原理離子交換介質(zhì)的基本性質(zhì)離子交換層析的基本操作離子交換介質(zhì)的選擇原則第6頁/共57頁離子交換層析的基本原理 離子交換層析是以離子交換劑為固定相，以特定的含離子溶液為流動相，利用離子交換劑對待分離的各種離子結(jié)合力的差異，而將混合物中不同離子進行分離的層析技術(shù)。第7頁/共57頁離子交換介質(zhì)的基本性質(zhì) 離子交換劑亦稱離子交換介質(zhì)，通常是一種不溶性高分子化合物如樹脂，纖維素，葡聚糖，醇脂糖等； 離子交換劑中所含的可解離基團在水溶液中能與溶液中的其它陽離子交換劑的基本性能離子或陰離子起交換作用 如果有兩種以上的成分被吸附在離子交換劑上，則在用洗脫液洗脫時，各成分被洗脫的可能性取決于各自反應(yīng)的平衡常數(shù)

5、 吸附在離子交換劑上的蛋白質(zhì)可通過改變pH使吸附的蛋白質(zhì)失去電荷而解離下來 不同蛋白質(zhì)與離子交換劑之間形成離子鍵數(shù)目不同，即親和力大小有差異，因此只要選擇適當?shù)南疵摋l件便可將混合物中的成分逐個洗脫下來，達到分離純化的目的第8頁/共57頁離子交換介質(zhì)的基本性質(zhì) 陰離子交換劑：強堿型和弱堿型可電離的基團磺酸基（-SO3H）離子交換劑的分類磷酸基（-PO3H2）羧酸基（-COOH）酚羥基（-OH） 陽離子交換劑：強酸型和弱酸型可電離的基團伯胺基（-NH2）仲胺基（-NHCH3 ）叔胺基（-N(CH3)2）季胺基（-N+(CH3) 3 ）第9頁/共57頁離子交換介質(zhì)的基本性質(zhì)離子交換劑的分類強離子交換

6、劑的電離率基本不受pH值影響，離子交換作用的pH范圍寬弱離子交換劑的電離率受pH影響很大，離子交換作用的pH范圍小弱酸性陽離子交換劑在pH值降低時，其電離率逐漸降低，離子交換能力逐漸減弱弱堿性陰離子交換劑在pH值升高時，其電離率逐漸降低，離子交換能力逐漸減弱第10頁/共57頁離子交換介質(zhì)的基本性質(zhì)常用的離子交換劑離子交換樹脂： 最常見的離子交換樹脂是含有酸性或堿性基團的人工合成的聚苯乙烯-二乙烯苯不溶性高分子化合物 離子交換樹脂的優(yōu)點是：流速快，對小分子物質(zhì)的交換容量大，因而適合用于氨基酸、核苷酸等小分子生化物質(zhì)的分離純化第11頁/共57頁離子交換介質(zhì)的基本性質(zhì)常用的離子交換劑離子交換纖維素：

7、 離子交換纖維素是攜帶功能基團纖維素衍生物，具有松散的親水性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)以及較大的表面積，大分子可以自由通過，因而對生物大分子（如蛋白質(zhì)）的交換容量比離子交換樹脂大 陽離子型離子交換纖維素包括羥甲基纖維素（CM纖維素）等維素） 陰離子型離子交換纖維素包括二乙基氨基乙基纖維素（DEAE纖第12頁/共57頁離子交換介質(zhì)的基本性質(zhì)常用的離子交換劑離子交換葡聚糖： 離子交換葡聚糖是葡聚糖經(jīng)環(huán)氧氯丙烷交聯(lián)后形成的具有多孔三維空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和離子交換功能基團的多糖衍生物（Sephadex G）Sephadex的優(yōu)點如下： 親水性強、不會引起生物分子的變性和失活，母鏈對蛋白質(zhì)、核酸及其它生物分子的非特異性吸附能力

8、小 電離基團在母體上取代程度高，交換容量大，裝柱方便，流速快 既有離子交換作用，又有分子篩效應(yīng) 因而Sephadex是一類廣泛應(yīng)用的色譜分離介質(zhì)第13頁/共57頁離子交換介質(zhì)的基本性質(zhì)常用的離子交換劑離子交換葡聚糖： 常用的離子交換葡聚糖包括： 陽離子交換劑CM-Sephadex C-25，CM-Sephadex C-50Sephadex C-25，Sephadex C-50 陰離子交換劑DEAE-Sephadex A-25，DEAE-Sephadex A-50QAE-Sephadex A-25，QAE-Sephadex A-50 第14頁/共57頁離子交換介質(zhì)的基本性質(zhì)常用的離子交換劑離子交

9、換瓊脂糖： 離子交換瓊脂糖是攜帶DEAE或CM基團的Sepharose CL-6B DEAE-Sepharose（陰離子型）和CM-Sepharose（陽離子型）尤其是介質(zhì)受pH和離子強度的影響所引起的膨脹和收縮效應(yīng)較小，因的離子交換介質(zhì)具有硬度大、性質(zhì)穩(wěn)定，流速好，分離能力強等優(yōu)點此具有穩(wěn)定的外形體積第15頁/共57頁離子交換介質(zhì)的選擇原則一般而言：酸性物質(zhì)用陰離子交換劑分離氨基酸、核苷酸、蛋白質(zhì)等兩性電解質(zhì)，可根據(jù)其pI值及離子化堿性物質(zhì)用陽離子交換劑分離曲線來選擇第16頁/共57頁離子交換介質(zhì)的選擇原則12346789105pH+-蛋白質(zhì)凈電荷等電點吸附陰離子交換劑吸附陽離子交換劑pH

10、pI（-）對pI=5的某酸性蛋白質(zhì)在pH5.5-9.0的范圍內(nèi)，當?shù)鞍踪|(zhì)為陰離子時，應(yīng)首選DEAE纖維素；在pH3.5-4.5的范圍內(nèi)，當?shù)鞍踪|(zhì)為陽離子時，應(yīng)首選CM纖維素第17頁/共57頁離子交換層析的基本操作層析柱平衡平衡緩沖液的用量至少為柱體積的 2 倍平衡緩沖液的流速可略高于正常操作流速平衡終點以流出液的離子濃度、導(dǎo)電性、pH值與緩沖液一致 為準，其中pH值最重要第18頁/共57頁離子交換層析的基本操作樣品進柱為了達到滿意的分離效果，進樣量一般為介質(zhì)交換容量的10-20%為了避免進樣溶液中的離子強度過高，樣品濃度不宜太高交換容量：離子交換劑中全部可交換的離子或功能基團的總數(shù)第19頁/共

11、57頁離子交換層析的基本操作樣品洗脫恒定洗脫階段洗脫梯度洗脫102030405060708090分子濃度離子強度pH值第20頁/共57頁10 外源基因表達產(chǎn)物的分離純化凝膠層析的基本原理凝膠介質(zhì)的基本性質(zhì)凝膠層析的基本操作凝膠介質(zhì)的選用原則第21頁/共57頁凝膠層析的基本原理 凝膠層析是利用有一定孔徑范圍的多孔凝膠作為固定相，對混合物中各組份按分子大小進行分離的層析技術(shù)，又稱為分子篩 分子直徑比凝膠最大孔隙直徑大的，會被全部排阻在凝膠顆粒之外，即全排阻；兩種全排阻的分子即使大小不同，也不能分開；它們下行速度快 分子直徑比凝膠最小孔隙直徑小的，能進入凝膠顆粒的全部孔隙即使大小不同也不能分開；它們

12、的下行速度慢 鑒于上述原理，凝膠層析可用于重組蛋白溶液脫鹽、分子量測定以及分離純化。第22頁/共57頁凝膠介質(zhì)的基本性質(zhì) 葡聚糖凝膠的種類有G10、G15、G25、G50、G75、G100、G150、G200，G50即表示每克干凝膠的吸水量為5.0毫升 葡聚糖凝膠對堿比較穩(wěn)定，在酸性環(huán)境中其糖苷鍵易水解 濕態(tài)的葡聚糖可加熱到110，干的則能耐受120高溫葡聚糖凝膠（ Sephadex ） Sephadex LH是羥丙基化的Sephadex，這類層析介質(zhì)的流動相既可使用緩沖水溶液，也可使用極性有機溶劑，因此適用于非水溶性溶 質(zhì)的凝膠過濾 第23頁/共57頁凝膠介質(zhì)的基本性質(zhì) 瓊脂糖凝膠是由瓊脂中

13、分離出來的天然凝膠，常見的有Sepharose（ Sepharose 2B、4B、6B，數(shù)字代表干膠的百分比 ）和Bio-Gel-A等（Bio-Gel-A 0.5M、1.5M、5M、15M、50M、150M，數(shù)字X106代表排阻限度。瓊脂糖凝膠 當溫度高于50時瓊脂糖凝膠便融化，只能在較低的溫度下使用。 瓊脂糖凝膠是一種大孔凝膠，因而適合于分離分子量較大的生物大分子物質(zhì)（如蛋白質(zhì)和DNA）。 Sepharose CL是二溴丙醇交聯(lián)的瓊脂糖，其孔徑大小和分離范圍與普通瓊脂糖一樣，但熱和化學穩(wěn)定性增加，能高溫消毒。第24頁/共57頁凝膠介質(zhì)的基本性質(zhì) 聚丙烯酰胺凝膠是一種以丙烯酰胺為單位由甲叉雙丙

14、烯酰胺交聯(lián)而成的人工合成凝膠，控制交聯(lián)劑的用量可制成各種型號的凝膠，交聯(lián)劑越多，孔隙越小。 聚丙烯酰胺凝膠的商品名為Bio-Gel，型號從P-2至P-300共10種聚丙烯酰胺凝膠（ 數(shù)字X1000就相當于該凝膠的排阻限度）第25頁/共57頁凝膠介質(zhì)的選用原則 將樣品中的大分子物質(zhì)與小分子物質(zhì)分開，稱為組別分離，其分離策略是使高分子物質(zhì)完全被排阻，小分子物質(zhì)完全滲入凝膠內(nèi)。 組別分離一般選用Sephadex G-25或G-50，對于小肽和低分子量的物質(zhì)（分子量范圍1000-5000）的脫鹽可選用Sephadex G-10、G-組別分離15、Bio-Gel P-2或P-4第26頁/共57頁凝膠介質(zhì)

15、的選用原則 將樣品中一些分子量比較接近的物質(zhì)分開，這種分離叫分級分離該策略是使高分子物質(zhì)完全被排阻，小分子物質(zhì)完全滲入凝膠內(nèi)。 分級分離一般選用排阻限度略大于樣品中最高分子量物質(zhì)的凝膠在層析過程中，樣品中各組份均能不同程度地深入到凝膠內(nèi)部，但由分級分離于深入凝膠空隙程度上的差異，最后得到分離。第27頁/共57頁凝膠層析的基本操作平衡溶液的流速應(yīng)低于層析時需要的流速注意凝膠的斷層和氣泡層析柱平衡操作壓控制平衡和洗脫時應(yīng)維持流速恒定恒定的操作壓是恒流的先決條件第28頁/共57頁凝膠層析的基本操作上柱樣品溶液的體積根據(jù)分離要求來確定：進樣體積進行組別分離時，樣品溶液最大可為柱體積的10%進行分級分離

16、時，樣品溶液的體積要小，使樣品層盡可能窄，這樣洗脫出的峰形好第29頁/共57頁10 外源基因表達產(chǎn)物的分離純化親和層析的基本概念親和層析載體的性質(zhì)與選擇親和層析配基的性質(zhì)與選擇親和層析的基本操作第30頁/共57頁親和層析的基本概念 親和層析是利用待分離物質(zhì)與其特異性配體之間特異性的親和力進行分離的一類特殊的層析技術(shù)，它有如下特點：純化過程簡單、迅速，且分離效率高特別適用于分離純化一些含量低、穩(wěn)定性差的生物大分子親和層析的基本特點純化倍數(shù)大，產(chǎn)物純度高必須針對某一分離對象制備專一的配基及尋求穩(wěn)定的層析條件因此應(yīng)用范圍受到一定的限制第31頁/共57頁親和層析的基本概念抗原與抗體DNA與互補DNA或

17、RNA（cDNA、mRNA)酶與其底物、競爭性抑制劑、輔酶因子激素或藥物與其受體具有特異性親和作用的生物分子維生素于其特異性結(jié)合蛋白糖蛋白與其相應(yīng)的植物凝集素第32頁/共57頁親和層析的基本概念親和的一對分子中的一方以共價鍵形式與不溶性載體相連作為固定相吸附劑當含有混合組份的樣品（流動相）通過此固定相時，只有和固定相分子有特異親和力的物質(zhì)，才能被固定相吸附結(jié)親和層析的基本原理合，其它沒有親和力的無關(guān)組份就隨流動相流出然后改變流動組成份，將結(jié)合的親和物洗脫下來第33頁/共57頁親和層析載體的性質(zhì)與選擇具有多孔的立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，能使被親和吸附的大分子自由通過具有良好機械性能的均勻珠狀顆粒，具有良好的

18、流速親和層析載體的選擇具有惰性，盡量減少非專一性吸附具有相當量的易活化的基團，在溫和的條件下能與配基共價合偶聯(lián)在偶聯(lián)、吸附和洗脫時，有較好的物理化學穩(wěn)定性第34頁/共57頁親和層析載體的性質(zhì)與選擇纖維素葡聚糖凝膠 常用的親和層析載體瓊脂糖凝膠 聚丙烯酰胺凝膠其它新型載體 第35頁/共57頁親和層析配基的性質(zhì)與選擇純化對象和配基之間必須有較強的親和力但親和力太高也是有害的，因為在解離配基復(fù)合物時所需的親和層析配基的選擇條件就要強烈，這樣可能使生物分子變性配基必須具有適當?shù)幕瘜W基團，這種基團不參與配基與生物分子之間特異結(jié)合，但可用于和載體相連，同時又不影響配基與生物分子之間的親和力第36頁/共57

19、頁親和層析配基的性質(zhì)與選擇酸酐法N-取代羥基琥珀酰亞胺法配基的偶聯(lián)疊氮化作用還原性烷基化合物（西夫堿）的形成第37頁/共57頁親和層析的基本操作通常采用改變pH、離子強度、離子種類或者溫度等使與固定配泛的是改變?nèi)芤旱碾x子強度。非專一性洗脫化的配基對相應(yīng)的生物大分子的親和力降低基結(jié)合的生物大分子的構(gòu)象發(fā)生變化，降低其親和力，但使用較廣非專一性洗脫劑的作用并不是使被吸附的生物大分子的構(gòu)象發(fā)生變化，而是洗脫劑中的某一組分與固定配基形成復(fù)合物，使固定第38頁/共57頁親和層析的基本操作使用特異的配基作為洗脫劑 溶液為洗脫劑，通過與親和配基或目標產(chǎn)物的競爭性結(jié)合來洗專一性洗脫使用含有與親和配基或目標產(chǎn)物

20、具有親和作用的小分子化合物 脫目標產(chǎn)物第39頁/共57頁親和層析的基本操作 親和雙方吸附能力很強，可以用專一的化學方法裂解配基與載性洗脫法也是一種非特異性洗脫方法特殊性洗脫體的連接鍵，獲得的配基-蛋白絡(luò)合物后，再除去配基。實際上特殊第40頁/共57頁10 外源基因表達產(chǎn)物的分離純化膜分離的基本原理分離膜的主要性能影響膜分離的因素第41頁/共57頁膜分離的基本原理 膜分離是利用膜的選擇性，以膜的兩側(cè)存在一定量的能量差作為化，它是一種物質(zhì)被透過或被截留的過程，近似于篩分過程，依據(jù)濾膜分離的基本定義推動力，由于溶液中各組分透過膜的遷移速率不同而實現(xiàn)的分離。 膜分離是利用具有一定選擇性透過特性的介質(zhì)進

21、行物質(zhì)的分離純膜孔徑和物質(zhì)粒子的大小而達到物質(zhì)分離的目的第42頁/共57頁膜分離的基本原理分子級別的分離過程，分離效率高膜分離的特點不涉及相變，能耗低，運行成本低膜分離為單純物理變化，無二次污染第43頁/共57頁膜分離的基本原理分離膜的選擇通透性：是物質(zhì)分離的第一機制膜分離過程的重要參數(shù)膜分離過程的推動力：靜壓力差、濃度差、電位差物質(zhì)通過分離膜的速度：是物質(zhì)分離的第二機制第44頁/共57頁膜分離的基本原理 根據(jù)分離膜膜內(nèi)平均孔徑、推動力和傳遞機制不同，膜分離可膜分離的主要類型反滲透（Reverse osmosis RO）透析（Dialysis DS）分成下列幾類：超濾（Uitrfiltrati

22、on UF）微濾（Microfitration MF）電滲析（Electrodialysis EI）第45頁/共57頁膜分離的基本原理透析（Dialysis DS）膜分離的主要類型 透析過程使用一種只透過溶劑而不透過溶質(zhì)的膜，一般稱為理 當把溶劑和溶液（或把兩種不同濃度的溶液）分別置于此兩側(cè)想的半透膜時，純?nèi)軇⒆匀淮┻^半透膜而自發(fā)地向溶液（或從低濃度向高濃度）一側(cè)流動，這種現(xiàn)象叫滲透第46頁/共57頁膜分離的基本原理反滲透（Reverse osmosis RO）膜分離的主要類型 反滲透其主要原理是在高于溶液滲透壓的作用下，使其它物質(zhì)溶解鹽類、膠體、微生物、熱源、有機物等，因而主要用于海水、不

23、能透過半透膜，而將這些物質(zhì)與水分離開來，有效地去除水中的苦咸水淡化和產(chǎn)純水制備等方面第47頁/共57頁膜分離的基本原理超濾（Uitrfiltration UF）膜分離的主要類型 超濾是一種根據(jù)高分子溶質(zhì)之間或高分子與小分子溶質(zhì)之間相相應(yīng)的截留分子量范圍從500到100萬左右。對分子質(zhì)量的差別進行分離的方法。篩分孔徑范圍1 nm - 0.1 mm，第48頁/共57頁分離膜的基本性能 分離膜是膜分離技術(shù)的核心，分離膜的性能主要包括分離透過性、耐酸堿性、抗氧化性、抗微生物降解性、親水性、疏水性、電性能和化學物理性能兩部分。其中，化學物理性能主要涉及到耐熱性能、毒性、機械強度等。膜的化學物理性能第49頁/共57頁分離膜的基本性能微濾膜0.025 - 14 mm反滲透膜0.0001 - 0.001 mm超濾膜0.001 - 0.02 mm納米過濾膜平均孔徑 2 nm膜的分類按膜的孔徑大小分類：第50頁/共57頁分離膜的基本性能對稱性膜膜截面上的孔道結(jié)構(gòu)均勻不對稱性膜由表面活性層（超薄層）和惰性層（支撐層）構(gòu)成膜