多肽合成基礎(chǔ)知識匯編

1、深圳市翰宇生物工程有限公司培訓(xùn)教材一HC-1多肽合成基礎(chǔ)知識匯編編制： 合成部、多肽合成概論1 多肽化學(xué)合成概述：1963年，R.B.Merrifield : 1創(chuàng)立了將氨基酸的 C末端固定在不溶性樹脂上，然后在此樹脂上依次 縮合氨基酸，延長肽鏈、合成蛋白質(zhì)的固相合成法，在固相法中，每步反應(yīng)后只需簡單地洗滌樹脂，便可 達(dá)到純化目的.克服了經(jīng)典液相合成法中的每一步產(chǎn)物都需純化的困難，為自動化合成肽奠定了基礎(chǔ).為此，Merrifield 獲得1984年諾貝爾化學(xué)獎.今天，固相法得到了很大發(fā)展.除了 Merrifield所建立的Boc法（Boc:叔丁氧羰基）之外，又發(fā)展了 Fmoc 固相法（Fmoc

2、:9-芴甲氧羰基）.以這兩種方法為基礎(chǔ)的各種肽自動合成儀也相繼出現(xiàn)和發(fā)展，并仍在不斷得 到改造和完善.Merrifield所建立的Boc合成法2是采用TFA（三氟乙酸）可脫除的Boc為a-氨基保護(hù)基，側(cè)鏈保 護(hù)采用芐醇類.合成時將一個Boc 氨基酸衍生物共價交聯(lián)到樹脂上，用TFA脫除Boc，用三乙胺中和游離的氨基末端，然后通過 Dcc活化、耦聯(lián)下一個氨基酸，最終脫保護(hù)多采用HF法或TFMSA（三氟甲磺酸）法.用Boc法已成功地合成了許多生物大分子，如活性酶、生長因子、人工蛋白等多肽是涉及生物體內(nèi)各種細(xì)胞功能的生物活性物質(zhì)。它是分子結(jié)構(gòu)介于氨基酸和蛋白質(zhì)之間的一類化合物,由多種氨基酸按照一定的排

3、列順序通過肽鍵結(jié)合而成。到現(xiàn)在，人們已發(fā)現(xiàn)和分離岀一百多種存在于人 體的肽，對于多肽的研究和利用，岀現(xiàn)了一個空前的繁榮景象。多肽的全合成不僅具有很重要的理論意義， 而且具有重要的應(yīng)用價值。通過多肽全合成可以驗證一個新的多肽的結(jié)構(gòu)；設(shè)計新的多肽，用于研究結(jié)構(gòu) 與功能的關(guān)系；為多肽生物合成反應(yīng)機(jī)制提供重要信息；建立模型酶以及合成新的多肽藥物等。多肽的化學(xué)合成技術(shù)無論是液相法還是固相法都已成熟。近幾十年來，固相法合成多肽更以其省時、省力、省料、便于計算機(jī)控制、便于普及推廣的突岀優(yōu)勢而成為肽合成的常規(guī)方法并擴(kuò)展到核苷酸合成等 其它有機(jī)物領(lǐng)域。本文概述了固相合成的基本原理、實驗過程，對其現(xiàn)狀進(jìn)行分析并展

4、望了今后的發(fā)展趨 勢。從1963年Merrifield發(fā)展成功了固相多肽合成方法以來，經(jīng)過不斷的改進(jìn)和完善， 到今天固相法已成為多肽和蛋白質(zhì)合成中的一個常用技術(shù)，表現(xiàn)岀了經(jīng)典液相合成法無法比擬的優(yōu)點。其基本原理是：先 將所要合成肽鏈的羥末端氨基酸的羥基以共價鍵的結(jié)構(gòu)同一個不溶性的高分子樹脂相連，然后以此結(jié)合在 固相載體上的氨基酸作為氨基組份經(jīng)過脫去氨基保護(hù)基并同過量的活化羧基組分反應(yīng)，接長肽鏈。重復(fù)（縮合-洗滌-去保護(hù)-中和及洗滌-下一輪縮合）操作，達(dá)到所要合成的肽鏈長度，最后將肽鏈從樹脂上裂 解下來，經(jīng)過純化等處理，即得所要的多肽。其中a-氨基用BOC （叔丁氧羰基）保護(hù)的稱為 BOC固相合

5、成法，a -氨基用FMOC （ 9-芴甲氧羰基）保護(hù)的稱為 FMOC固相合成法，2 .固相合成的基本原理多肽合成是一個重復(fù)添加氨基酸的過程，固相合成順序一般從C端（羧基端）向 N端（氨基端）合成。過去的多肽合成是在溶液中進(jìn)行的稱為液相合成法。現(xiàn)在多采用固相合成法，從而大大的減輕了每步產(chǎn)品提純的難度。為了防止副反應(yīng)的發(fā)生，參加反應(yīng)的氨基酸的側(cè)鏈都是保護(hù)的。羧基端是游離的，并且在反應(yīng)之前必須活化。 化學(xué)合成方法有兩種， 即Fmoc和tBoc。由于Fmoc比tBoc存在很多優(yōu)勢，現(xiàn)在大多采用Fmoc法合成，如圖：Raw NilCHC00 -Cil- CCXJ- CHr -<3> Fmur

6、 i逼慕服-i艱cOSII-tll -OX) - CH：OCHi<4)i具體合成由下列幾個循環(huán)組成：一、 去保護(hù)：Fmoc保護(hù)的柱子和單體必須用一種堿性溶劑（ piperidine ）去 除氨基的保護(hù)基團(tuán)。二、激活和交聯(lián)：下一個氨基酸的羧基被一種活化劑所活化。活化的單體與游離的氨基反應(yīng)交聯(lián)，形成肽鍵。在此步驟使用大量的超濃度試劑驅(qū)使反應(yīng)完成。循環(huán)：這兩步反應(yīng)反復(fù)循環(huán)直到合成完成。三、 洗脫和脫保護(hù)：多肽從柱上洗脫下來，其保護(hù)基團(tuán)被一種脫保護(hù)劑（TFA）洗脫和脫保護(hù)。2.1樹脂的選擇及氨基酸的固定將固相合成與其他技術(shù)分開來的最主要的特征是固相載體，能用于多肽合成的固相載體必須滿足如下要求：

7、必須包含反應(yīng)位點（或反應(yīng)基團(tuán)），以使肽鏈連在這些位點上，并在以后除去；必須對合成過程中 的物理和化學(xué)條件穩(wěn)定；載體必須允許在不斷增長的肽鏈和試劑之間快速的、不受阻礙的接觸；另外，載 體必須允許提供足夠的連接點，以使每單位體積的載體給岀有用產(chǎn)量的肽，并且必須盡量減少被載體束縛 的肽鏈之間的相互作用。用于固相法合成多肽的高分子載體主要有三類：聚苯乙烯-苯二乙烯交聯(lián)樹脂、聚丙烯酰胺、聚乙烯-乙二醇類樹脂及衍生物，這些樹脂只有導(dǎo)入反應(yīng)基團(tuán)，才能直接連上（第一個）氨基酸。 根據(jù)所導(dǎo)入反應(yīng)基團(tuán)的不同，又把這些樹脂及樹脂衍生物分為氯甲基樹脂、羧基樹脂、氨基樹脂或酰肼型 樹脂。BOC合成法通常選擇氯甲基樹脂，

8、如 Merrifield樹脂；FMOC合成法通常選擇羧基樹脂如王氏樹脂。氨基酸的固定主要是通過保護(hù)氨基酸的羧基同樹脂的反應(yīng)基團(tuán)之間形成的共價鍵來實現(xiàn)的，形成共價 鍵的方法有多種：氯甲基樹脂，通常先制得保護(hù)氨基酸的四甲銨鹽或鈉鹽、鉀鹽、銫鹽，然后在適當(dāng)溫度 下，直接同樹脂反應(yīng)或在合適的有機(jī)溶劑如二氧六環(huán)、DMF或DMSO中反應(yīng)；羧基樹脂，則通常加入適當(dāng)?shù)目s合劑如DCC或羧基二咪唑，使被保護(hù)氨基酸與樹脂形成共酯以完成氨基酸的固定；氨基樹脂或酰 肼型樹脂，卻是加入適當(dāng)?shù)目s合劑如DCC后，通過保護(hù)氨基酸與樹脂之間形成的酰胺鍵來完成氨基酸的固定。氨基、羧基、側(cè)鏈的保護(hù)及脫除要成功合成具有特定的氨基酸順序

9、的多肽，需要對暫不參與形成酰胺鍵的氨基和羧基加以保護(hù)，同時對氨基酸側(cè)鏈上的活性基因也要保護(hù)，反應(yīng)完成后再將保護(hù)基因除去。同液相合成一樣，固相合成中多采 用烷氧羰基類型作為a氨基的保護(hù)基，因為這樣不易發(fā)生消旋。最早是用芐氧羰基，由于它需要較強(qiáng)的酸 解條件才能脫除，所以后來改為叔丁氧羰基（BOC ）保護(hù)，用TFA （三氟乙酸）脫保護(hù)，但不適用含有色氨酸等對酸不穩(wěn)定的肽類的合成。1978年，chang Meienlofer 和Atherton 等人采用Carpino 報道的Fmoc（9-芴甲氧羰基）作為a氨基保護(hù)基，F(xiàn)moc基對酸很穩(wěn)定，但能用哌啶-CH2CL2或哌啶-DMF脫去， 近年來，F(xiàn)moc

10、合成法得到了廣泛的應(yīng)用。羧基通常用形成酯基的方法進(jìn)行保護(hù)。甲酯和乙酯是逐步合成 中保護(hù)羧基的常用方法，可通過皂化除去或轉(zhuǎn)變?yōu)殡乱员阌糜谄瑪嘟M合；叔丁酯在酸性條件下除去；芐酯 常用催化氫化除去。對于合成含有半胱氨酸、組氨酸、精氨酸等帶側(cè)鏈功能基的氨基酸的肽來說，為了避 免由于側(cè)鏈功能團(tuán)所帶來的副反應(yīng)，一般也需要用適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)基將側(cè)鏈基團(tuán)暫時保護(hù)起來。保護(hù)基的選擇 既要保證側(cè)鏈基團(tuán)不參與形成酰胺的反應(yīng)，又要保證在肽合成過程中不受破壞，同時又要保證在最后肽鏈 裂解時能被除去。如用三苯甲基保護(hù)半胱氨酸的S-，用酸或銀鹽、汞鹽除去；組氨酸的咪唑環(huán)用2,2,2-三氟-1-芐氧羰基和2,2,2-三氟-1-叔丁

11、氧羰基乙基保護(hù)，可通過催化氫化或冷的三氟乙酸脫去。精氨酸用金剛 烷氧羰基（Adoc ）保護(hù)，用冷的三氟乙酸脫去。固相中的接肽反應(yīng)原理與液相中的基本一致，將兩個相應(yīng)的氨基被保護(hù)的及羧基被保護(hù)的氨基酸放在溶液內(nèi)并不形成肽鍵，要形成酰胺鍵，經(jīng)常用的手段是將羧基活化，變成混合酸酐、活潑酯、酰氯或用強(qiáng)的失去劑（如碳二亞氨）形成對稱酸酐等方法來形成酰胺鍵。其中選用DCC、HOBT或HOBT/DCC 的對稱酸酐法、活化酯法接肽應(yīng)用最廣。裂解及合成肽鏈的純化BOC法用TFA+HF裂解和脫側(cè)鏈保護(hù)基，F(xiàn)MOC法直接用TFA，有時根據(jù)條件不同，其它堿、光解、氟離子和氫解等脫保護(hù)方法也被采用。合成肽鏈進(jìn)一步的精制、

12、分離與純化通常 采用高效液相色譜、親和層析、毛細(xì)管電泳等。4 .固相合成的特點及存在的主要問題固相合成法對于肽合成的顯著的優(yōu)點：簡化并加速了多步驟的合成；因反應(yīng)在一簡單反應(yīng)器皿中便可 進(jìn)行，可避免因手工操作和物料重復(fù)轉(zhuǎn)移而產(chǎn)生的損失；固相載體共價相聯(lián)的肽鏈處于適宜的物理狀態(tài)， 可通過快速的抽濾、洗滌未完成中間的純化，避免了液相肽合成中冗長的重結(jié)晶或分柱步驟，可避免中間體分離純化時大量的損失；使用過量反應(yīng)物，迫使個別反應(yīng)完全，以便最終產(chǎn)物得到高產(chǎn)率；增加溶劑化，減少中間的產(chǎn)物聚焦；固相載體上肽鏈和輕度交聯(lián)的聚合鏈緊密相混，彼此產(chǎn)生一種相互的溶劑效應(yīng)，這 對肽自聚集熱力學(xué)不利而對反應(yīng)適宜。固相合成

13、的主要存在問題是固相載體上中間體雜肽無法分離，這樣 造成最終產(chǎn)物的純度不如液相合成物，必需通過可靠的分離手段純化。5 固相合成的研究發(fā)展前景固相多肽合成已經(jīng)有40年的歷史了，然而到現(xiàn)在，人們還只能合成一些較短的肽鏈，更談不上隨心所欲地合成蛋白質(zhì)了，同時合成中的試劑毒性，昂貴費(fèi)用，副產(chǎn)物等一直都是令人頭痛的問題，而在生物體 內(nèi)，核糖體上合成肽鏈的速度和產(chǎn)率都是驚人的，那么，是否能從生物體合成蛋白質(zhì)的原理上得到一些啟 發(fā)，應(yīng)用在固相多肽合成（樹脂）上，這是一個令人感興趣的問題，也許是今后多肽合成的發(fā)展。在Boc合成法中，反復(fù)地用酸來脫保護(hù)，這種處理帶來了一些問題：如在肽與樹脂的接頭處，當(dāng)每次用50

14、%TFA脫Boc基時，有約1.4%的肽從樹脂上脫落，合成的肽越大，這樣的丟失越嚴(yán)重；此外，酸催 化會引起側(cè)鏈的一些副反應(yīng).Boc合成法尤其不適于合成含有色氨酸等對酸不穩(wěn)定的肽類.1978年，Chang、Meienlofer 和Atherton 等人采用Carpino 3報道的Fmoc（9-芴甲氧羰基）基團(tuán)作為a-氨基 保護(hù)基，成功地進(jìn)行了多肽的 Fmoc固相合成.Fmoc法與Boc法的根本區(qū)別在于采用了堿可脫除的Fmoc為a-氨基的保護(hù)基.側(cè)鏈的保護(hù)采用TFA可脫除的叔丁氧基等，樹脂采用90%TFA可切除的對烷氧芐醇型樹脂和1%TFA可切除的二烷氧芐醇型樹脂，最終的脫保護(hù)避免了強(qiáng)酸處理.6.

15、HPLC分析和純化分析HPLC使用柱子和泵系統(tǒng)，可以經(jīng)受傳遞高壓，這樣可以用極細(xì)的微粒（3-10卩m ）做填料。由此多肽要在幾分鐘內(nèi)高度被分析。HPLC分兩類：離子交換和反相。離子交換HPLC依靠多肽和固相間的直接電荷相互作用。柱子在一定PH范圍帶有特定電荷衍變成一種離子體，而多肽或多肽混合物，由其氨基酸組成表現(xiàn)岀相反電荷。分離是一種電荷相互作用，通過可變PH，離子強(qiáng)度， 或兩者洗脫岀多肽，通常，先用低離子強(qiáng)度的溶液，以后逐漸加強(qiáng)或一步一步加強(qiáng)，直到多肽火柱中洗脫岀。離子交換分離的一個例子使用強(qiáng)陽離子交換柱。如sulfoethylaspartimide通過酸性 PH中帶正電來分離。反相HPLC

16、條件與正常層析正相反。多肽通過疏水作用連到柱上，用降低離子強(qiáng)度洗脫，如增加洗脫劑的疏水性。通常柱子由共價吸附到硅上的碳?xì)渫殒湗?gòu)成，這種鏈長度為G4-G8碳原子。由于洗脫是一種疏水作用。大的疏水肽用短鏈柱洗脫好。然而，總體實踐中，這兩類柱互變無多少顯著差別，別類載體由碳水化合物構(gòu)成，比如苯基。典型的操作常由兩綬沖劑組成，0.1%TFA-H2o 和 80% acetonitrile 0.1%TFA-H2o 稀 acetonitrile 。用線型梯變以每分鐘 0.5%到1.0%改變的速度混合。常見分析和純化用柱為4.6 X 250mm（3-10卩m）和22 X 250mm（10卩m）如果用徑向填柱，

17、那么大小是8 X 100 3-10卩m ）禾25 X 250mm（10卩m）大量各種緩沖劑含許多不同試劑，比如heptafluorobutyric 酸，0.1%磷酸， 稀He formic 酸(5-6%,pH2-4), 10-100mM NH4HCO3, 醋酸鈉/氨，TFA/TEA，磷酸鈉或鉀，異戊酚。這樣許多不同組合可形成 緩沖劑，但要注意一點：硅反相柱料不能長時間暴露于高pH，甚至微堿pH，因為這樣會破壞柱子。7. Fmoc 氨基酸的制備和側(cè)鏈保護(hù)Fmoc基團(tuán)是在有NaHCO3或Na2CO3存在的二氧六環(huán)溶液中，通過以下反應(yīng)引入到氨基酸中的：AoVx'IK/ ) R 4-CH C&

18、lt;X)H ->(Wj弋久 I' R丫 Z() NH CH- C(X)H <R - CL NJ理想的Fmoc-氨基酸的側(cè)鏈保護(hù)基應(yīng)在堿性條件下穩(wěn)定，在酸性條件下脫除.下面對其做一介紹.7.1 Asp 和 GluAsp和Glu側(cè)鏈羧基常用t-Bu保護(hù).可用TFA、TMSBr等脫除.但是用t-Bu保護(hù)仍有側(cè)鏈環(huán)化形成酰亞 胺的副反應(yīng)發(fā)生.近年來，發(fā)展了一些新的保護(hù)基如環(huán)烷醇酯、金剛烷醇酯等可減輕這一副反應(yīng)，這些保護(hù) 基可用TMSOTf(三氟甲磺酸三甲硅烷酯)除去.7.2 Ser、Thr 和 Tyrser、Thr的羥基及Tyr的酚羥基通常用t-Bu保護(hù).叔丁基的引入比較麻煩，首

19、先ser制成芐氧羰基酯，再在酸催化下與異丁烯反應(yīng).Ser和Thr還可用芐基保護(hù)，Ser用芐醇引入芐基、Thr用溴芐引入芐基.7.3 Asn 和 GlnAsn和Gln側(cè)鏈的酰胺鍵在肽合成中一般不加以保護(hù).但合成大肽時，Asn和Gln的a-羧基活化時可能會發(fā)生分子內(nèi)脫氫反應(yīng)生成氰基化合物.堿性時Gln的側(cè)鏈可以環(huán)化生成酰胺.而且不保護(hù)的Fmoc-Gln和Fmoc-Asn在DCM中溶解度很差.為了避免這些問題，可以用9-咕噸基，2,4,6-三甲氧芐基，4, 4 二甲氧二苯甲基或三苯甲基等保護(hù)，這四種基因均可用TFA脫除.7.4 HisHis是最容易發(fā)生消旋化的氨基酸，必須加以保護(hù).對咪唑環(huán)的非n-N

20、開始用芐基(Bzl)和甲基磺酰基仃OS)保護(hù).但這兩種保護(hù)基均不太理想.TOS對親核試 劑不穩(wěn)定，Bzl需要用氫解或Na/NHs除去，并且產(chǎn)生很大程度消旋.Boc基團(tuán)是一個較理想的保護(hù)基，降 低了咪唑環(huán)的堿性，抑制了消旋，成功地進(jìn)行了一些合成.但是當(dāng)反復(fù)地用堿處理時，也表現(xiàn)出一定的不穩(wěn)定性.哌啶羰基在堿中穩(wěn)定，但是沒能很好地抑制消旋，而且脫保護(hù)時要用很強(qiáng)的親核試劉如對咪唑環(huán)n-N保護(hù)，可以完全抑制消旋，nN可以用芐氧甲基(Bom)和叔丁氧甲基(Bum)保護(hù)，(Bum) 可以用TFA脫除，Bom更穩(wěn)定些，需用催化氫解或強(qiáng)酸脫保護(hù)，Bum是目前很有發(fā)展前途的 His側(cè)鏈保護(hù)基，其不足之處在于 Fm

21、oc(His)Bum 在DCM 和DMF中的溶解度較差.7.5 CysCys的-SH具有強(qiáng)親核性，易被酰化成硫醚，也易被氧化為二硫鍵，必須加以保護(hù).常用保護(hù)基有三類：一類用TFA可脫除，如對甲芐基、對甲氧芐基和三苯甲基等；第二類可用(CF3CO)3T1 /TFA脫除，對TFA穩(wěn)定.如t-Bu、Bom和乙酰胺甲基等.第三類對弱酸穩(wěn)定，如芐基和叔丁硫基 (stBu)等，Cys(StBu) 可用巰基試劑和磷試劑還原，Cys(Bzl)可用Na/NH3(1)脫保護(hù).7.6 ArgArg的胍基具有強(qiáng)親核性和堿性，必須加以保護(hù).理想的情況是三個氮都加以保護(hù)，實際上保護(hù)1或2個胍基氮原子.保護(hù)基分四類：(1)

22、硝基(2)烷氧羰基(3)磺酰基(4)三苯甲基.硝基在制備、?；呀庵挟a(chǎn)生很多副反應(yīng)，應(yīng)用不廣.烷氧羰基應(yīng)主要有 Boc和二金剛烷氧羰基(Adoc)2、Fmoc(Arg)Boc的耦聯(lián)反效率不高，哌啶理時不處穩(wěn)定，會發(fā)生副反應(yīng)；Adoc保護(hù)了兩個非n-N，但有同樣的副反應(yīng)發(fā)生.對磺酰基保護(hù)，其中 TOS應(yīng)用最廣，但它較難脫除.近年來2, 3，6-三甲基 -4-甲氧苯橫?；?Mtr)較受歡迎，在TFA作用下，30分鐘即可脫除，但是它們都不能完全抑制側(cè)鏈的?；?發(fā)生.三苯甲基保護(hù)基可用 TFA脫除.缺點是反應(yīng)較慢，側(cè)鏈仍有?；磻?yīng)，且其在DCM、DMF中溶解度不好.7.7 LysLys的-NH2必須加

23、以保護(hù).但與a-NH2的保護(hù)方式應(yīng)不同，該保護(hù)基要到肽鏈合成后除去NH2的保護(hù)無消旋問題，可以采用?；Ｗo(hù)基，其它常用的保護(hù)基有芐氧碳基和Boc.7.8 Fmoc基團(tuán)的脫除Fmoc基團(tuán)的芴環(huán)系的吸電子作用使9-H具有酸性，易被較弱堿除去，反應(yīng)條件很溫和.反應(yīng)過程可表示如下：深圳市多肽合成工程技術(shù)研究開發(fā)中心Page 35 of 70.Fmoc基團(tuán)對不同的堿哌啶進(jìn)攻9-H, 3消除形成二苯芴烯，很容易被二級環(huán)胺進(jìn)攻形成穩(wěn)定的加成物穩(wěn)定性不同，可根據(jù)實際條件選用7.9 耦聯(lián)反應(yīng)固相中的接肽反應(yīng)原理與液相中基本一致.將兩個相應(yīng)的氨基被保護(hù)的及羧基被保護(hù)的氨基酸放在溶 液內(nèi)，并不形成肽鍵.要形成酰胺鍵

24、，經(jīng)常用的手段是將羧基活化，其方法是將它變成混合酸酐，或者將它 變?yōu)榛顫婖?、酰氯，或者用?qiáng)的失去劑(碳二亞胺)也可形成酰胺鍵，耦聯(lián)反應(yīng)可表示如下：(A :羰基活潑試劑)碳二亞胺是常用的活化試劑，其中Dec使用范圍最廣，其缺點是形成了不溶于DCM的DCH，過濾時又難于除盡.其他一些如二異丙基碳二亞胺 (DCI)、甲基叔丁基碳二亞胺也用于固相合成中，它們形成的 脲Bop< ；| NN于PF.溶于DCM中，經(jīng)洗滌可以除去.其他活化試劑，還有Bop(Bop C1)、氯甲酸異丙酯、氯甲酸異丁酯、 SOC12等.其中Dec、Bop活化形成對稱酸酐、SOC12形成酰氯，其余三種形成不對稱酸酐 .7.1

25、0 對稱酸酐法用Dec形成對稱酸酐的方法使用較廣.其缺點是有些氨基酸在 DCM中不易溶解，生成的 Fmoc氨基 酸酐溶解度更差.同時還有些副反應(yīng)，如形成二肽、消旋等.7.11 混合酸酐法最常用試劑是氯甲酸的異丙基酯和異丁基酯.前者得到的酸酐穩(wěn)定性好.只產(chǎn)生很少消旋，在適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué) 計量及溶劑條件下，耦聯(lián)反應(yīng)很快 .而且，在此反應(yīng)中使用的 N-甲基嗎啉和N-甲基哌啶對Fmoc基團(tuán)無影 響.7.12 酰氯法在Boc法中不常用的酰氯，因為比較激烈，一些保護(hù)基如Boc不穩(wěn)定.但是，F(xiàn)moc基團(tuán)可以耐受酰氯處理，生成的Fmoc氨基酰氯也很穩(wěn)定.在三甲基乙酸/三胺或苯并三氮唑/二異丙基乙二胺中，反應(yīng)速度很快

26、，消旋很少.酰氯法在固相合成中應(yīng)用還不多，但已表明，F(xiàn)moc -氨基酰氯適用于合成有立體障礙的肽序列.7.13 活化酯法活化酯法在固相合成中應(yīng)用最為廣泛.采用過的試劑也很多，近來最常用的有HOBt酯、ODhbt酯、OTDO酯等.HOBt酯反應(yīng)快，消旋少，用碳二亞胺很容易制得；ODhbt酯很穩(wěn)定，容易進(jìn)行分離純化，與HOBt酯具有類似的反應(yīng)性和消旋性能，它還有一個優(yōu)越之處，在?；瘯r有亮黃色、耦聯(lián)結(jié)束時顏色消失，有利 于監(jiān)測反應(yīng)；OTDO酯與ODhbt酯類似，消旋化極低，易分離，酰化時伴有顏色從桔紅色到黃色的變化 等.7.14 原位法將碳二亞胺和a-N保護(hù)氨基酸直接加到樹脂中進(jìn)行反應(yīng)叫做原位法用D

27、IC代替Dcc效果更好.其他的活化試劑還有 Bop和Bop-C1等.原位法反應(yīng)快、副反應(yīng)少、易操 作.其中DIC最有效，其次是Bop、Bop-C1等.遺憾的是Bop?；瘯r生成致癌的六甲基磷酰胺，限制了其 應(yīng)用.7.15 裂解及側(cè)鏈保護(hù)基脫除Fmoc法裂解和脫側(cè)鏈保護(hù)基時可采用弱酸.TFA為應(yīng)用最廣泛的弱酸試劑，它可以脫除t-Bu、Boc、Adoc、Mtr等；條件溫和、副反應(yīng)較少.不足之處：Arg側(cè)鏈的Mtr很難脫除，TFA用量較大；無法除掉 Cys的t-Bu等基因.也有采用強(qiáng)酸脫保護(hù)的方法：如用HF來脫除一些對弱酸穩(wěn)定的保護(hù)基，如Asp、Glu、Ser、Thr的Bzl（芐基）保護(hù)基等，但是當(dāng)脫

28、除Asp的吸電子保護(hù)基時，會引起環(huán)化副反應(yīng).而TMSBr和TMSOTf 在有苯甲硫醚存在時，脫保護(hù)速度很快.此外，根據(jù)條件不同，堿、光解、氟離子和氫解等脫保護(hù)方法也有應(yīng)用.Fmoc基團(tuán)用于固相合成多肽已經(jīng)有了十多年的歷史，在合成一些含有在酸性條件下不穩(wěn)定的氨基的 殘基的肽時，具有特別優(yōu)越之處 .將Fmoc法和Boc法互相補(bǔ)充，定會在合成更多、更大的生物分子中發(fā) 揮?！?、常用保護(hù)氨基酸數(shù)據(jù)縮寫名稱分子量縮寫名稱分子量A-AlaFmoc- Ala329.3M-MetFmoc-Met371.5R-ArgFmoc-Arg(Pbf)648.77F-PheFmoc- Phe387.4N-AsnFmoc-

29、Asn 仃rt)596.7(D)F-PheFmoc-D-Phe387.4D-AspFmoc-Asp(OtBu)411.46P-ProFmoc- Pro337.4C-CysFmoc-Cys (Trt)585.7S-SerFmoc- Ser(tBu)383.4Q-GlnFmoc- Gln 仃rt)610.7T-ThrFmoc-Thr(tBu)397.5E-GluFmoc- Glu (OtBu)425.48W-TrpFmoc- Trp (Boc)526.59G-GlyFmoc- Gly297.3(D)W-TrpFmoc-D-Trp(Boc)526.59H-HisFmoc- His(Trt)619.7

30、D-TyrFmoc-Tyr(tBu)459.5I-IleFmoc- Ile353.4V-ValFmoc-Val339.4L-LeuFmoc- Leu353.4pGluPyroGlu129.1K-LysFmoc-Lys (Boc)468.5常用試劑種類及數(shù)據(jù)名稱分子量名稱分子量密度（g/ml ）HOBt135.1DIPCDI(DIC)126.30.806TBTU321.1DIPEA(DIA)129.40.76HATU380.3Ac 2O102.11.08DMAP122.1Pyridi ne79.10.983HOAT136.1TFA114.21.44PyBOP580.3TMP121.180.92E

31、DT94.241.123TIS158.4NMM101.150.9168常見保護(hù)基團(tuán)結(jié)構(gòu)及數(shù)據(jù)縮寫分子量縮寫分子量縮寫分子量Fmoc-222tBu-56Acm-57Pbf-253OtBu-72Mz-165.1Trt-242.3Ac-43Boc-101.1Z-134.1三、常用氨基酸結(jié)構(gòu)及性質(zhì)NameSymbolMWMW (-H2O)StructureThree Letter CodeOne LetterCodeAlanineAlaA89.0971.08ArginineArgR174.20156.19MHA八葉AsparagineAsnN132.12114.10nrO< 訊 HjAspart

32、ic AcidAspD133.10115.09CysteineCysC121.15103.15fGlutamicAcidGluE147.13129.12GlutamineGinQ146.15128.13J1GlycineGlyG75.0757.05HistidineHisH155.16137.14k1JIsoleucineIleI131.17113.16Cl丫如LeucineLeuL131.17113.160LysineLysK146.19128.17MethionineMetM149.21131.20PhenylalaninePheF165.19147.18cProlineProP115.1

33、397.12SerineSerS105.0987.08ThreonineThrT119.12101.11丿/8戸 rTryptophanTrpW204.23186.21a；1HrrTyrosineTyrY181.19163.180ValineVaiV117.1599.13丿T四、常見保護(hù)基團(tuán)結(jié)構(gòu)NameStructureSymbolFormulaResidue WtAcetamidomethylMAcmC3H6NO72.1AcetylAcC2H3O43.0QAllyloxycarbonylAlocC4H5O285.16-AmidohexanoateLCC4H7NO85.17-Amido-4-m

34、ethylcoumaryl1H/oa.AMCC10H8NO2174.27-Amido-4-trifluoromethyl-coumarylAFCC10H5F3NO2228.25-(2-Aminoethyl)amino-na phthalene-1-sulfonic acidBenzoylBenzylBenzyloxycarbonylBenzyloxymethylEDANSC12H13N2O3S265.3BzBzlZ (Cbz)C7H5OC7H7C8H7O2105.191.1135.1BomC8H9O121.20(+)-BiotinylH HBiotinC10H15N2O2S227.32-Bro

35、mobenzyloxycarbonyl62-Br-ZC8H6BrO2214.0tert-ButyltBuC4H957.1tert-Butyloxycarbonyl怙BocC5H9O2101.1tert-Butylthio斗TStBuC4H9S89.22-Chlorobenzyloxycarbonyl2-Cl-ZC8H6ClO2169.6AJCyclohexylcHexC6H1183.12,6-Dichlorobenzyl口2,6-di-Cl-BzlC7H5Cl2160.04-(4-Dimethylaminophenyl-azo)benzoylr廣rADABCYLC15H14N3O252.32,

36、4-DinitrophenylDnpC6H3N2O4167.19-FluorenylmethylFmC14H11179.19-Fluorenylmethyloxy-carbonylFmocC15H11O2223.3Fluorescein IsothiocyanateFITCC21H12NO5S390.4Lissamine RhodamineLRC31H38N2O6S2598.8Mesitylene-2-sulfonyl4-Methoxybenzyl(7-Methoxycoumarin-4-yl)acetyl4-Methoxy-2,3,6-trimethyl-benzenesulfonylCHM

37、tsMobMcaMtrC9H11O2SC8H9OC12H9O4C10H13O3S183.3121.2217.2213.34-Methoxytrityl£MmtC20H17O273.44-MethylbenzylMBzlC8H9105.24-Methyltrityl)4MttC20H17257.44-MorpholinecarbonylOJJMuC5H8NO2114.1p-NitroanilidepNAC6H5N2O2137.12,2,4,6,7-Pentamethyldihydro-benzofuran-5-sulfonyl2,2,5,7,8-Pentamethyl-chroman-

38、6-sulfonylRhodamine 110Succinyl4-ToluenesulfonylCH,PbfC13H17O3S253.3PmcC14H19O3S267.4R110C20H13N2O3329.3SucC4H5O3101.1TosC7H7O2S155.2TritylXanthylTrtC17H15243.3XanC13H9O181.2五、多肽常識Reconstitution and Storage of PeptidesPeptides are usually supplied as a fluffy, freeze-dried material in serum vials. S

39、tore peptides in a freezer after they have been received. In order to reconstitute the peptide, distilled water or a buffer solution should be utilized. Some peptides have low solubility in water and must be dissolved in other solvents such as 10% acetic acid for a positively charged peptide or 10%

40、ammonium bicarbonate solution for a negatively charged peptide. Other solvents that can be used for dissolving peptides are acetonitrile, DMSO, DMF, or isopropanol. Use the minimal amount of these non-aqueous solvents and add water or buffer to make up the desired volume. After peptides are reconsti

41、tuted, they should be used as soon as possible to avoid degradation in solution. Unused peptide should be aliquoted into single-use portions, relyophilized if possible, and stored at -20 ° C. Repeated thawing and refreezing should be avoided.Methods to Dissolve PeptidesThe best way to dissolve

42、a peptide is to use water. For peptides that are not soluble in water, use the following procedure:1. For acidic peptides, use a small amount of base such as 10% ammonium bicarbonate to dissolve the peptide, dilute with water to the desired concentration. Do not use base for cysteine-containing pept

43、ides.2. For basic peptides, use a small amount of 30% acetic acid, dilute with water to the desired concentration.3. For a very hydrophobic peptide, try dissolving the peptide in a very small amount of DMSO, dilute with water to the desired concentration.4. For peptides that tend to aggregate (usual

44、ly peptides containing cysteines), add 6 M urea, 6 M urea with 20% acetic acid, or 6 M guanidine?HCl to the peptide, then proceed with the necessary dilutions.Preparation of HBTU/HOBt Solution for the Peptide Synthesizer1. Preparation of 0.5 M HOBt in DMF:o Weigh 13.5 g anhydrous HOBt (0.1 mol, MW 1

45、35.1) 100 g, AnaSpec Catalog # 21003; 500 g, AnaSpec Catalog # 21004 into a 250 mL graduated cylinder.o Add DMF until the 200 mL level is reached.2. Preparation of 0.45 M HBTU/HOBt solution:o Add the solution prepared in step 1 to 37.9 g HBTU (0.1 mol, MW 379.3) 100 g, AnaSpec Catalog # 21001; 500 g

46、, AnaSpec Catalog # 21002 contained in a beaker or an Erlenmayer flask.3. Stir for about 15 min with a magnetic stirring bar until HBTU is dissolved.4. Filter the solution through a fine pore size sintered glass funnel.5. Pour the filtered solution into an appropriate bottle for attachment to a pept

47、ide synthesizer.* This solution is stable at room temperature for at least six weeks.Biotinylation of Amino Group1. Wash 0.1 mmol resin with DMF.2. Dissolve 0.244 g 什)-biotin (1 mmol, MW 244.3) 1 g, AnaSpec Catalog # 21100; 5 g, AnaSpec Catalog # 21101 in 5 mL DMF-DMSO (1:1) solution. A little warmi

48、ng is necessary.3. Add 2.1 mL 0.45 M HBTU/HOBt solution and 0.3 mL DIEA to the solution prepared in step2.4. Add the activated biotin solution to the resin and let stir overnight.5. Check resin to make sure coupling is complete as evidenced by negative ninhydrin test (colorless).6. Wash resin with D

49、MF-DMSO (1:1) (2x) to remove excess 什)-biotin.7. Wash resin with DMF (2x) and DCM (2x).8. Let the resin dry before proceeding to cleavage.Procedure for Loading Fmoc-Amino Acid to 2-Chlorotrityl Chloride Resin1. Weigh 10 g 2-chlorotrityl chloride resin (15 mmol) 1 g, AnaSpec Catalog # 22229; 5 g, Ana

50、Spec Catalog # 22230 in a reaction vessel, wash with DMF (2x), swell the resin in 50 mL DMF for 10 min, drain vessel.2. Weigh 10 mmol Fmoc-amino acid in a test tube, dissolve Fmoc-amino acid in 40 mL DMF, transfer the solution into the reaction vessel above, add 8.7 mL DIEA (50 mmol), swirl mixture

51、for 30 min at room temperature.3. Add 5 mL methanol into the reaction vessel and swirl for 5 min.4. Drain and wash with DMF (5x).5. Check substitution.6. Add 50 mL 20% piperidine to remove the Fmoc group. Swirl mixture for 30 min.7. Wash with DMF (5x), DCM (2x), put resin on tissue paper over a foam

52、 pad and let dry at room temperature overnight under the hood. Cover the resin with another piece of tissue paper, press lightly to break aggregates.8. Weigh loaded resin.9. Pack in appropriate container.Procedure for Checking Substitution of Fmoc-Amino Acid Loaded Resins1. Weigh duplicate samples of 5 to 10 mg loaded resin in an eppendorf tube, add 1.00 mL 20% piperidine/DMF, shake for 20 min, centrifuge down the resin.2. Transfer 100卩 L of the above solution into a tube containing 10 mL DMF, mix well.3. Pipette 2 mL DMF into each of the two cells (reference cell a