黃綠青霉毒素對(duì)HepG2細(xì)胞的DNA損傷毒性及氧化應(yīng)激機(jī)制研究

1、專業(yè)名稱：勞動(dòng)衛(wèi)生鞴衛(wèi)生學(xué)黃綠青霉毒素對(duì)細(xì)胞的損傷毒性及氧化應(yīng)激機(jī)制的研究白云濤學(xué)位授予單位：大連醫(yī)科大學(xué)論文提交日期：年月申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士學(xué)位指導(dǎo)教師：陳敏副教授插學(xué)位授予日期：年月幅圖論文答辯日期：年月格：表：個(gè)頁計(jì)：學(xué)位論文：評(píng)閱人：答辯委員會(huì)主席：獨(dú)創(chuàng)性聲明；前簽字日期：五！蘭年月立日與我一同工作的同志對(duì)本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明為獲得大連醫(yī)科大學(xué)或其他教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書而使用過的材料。方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含作及取得的研究成果。據(jù)我所知，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地學(xué)位論文作者簽名：確的說明并表示謝意。本人聲明所呈交的學(xué)位論文是本

2、人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工錄目三、綜述（一）綜述（六）參考文獻(xiàn)（二）參考文獻(xiàn)（二）材料與方法（五）結(jié)論（四）討論（一）中文摘要（三）結(jié)果四、致謝（一）日舌”一”一”。（一）前言二、正文（二）英文摘要一、摘要。··仲來福教授黃綠青霉毒素對(duì)細(xì)胞的損傷毒性及氧化應(yīng)激機(jī)制的研究勞動(dòng)衛(wèi)生與環(huán)境衛(wèi)生學(xué)指導(dǎo)教師：陳敏副教授指導(dǎo)小組：碩士生姓名：專業(yè)名稱：白云濤摘要腦電圖異常、竇性心律失常、低血壓等，從而出現(xiàn)由于主動(dòng)脈組織缺氧而導(dǎo)致的生一種毒性很強(qiáng)的代謝產(chǎn)物即黃綠青霉毒素。灣大米中提取出了一種真菌并命名為黃綠青霉菌（）。該菌株可產(chǎn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀。可致大鼠心肌原發(fā)性壞死，心肌細(xì)胞呈顆粒狀變

3、性，心肌可通過干擾受試?yán)鲜竽X部的糖代謝進(jìn)而導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙。研究認(rèn)為的毒性效應(yīng)源于其導(dǎo)致的呼吸系統(tǒng)及心血管系統(tǒng)的損傷，如呼吸暫停、本研究選用細(xì)胞，探討的損傷毒性及其可能機(jī)制。細(xì)胞本研究選用細(xì)胞，探討的損傷毒性及其可能機(jī)制，旨在為纖維凝集，溶解。可結(jié)合并抑制線粒體中的三磷酸腺苷合成酶。研究認(rèn)為數(shù)量也最高。溫度與環(huán)境中的值對(duì)黃綠青霉菌的生長及產(chǎn)毒有著密切影響。霉變的谷物，大米，玉米等。研究發(fā)現(xiàn)黃綠青霉菌在大米中生長速度最快，產(chǎn)毒）產(chǎn)生的具有毒性的次級(jí)代謝產(chǎn)物。廣泛存在于霉變作物中，例如前言：黃綠青霉毒素（，）是主要由黃綠青霉菌（與“黃變米中毒”，“心源性腳氣病”以及克山病有著密切關(guān)系。來源

4、于人類肝胚細(xì)胞瘤，分化程度較高，不僅保留了人類正常肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的許多功能和特點(diǎn)，還保留了較完整的生物轉(zhuǎn)化代謝相酶和相酶。被認(rèn)為是用來檢測(cè)外來化合物損傷毒性的理想細(xì)胞系。為親脂性毒素，吸收后在肝臟中可致心肌細(xì)胞，人胃癌細(xì)胞（）損傷。但具體機(jī)制尚不清楚。現(xiàn)用發(fā)霉的大米喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物會(huì)導(dǎo)致其出現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)麻痹的癥狀。年，最早引起人們關(guān)注是在多年前的日本。年，日本學(xué)者發(fā)濃度最高。這也就是我們采用細(xì)胞作為該試驗(yàn)系統(tǒng)的原因之一。）引起實(shí)驗(yàn)動(dòng)物兔和老鼠的病變。隨后等人從日本本土大米和臺(tái)評(píng)估對(duì)人類健康的潛在危害提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。日本學(xué)者和首次報(bào)道了來自霉變食物的青霉菌屬（ 方法：本研究選用細(xì)胞作為試驗(yàn)系統(tǒng)。通過單

5、細(xì)胞凝膠電泳（）試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞損傷情況，評(píng)價(jià)的損傷毒性。為探討其可能的損傷毒性機(jī)制，以 ，一二氫二氯熒光素（）法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)水平，以苯二醛（）測(cè)定細(xì)胞內(nèi)還原型谷胱甘肽（）水平，以免疫組化方法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)羥基脫氧鳥苷（）的表達(dá)水平，用吖啶橙（ ）和羅丹明（ ）分別測(cè)定細(xì)胞內(nèi)溶酶體膜穩(wěn)定性和線粒體膜電位的改變水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果用 統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。 結(jié)果：“的作用于細(xì)胞 后，引起細(xì)胞鏈斷裂，細(xì)胞形成彗星樣拖尾，其尾明顯大于未用處理的細(xì)胞。 的染毒 弓起細(xì)胞內(nèi)水平明顯增加，水平顯著降低，與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（戶）； 的乙酰半胱氨酸（）預(yù)處理 后可降低弓起的細(xì)胞為水平增加，對(duì)所致細(xì)胞損傷具有保護(hù)

6、作用。 作用于細(xì)胞后，可致的表達(dá)升高；的作用于細(xì)胞 后，可引起細(xì)胞內(nèi)溶酶體膜穩(wěn)定性明顯改變； 的作用 引起細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位的改變，與對(duì)照組比較，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（）。 結(jié)論：可引起細(xì)胞損傷，提示對(duì)細(xì)胞具有損傷毒性。可誘發(fā)細(xì)胞為水平增高，水平降低，提示對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的損傷毒性可能與氧化應(yīng)激機(jī)制有關(guān)。一乙酰半胱氨酸（）預(yù)處理后可降低引起拘細(xì)胞陜水平增加，對(duì)所致細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用。作用于細(xì)胞后導(dǎo)致氧化性損傷的標(biāo)志性產(chǎn)物形成增強(qiáng)，進(jìn)步表明引起印細(xì)胞的損傷為氧化性損傷。此外，對(duì)圣胞溶酶體膜穩(wěn)定性有顯著影響，并使得細(xì)胞線粒體膜電位顯著降低。關(guān)鍵詞： 黃綠青霉毒素細(xì)胞系損傷毒性 氧化性危了鶘?溶酶體膜穩(wěn)定

7、性 （） ： ： ： ：（） ， 【曲 也 。 螅簦錚潁? ， ， ，缸 ， ， ” ， 曲 ， ， （， ， ，） ， ， 一 ， （） ， ， ， ： （） ， ， （） （） （）（）， ， （）， ， ， （） ： ， ） ， ： ， ， 一 ， ， ， ， ， ， ： 黃綠青霉毒素對(duì)細(xì)胞的損傷毒性 及氧化應(yīng)激機(jī)制的研究 碩士生姓名： 白云濤 指導(dǎo)教師： 陳敏副教授 指導(dǎo)小組： 仲來福教授 專業(yè)名稱： 勞動(dòng)衛(wèi)生與環(huán)境衛(wèi)生學(xué) 一 刖 舌 黃綠青霉毒素（，）是主要由黃綠青霉菌（）產(chǎn)生的具有毒性的次級(jí)代謝產(chǎn)物。其他產(chǎn)毒菌株包括：，¨。廣泛存在于霉變糧食作物中，例如霉變的谷物，大米，

8、玉米等。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)黃綠青霉菌在大米中生長速度最快，產(chǎn)毒數(shù)量也最高。用糧食培養(yǎng)黃綠青霉菌時(shí)，溫度在。時(shí)糧食的產(chǎn)毒量最高。隨著溫度的逐漸升高，毒性逐漸減弱，當(dāng)溫度超過時(shí)基本觀察不到糧食的毒性。此外，黃綠青霉菌的生長及產(chǎn)毒數(shù)量與環(huán)境中的值有著密切影響。 最早引起人們關(guān)注是在多年前的日本。年，日本學(xué)者發(fā)現(xiàn)用發(fā)霉的大米喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物會(huì)導(dǎo)致其出現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)麻痹的癥狀。年，日本學(xué)者和首偽懶死醋悅貢涫澄锏那嗝咕簦校澹睿椋悖椋歟歟椋酰恚悖錚恚恚酰睿澹實(shí)驗(yàn)動(dòng)物兔和老鼠的病變。隨后等人從日本本土大米和臺(tái)灣大米中提取出了一種真菌并命名為黃綠青霉菌（）。該菌株可產(chǎn)生一種毒性很強(qiáng)的代謝產(chǎn)物即黃綠青霉毒素【】。 目前研究業(yè)已

9、證實(shí)具有心血管毒性，神經(jīng)毒性，損傷毒性。其急性中毒癥狀主要表現(xiàn)為神經(jīng)毒性癥狀，例如癱瘓，麻痹，嘔吐和呼吸衰竭最終導(dǎo)致死亡。 毒性較強(qiáng)，對(duì)小白鼠的半數(shù)致死量：靜脈注射約為班，口服約為。由于中毒癥狀與人類心源性腳氣病的癥狀極為相似，因此國外學(xué)者認(rèn)為可能是心源性腳氣病的病因之一。在一些食物短缺或是人們健康意識(shí)薄弱的落后地區(qū)，由于長期食用已發(fā)生霉變的食物就會(huì)導(dǎo)致急性或慢性中毒事件。年，巴西州落后鄉(xiāng)村爆發(fā)了一起嚴(yán)重的腳氣病，人死亡，數(shù)百人出現(xiàn)中毒癥狀。在當(dāng)?shù)厝耸秤玫拇竺讟颖局袡z測(cè)出了大量的黃綠青霉毒素【】。 可通過于擾受試?yán)鲜竽X部的糖代謝進(jìn)而導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙，如震顫，抽搐，呼吸衰竭，肢體無力等【

10、。研究認(rèn)為的毒性效應(yīng)源于其導(dǎo)致的呼吸系統(tǒng)及心血管系統(tǒng)的損傷，如呼吸暫停，腦電圖異常，竇性心律失常，低血壓 等，從而出現(xiàn)由于主動(dòng)脈組織缺氧而導(dǎo)致的中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀。通過靜脈注射致死劑量或高于致死劑量的（；，），兔子可出現(xiàn)高聳的波并抑制呼吸運(yùn)動(dòng)。由靜脈注射引起的兔子死亡開始于呼吸抑制，隨后出現(xiàn)等電位的腦電圖，最后心電圖顯示心臟停止跳動(dòng)。在尿烷麻醉的兔子中，降低其血壓，波異常顯示心肌缺血【。此外，還可增強(qiáng)分離的青蛙心臟的心肌收縮性。年，楊秋慧等研究發(fā)現(xiàn)可致大鼠心肌原發(fā)性壞死，心肌細(xì)胞呈顆粒變性，心肌纖維凝集，溶解。多見于左室內(nèi)膜下，室中隔及心尖等部位。電鏡下可觀察到心肌線粒體損傷：線粒體腫脹，嵴膜破

11、裂【。可損害人胃癌細(xì)胞（）線粒體結(jié)構(gòu)。電鏡下觀察表現(xiàn)為線粒體嵴膜破裂，嵴變短，消失。線粒體腫脹，空泡樣變化。 染毒組還伴有核濃縮，染色質(zhì)邊集。 本研究選用細(xì)胞，探討的損傷毒性及其可能機(jī)制。細(xì)胞來源于人類肝胚細(xì)胞瘤【】，分化程度較耐，不僅保留了人類正常肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的許多功能和特點(diǎn)【，與肝細(xì)胞具有相同的生物學(xué)活性，還保留了較完整的生物轉(zhuǎn)化代謝相酶和相酶【¨。被認(rèn)為是用來檢測(cè)外來化合物損傷毒性的理想細(xì)胞系【 ，廣泛應(yīng)用于遺傳毒理學(xué)及病毒培養(yǎng)等方面的研究。為親脂性毒素，吸收后在肝臟中濃度最高【，這也就是我們采用細(xì)胞作為該試驗(yàn)系統(tǒng)的原因之一。 本研究選用細(xì)胞，探討的損傷毒性及其可能機(jī)制，旨在為評(píng)

12、估對(duì)人類健康的潛在危害提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。 材料和方法 主要藥品與試劑 購自美國 公司，純度，號(hào)。以溶解，貯存液濃度為 ，。保存，臨用時(shí)用培養(yǎng)基稀釋至所需濃度。，溴化乙啶（）、吖啶橙（）、苯二醛（）、羅丹明（ ）、，一二氫二氯熒光素（）和細(xì)胞松弛素均購自美國公司；低熔點(diǎn)瓊脂糖（）、正常熔點(diǎn)瓊脂糖（）購自英國 公司；乙酰半胱氨酸（）和抗羥基脫氧鳥苷（）單克隆抗體分別購自日本和試劑公司； 超敏試劑盒、顯色試劑盒購于福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司；培養(yǎng)基為美國公司產(chǎn)品，胎牛血清為以色列 公司產(chǎn)品；其他試劑均為分析純。 主要儀器 全自動(dòng)定量繪圖酶標(biāo)儀（美國公司）；培養(yǎng)箱（美國 自中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)。細(xì)胞培養(yǎng)于

13、含胎牛血清及雙抗（青霉素，電壓，電流強(qiáng)度用少量堿性電泳液洗去玻片表面殘留的細(xì)胞裂解液，將玻片置于水平電泳槽陽極，）中，”冰箱放置，裂解約避光保存的細(xì)胞裂解液（含。小心移去膠片上的蓋玻片，將玻片置于新配制的，使用前擦干備用。第一層膠的制備：在預(yù)熱的全磨砂檢測(cè)有無凋亡現(xiàn)象發(fā)生。離心棄上清，洗滌細(xì)胞兩次，最后用將細(xì)胞調(diào)，鏈試驗(yàn)方法在干預(yù)試驗(yàn)中，首先用濃度為型水平式電泳儀（大連捷邁公司）：型倒置顯微鏡、型熒光顯型電子天平、型電子分析天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；機(jī)（美國公司）；型熒光分光光度計(jì)（日本公司）；一型冷凍高速離心機(jī)（日本公司）；型超速離心后觀察結(jié)果。，蓋上蓋玻片，的對(duì)預(yù)處理組細(xì)胞孵溴化乙

14、啶（）染液略干后滴加公司）；和，加上蓋玻片，”冰箱放置）緩沖液浸洗次，每次載玻片上鋪熔融的約片轉(zhuǎn)移至中性緩沖液。停止電泳后小心地將玻解螺旋。隨后電泳，方便，放置），液面高度位于載玻片上方約，電泳至個(gè)。參照試驗(yàn)方法【】稍加改動(dòng)。所有的磨玻璃片，載玻片，蓋玻片均事先端，向電泳槽中加入新鮮配制的堿性電泳緩沖液（。隨后微鏡（日本公司）；激光掃描共聚焦顯微鏡（萊卡微系統(tǒng)，德國）。細(xì)胞培養(yǎng)在的酒精中浸泡細(xì)胞處理一），購霉素（）的培養(yǎng)基中，置于”，的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)傳代次，取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞用于試驗(yàn)。同時(shí)設(shè)溶劑對(duì)照組。上蓋玻片，”冰箱放置按：的比例在下混勻，迅速將上述混合液約肚滴加在第一層膠上，加取出第一層

15、凝膠片，輕輕揭去蓋玻片。第二層膠的制備：上述細(xì)胞懸液與單細(xì)胞凝膠電泳（）試驗(yàn)，用胰酶消化收獲對(duì)數(shù)期生長細(xì)胞，加入濃度分別為細(xì)胞來源于，同時(shí)設(shè)溶劑空白對(duì)照組。溫育懸浮培養(yǎng)臺(tái)盼藍(lán)（）染色檢測(cè)細(xì)胞存活率為以上，（。取細(xì)胞懸液”，） ，（，（，。同時(shí)設(shè)溶劑空白對(duì)照組，作用，使細(xì)胞均勻地貼附在蓋玻片上。加入其底部預(yù)先放有蓋玻片，。培養(yǎng)】略加改進(jìn)。將×個(gè)試管細(xì)胞接種于孔板，細(xì)胞內(nèi)羥基脫氧鳥苷（）免疫組化分析，避光。最后用熒光比色計(jì)測(cè)定熒光強(qiáng)度，激發(fā)，加磷酸鹽緩沖液，離心后取上清液三氯乙酸，。環(huán)境下作用。離心去上清，用洗滌細(xì)胞兩次，再次離心去上清，加入作用各濃度的無血清培養(yǎng)基中，同時(shí)設(shè)溶劑空白對(duì)照

16、組，方法?！柯约痈倪M(jìn)。將個(gè)試管細(xì)胞懸浮于¨，。再按上述步驟進(jìn)行操作，然后將細(xì)胞暴露于的，的對(duì)預(yù)處理組細(xì)胞孵育在干預(yù)試驗(yàn)中，首先用濃度為，狹縫，發(fā)射波長波長后，將細(xì)胞和上清液混勻，用熒光比色計(jì)測(cè)定混合液熒光強(qiáng)度，激發(fā)。用洗滌細(xì)胞三次，離心收集細(xì)胞，然后加入熒光顯微鏡下閱片，激發(fā)波長體的實(shí)驗(yàn)步驟【】：取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，用胰酶消化收取，向個(gè)試管的細(xì)胞成具有綠色熒光性質(zhì)的物質(zhì)，其熒光強(qiáng)度與細(xì)胞內(nèi)活性氧水平成正比引。具酶將其水解為非熒光的二氯熒光素（），在作用下，被氧化生平。試驗(yàn)原理是：是非極性化合物，能迅速擴(kuò)散到細(xì)胞內(nèi)，細(xì)胞內(nèi)的酯用分子探針測(cè)定作用于細(xì)胞后產(chǎn)生的細(xì)胞內(nèi)水細(xì)胞內(nèi)活性氧類（）測(cè)定

17、，）軟件測(cè)定細(xì)胞尾）版（個(gè)細(xì)胞進(jìn)行分析，拍照。圖像直接輸入計(jì)算機(jī)，保存為文件。采用（。每個(gè)樣本隨機(jī)選取，發(fā)射波長。再按上述步驟進(jìn)行操育，加過氧化物酶阻斷劑室溫作用的，滴加，正常非免疫動(dòng)物血清室溫封閉溶于乙醇）作用作。，結(jié)果觀察及評(píng)價(jià)，然后將細(xì)胞暴露于及設(shè)立空白對(duì)照組，作用，變性液（于。作用中加入?yún)⒄盏鹊姆椒ㄓ谧饔茫M縫玻片，用濾紙將玻片吸干，待其充分干燥后及時(shí)用冷丙酮固定（”，）。洗兩次，取出蓋波長，。作用作用，發(fā)射波長和細(xì)胞內(nèi)還原型谷胱甘肽（）含量的測(cè)定參照）。，（，：，。，狹縫砌。向各管里加入終濃度為。離心去上清，用洗滌細(xì)胞兩次，溶劑設(shè)空白對(duì)照組，作用版本完成，數(shù)據(jù)以均值標(biāo)準(zhǔn)差（±

18、;）表示，胞數(shù)目調(diào)整至個(gè)試管，向各管中分別加入上清用熒光比色計(jì)測(cè)定熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長參照等人的方法】。取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，用胰酶消化收獲細(xì)胞，將細(xì)但當(dāng)線粒體功能異常，膜轉(zhuǎn)運(yùn)能力下降時(shí)，在線粒體內(nèi)聚集能力減弱或喪失，光探針。正常情況下，可穿透細(xì)胞膜在線粒體內(nèi)聚集，并發(fā)出黃綠色的熒光；實(shí)驗(yàn)原理：羅丹明（）是一種無細(xì)胞毒性，易被活性線粒體吸收的熒細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位的測(cè)定新鮮配制的顯色液，顯微鏡下觀察混勻，用熒光比色計(jì)測(cè)定混合液熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長，注意避光。之后離心去上清，用并混勻，。作用次，將細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移到一次性管里，離心去上清，向各管里加入終濃度。離心去上清，洗兩，同時(shí)設(shè)溶劑空白對(duì)照組，作用，“，獲細(xì)胞，將細(xì)胞數(shù)目調(diào)整至個(gè)試管，再次離一后加入?yún)⒖嫉热说姆椒约痈倪M(jìn)。取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，用胰酶消化收并與溶酶體內(nèi)酸性水解酶結(jié)合而發(fā)出橘紅色的熒光。指示劑，反映溶酶體質(zhì)子泵功能。呈弱堿性，可穿透細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)進(jìn)入溶酶體內(nèi)，性染料，單鏈核酸呈橙色熒光，雙鏈核酸呈綠色熒光；在活細(xì)胞中是一種熒光染料具有兩種不同的染色特點(diǎn)：在已固定的組織內(nèi)是一種異染倍）表示陽性表