醫(yī)學(xué)治療前列腺論文正文

1、前言前列腺增生癥即良性前列腺增生( benign prostatic hyperplasia，bph )，亦稱前列腺肥大，是一種因前列腺明顯增大而影響男性健康的常見疾病，系成年男性泌尿生殖系統(tǒng)疾病中多發(fā)病之一。前列腺增生癥以進行性尿頻、排尿困難為臨床特點。bph的病因和發(fā)病機理研究頗多，但至今未能十分明確，目前較為肯定是本病發(fā)生必須具備2個條件：高齡和具備正常功能睪丸的存在。目前bph發(fā)病機理主要學(xué)說有：雙氫睪酮（dth）學(xué)說、雌雄激素協(xié)同學(xué)說、間質(zhì)上皮細胞相互作用學(xué)說、胚胎再喚醒學(xué)說、干細胞學(xué)說等1,2。在中醫(yī)理論中，一般把bph歸屬為 “癃閉”范疇，病機特點為本虛標實，本虛是指腎虛氣弱，涉

2、及腎、肺、脾三臟；標實主要指淤血蓄結(jié)和膀胱潴留的水濕，涉及膀胱之腑。而腎虛血淤是bph的基本病因。bph的治療方法頗為龐雜，文獻報道豐富，但不外藥物和手術(shù)兩種。手術(shù)目的是解除梗阻，目前手術(shù)方法也較多，療效較為可靠。但這種方法損傷性大，恢復(fù)期長，而近來的采用經(jīng)尿道前列腺摘除術(shù)，技術(shù)難度大，摘除不徹底，且由于老年人多伴有不同程度的心腦血管疾病及心肺功能不全，手術(shù)治療合并癥較多，危險性也大。另外，目前國內(nèi)外對前列腺免疫功能的研究表明3,4，前列腺能夠產(chǎn)生多種免疫球蛋白，可以合成具有抗菌作用的含鋅多肽，且有保護生殖系統(tǒng)免遭細菌和其它病原微生物侵襲的局部免疫功能，故有人主張應(yīng)盡量保留。其他外科治療方法b

3、ph中，注射療法效果不穩(wěn)定，復(fù)發(fā)率高，注射部位疼痛，且易引起注射部位感染，故不易推廣；冷凍治療的深度與廣度不易控制，易產(chǎn)生并發(fā)癥；激光治療對前列腺增生消除不徹底，復(fù)發(fā)率高；微創(chuàng)和射頻的生物熱效應(yīng)療效不滿意。因此，藥物治療bph變得十分重要。藥物治療旨在減輕或緩解bph患者的病情。目前用于治療bph的西藥主要由以下兩類：（1）受體阻滯劑，主要作用機理是降低前列腺和尿道平滑肌的張力及前列腺尿道的壓力，從而解除了因bph引起的膀胱出口梗阻(boo)的動力學(xué)因素，改善梗阻癥狀，可用于早期的前列腺增生癥，但有頭痛，心悸，眩暈，體位低血壓及藥物依賴性等副作用。（2）5還原酶抑制劑，可以降低前列腺組織中的d

4、ht水平，不僅使前列腺不再繼續(xù)增生，還可以使其體積縮小但對性功能影響較大，常有陽痿、性欲下降、射精量減少等。且以上兩種藥物起效慢，需長期服用，并且價格昂貴，一般患者難以承受。因此，尋求費用低、安全有效的治療方法非常必要。中醫(yī)藥在治療bph方面積累了豐富的經(jīng)驗。近年來，中藥治療bph的研究日益受到重視。主要有：單味中藥治療，中草藥復(fù)方制劑，中藥特殊療法，以及植物類藥物及花粉提取物的治療。尤其是具有補腎活血作用的中草藥和中藥復(fù)方較多地被用于臨床。本課題的研究對象是益腎克癃方，其來源于名老中醫(yī)的臨床驗方。由馬鞭草、玄參、丹參、生首烏等藥組成。馬鞭草味苦性涼，入肝、脾、腎經(jīng)，具有活血消淤、清熱解毒及利

5、水消腫的功能5。玄參為君藥，其活性成分具有補腎虛、瀉火、改善微循環(huán)和毛細血管通透性、保肝及免疫促進等功能6。臣藥丹參主要活性成分具有抗心血管疾病、治療肝腎疾病、抗呼吸系統(tǒng)疾病、抗腫瘤、影響免疫、抗氧化等作用7。臣藥何首烏具有抗衰老、降血脂、降低血小板與紅細胞聚集、抗炎、鎮(zhèn)痛等作用8。臨床應(yīng)用表明，本方治療前列腺增生有顯著的療效，并能改善由前列腺增生引起的并發(fā)癥。本課題組將通過藥理學(xué)實驗，對益腎克癃方的藥效學(xué)進行驗證，并在此基礎(chǔ)上初步探討其抗前列腺增生作用的作用機理，以期為益腎克癃方的進一步研究和前列腺增生癥的治療提高可靠的依據(jù)。第一部分 益腎克癃方抗實驗性小鼠前列腺增生作用的研究一 材料與方法

6、（一）實驗動物健康清潔級雄性icr小鼠 ( 18 22 g )由浙江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，動物合格證號：scxk(浙)2003-0001（二）藥材與化學(xué)試劑1 藥材馬鞭草：藥材購自浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥飲片廠，經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)張如松教授鑒定為馬鞭草科植物馬鞭草verbena officinalis l.的地上部分，符合中國藥典2005版一部有關(guān)項下的要求。玄參：藥材購自浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥飲片廠，經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)張如松教授鑒定為玄參科植物玄參scrophularia ningpoensis hernsl.的干燥根，符合中國藥典2005版一部有關(guān)項下的要求。 何首烏：藥材購自浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥飲

7、片廠，經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)張如松教授鑒定為蓼科植物何首烏polygonum multiflorum thunbl.的干燥塊根，符合中國藥典2005版一部有關(guān)項下的要求。處方中其他藥材均購自浙江浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥飲片廠，經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)張如松教授鑒定均符合中國藥典2005版一部有關(guān)項下的要求。2 藥品與化學(xué)試劑愛普列特（epristeride tablets），江蘇聯(lián)環(huán)藥業(yè)股份有限公司，批號：20100901丙酸睪酮注射液（tp），上海通用藥業(yè)股份有限公司，批號：10040195%乙醇（分析純），杭州長征化工廠，批號：20051014氯化鈉（分析純），上海試四赫維化學(xué)試劑有限公司，批號：081014

8、酸性磷酸酶（acp）試劑盒，上海復(fù)星長征醫(yī)學(xué)科學(xué)有限公司，批號：p100550橄欖油（分析純），國藥集團化學(xué)試劑有限公司，批號：f20070625（三）實驗儀器電子天平：ab104-n型，瑞士mettler toledo公司離心機：80-2b型，上海安亭科學(xué)儀器廠自動雙重純水蒸餾器，d1810c，上海申勝生物科技有限公司電子調(diào)溫電熱套：98-1-b型，天津市泰斯特儀器有限公司半自動生化儀：738plus型，上海安泰分析儀器有限公司旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：bÜchi rotavapor r-200型，瑞士bÜchi公司旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：bÜchi rotavapor r-220型，瑞

9、士bÜchi公司senco-w201恒溫水浴鍋：上海申生科技有限公司ahz-d循環(huán)水式真空泵：鞏義市英峪予華儀器廠dlsb-10130低溫冷卻循環(huán)泵：鞏義市京華儀器有限公司電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：dhg-9140型，上海一桓科技有限公司超聲波清洗器：kq5200，昆山市超聲儀器有限公司小鼠灌胃器、1ml注射器、燒杯、量筒等（四）實驗方法1 藥物的制備（1）取三個處方量藥材，加12倍量的水，提取三次，每次1小時，過濾，濾液減壓濃縮至一定濃度，加入95%乙醇至乙醇濃度為60%，放置12小時后，濾過，濾液減壓濃縮至無醇味后，加水稀釋至一定濃度。（2）愛普列特50mg，加水至200ml，配成0.

10、25mg/ml的溶液。（3）丙酸睪丸酮注射液（25mg/ml）10ml，加橄欖油至100ml，配成2.5mg/ml的溶液。2 動物分組、造模9和給藥60只icr小鼠常規(guī)飼養(yǎng)熟悉一周后，按體重隨機分為5組，每組12只；模型組、陽性組和2個劑量組小鼠每日皮下注射丙酸睪酮的橄欖油溶液5 mg/kg進行造模，連續(xù)21天；同時灌胃給藥：陽性對照組灌胃給予愛普列特105 mg/kg，高劑量組灌胃給予水提醇沉樣液39g/kg，低劑量組灌胃給予水提醇沉樣液19.5g/kg，同時空白組和模型組灌胃給予生理鹽水，1次/d，連續(xù)21d。 3 觀察指標及測定方法 （1）小鼠一般情況的觀察每天觀察小鼠的一般情況，包括飲

11、食變化，行為（自主活動，精神狀態(tài)），毛發(fā)變化及排尿情況。（2）對小鼠前列腺濕重及指數(shù)的測定于末次次給藥24h后，摘眼球取血，并立即摘取前列腺，稱得濕重，測定各組的前列腺濕重和前列腺指數(shù)（前列腺重量/小鼠體重×1000）。（3）血清中總酸性磷酸酶（acp）水平的測定11 取血后靜置30min，血液凝固后，于4000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，取上層血清，按試劑盒操作，應(yīng)用半自動生化儀測定acp水平。酸性磷酸酶a：測定原理磷酸萘酚 + 水 萘酚 + 磷酸萘酚 + 固紅tr 重氮色素上述反應(yīng)中，重氮色素的生成速率與樣本中酸性磷酸酶活力成正比。通過在405nm處監(jiān)測吸光度的上升速率，即可測得樣本中酸

12、性磷酸酶的活力。b：計算方法：酸性磷酸酶（u/l）=（a/min×tv×1000）/（12.9×sv×p）式中 a/min=每分種半自動生化儀讀出吸光度值的差值 tv=總反應(yīng)體積（ml） sv=樣本體積（ml） 12.9=重氮色素在405nm處的毫摩爾吸光系數(shù) p=比色杯光徑（cm）4 統(tǒng)計學(xué)處理數(shù)據(jù)以 ± s表示，用t-test檢驗差異的顯著性。二 結(jié)果（一）小鼠的一般情況空白組小鼠較溫順，毛色光澤；模型組與各給藥組部分小鼠毛發(fā)蓬松，且有部分出現(xiàn)皮膚腫脹（連續(xù)皮下給予丙酸睪酮所致）；從墊料的干濕程度觀察，模型組和給藥組較空白組濕得快，且模型組

13、較給藥組濕得快；進食量及飲水量各組間無明顯區(qū)別。（二）對小鼠前列腺濕重及前列腺指數(shù)的影響結(jié)果表明，與空白組比較，前列腺濕重和前列腺指數(shù)有顯著性差異（p<0.05），說明造模成功；與模型組比較，益腎克癃方水提醇沉樣液高劑量組和低劑量組前列腺濕重和前列腺指數(shù)均有下降，其中高劑量組差異具有顯著性差異（p<0.05）。詳見表1-1。表明益腎克癃方有抗前列腺增生的作用。表1-1 對小鼠前列腺濕重及前列腺指數(shù)的影響（ ± s，n=12）組別劑量（g/kg）最初體重（g）最后體重（g）前列腺濕重（mg）前列腺指數(shù)（mg/g）空白組24.10±1.7332.67±1.

14、8582.37±8.512.52±0.24模型組25.47±1.0132.87±1.70104.98±12.59*3.20±0.40*愛普列特組0.00523.90±0.7332.32±1.34100.21±17.82*3.12±0.56*高劑量組3925.25±1.6834.24±1.8590.93±20.11#2.66±0.59#低劑量組19.524.54±0.9632.90±1.4895.98±20.85*2.93

15、77;0.74*注：與空白組比較，*p<0.05，* p<0.01；與模型組比較，#p<0.05，# p<0.01（三）對小鼠血清中總酸性磷酸酶（acp）水平的影響實驗動物血液中acp的組織來源為前列腺、脾、肝、胃、腎、紅細胞、白細胞、血小板，但前列腺acp含量高于其他組織數(shù)百倍。結(jié)果表明，與模型組比較，益腎克癃方水提醇沉樣液高劑量組和低劑量組血清中acp水平均有明顯下降（p<0.05）。詳見表1-2。表1-2 對小鼠血清中acp的影響（ ± s，n=12）組別劑量（g/kg）acp（u/l）空白組3.38±1.24模型組4.15±0

16、.97愛普列特組0.0052.95±0.80#益腎克癃方高劑量組392.77±1.00#益腎克癃方低劑量組19.53.33±0.92#注：與模型組比較，#p<0.05，# p<0.01 三 分析與討論良性前列腺增生（benign prostate hyperplasia,bph）,是中老年男性的一種常見疾病，發(fā)病率隨年齡增大而升高。據(jù)報道50歲以上男性bph發(fā)病率超過50%，病理性bph發(fā)病率幾乎達標100%12。關(guān)于bph的治療分為藥物治療、手術(shù)治療和非手術(shù)介入治療。藥物治療主要是針對尿路梗阻的兩大因素即動力因素和靜力因素，從而減輕或緩解bph患者的

17、病情，藥物治療可分為-受體阻斷劑，雄激素抑制劑及其他藥物等。一般來說-受體阻斷劑主要用于前列腺腺體、前列腺包膜及膀胱頸部的平滑肌肌張力增加引起的不同程度的梗阻癥狀即動力因素。而雄激素抑制劑例如5-還原酶抑制劑主要用于因前列腺體積增大引起的bph即靜力因素。愛普列特為選擇性的和非競爭性的類固醇型5-還原酶抑制劑，用于治療良性前列腺增生癥，其作用機理是通過抑制睪酮轉(zhuǎn)化為雙氫睪酮而降低前列腺腺體內(nèi)雙氫睪酮的含量，導(dǎo)致增生的前列腺萎縮。但其不良反應(yīng)較多，可見惡心、食欲減退、腹脹、腹瀉、口干、頭暈、失眠、全身乏力、皮疹、性欲下降、勃起功能障礙、射精質(zhì)量下降、耳鳴、耳塞、髖部痛等。中藥在治療前列腺增生方面

18、積累了豐富的經(jīng)驗，在辨證審因的基礎(chǔ)上選擇合適的藥物，并按照一定的配伍組成原則組成的復(fù)方具有化學(xué)成分多樣、藥理作用多層次多靶點的特點，使其不僅對前列腺增生癥有顯著的療效，還能改善由前列腺增生引起的并發(fā)癥。前列腺增生癥是由前列腺組織病理性增大而導(dǎo)致的疾病，正常人體前列腺橫徑約4厘米，縱徑約3厘米，前后徑2厘米，前列腺重量約20克。當發(fā)生前列腺增生時，前列腺的體積變大，橫徑、縱徑及前后徑均有不同程度的增大，重量增加至40克以上，有的可達200克。隨著前列腺體積的增大，壓迫膀胱及尿道，產(chǎn)生排尿困難，尿頻，尿潴留等癥狀13。選擇測量前列腺組織的濕重、指數(shù)，可以直觀地顯示出前列腺組織增大的情況。益腎克癃方

19、高、低劑量組與模型組比較，能明顯抑制實驗小鼠前列腺的增生，前列腺濕重和前列腺指數(shù)顯著降低，同時能顯著降低模型小鼠血清中酸性磷酸酶的水平。四 小結(jié)本實驗采用丙酸睪丸酮誘導(dǎo)形成實驗性小鼠前列腺增生模型，以前列腺濕重、前列腺指數(shù)和血清中acp為評價指標，對益腎克癃方的療效進行初步評價。結(jié)果表明益腎克癃方具有較好的抗實驗性小鼠前列腺增生作用，能顯著降低模型小鼠前列腺濕重、前列腺指數(shù)和血清中acp水平。第二部分 益腎克癃方抗去勢大鼠前列腺增生作用及其作用機制初步研究實驗一 益腎克癃方抗去勢大鼠前列腺增生作用研究一 材料與方法（一）實驗動物健康清潔級雄性sd大鼠 ( 180 220 g )，由浙江中醫(yī)藥大

20、學(xué)實驗動物中心提供，動物合格證號：scxk(浙)2003-0001（二）藥材與化學(xué)試劑1 藥材馬鞭草：藥材購自浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥飲片廠，經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)張如松教授鑒定為馬鞭草科植物馬鞭草verbena officinalis l.的地上部分，符合中國藥典2005版一部有關(guān)項下的要求。玄參：藥材購自浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥飲片廠，經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)張如松教授鑒定為玄參科植物玄參scrophularia ningpoensis hernsl.的干燥根，符合中國藥典2005版一部有關(guān)項下的要求。 何首烏：藥材購自浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥飲片廠，經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)張如松教授鑒定為蓼科植物何首烏polygonum mu

21、ltiflorum thunbl.的干燥塊根，符合中國藥典2005版一部有關(guān)項下的要求。處方中其他藥材均購自浙江浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥飲片廠，經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)張如松教授鑒定均符合中國藥典2005版一部有關(guān)項下的要求。2 藥品與化學(xué)試劑愛普列特（epristeride tablets），江蘇聯(lián)環(huán)藥業(yè)股份有限公司，批號：20100901丙酸睪酮注射液（tp），上海通用藥業(yè)股份有限公司，批號：100401普樂安膠囊（前列康），浙江康恩貝制藥股份有限公司，批號：10061595%乙醇（分析純），杭州長征化工廠，批號：20051014氯化鈉（分析純），上海試四赫維化學(xué)試劑有限公司，批號：081014酸性磷酸

22、酶（acp）試劑盒，上海復(fù)星長征醫(yī)學(xué)科學(xué)有限公司，批號：p100550橄欖油（分析純），國藥集團化學(xué)試劑有限公司，批號：f20070625水合氯醛（分析純），上海試四赫維化學(xué)試劑有限公司，批號：071014注射用青霉素鈉，江西東風(fēng)藥業(yè)股份有限公司，批號：100302-2氯化鈉注射液，杭州民生藥業(yè)集團有限公司，批號：40908274甲醛溶液（分析純），衢州巨化試劑有限公司，批號：20080403 （三）實驗儀器電子天平：ab104-n型，瑞士mettler toledo公司離心機：80-2b型，上海安亭科學(xué)儀器廠自動雙重純水蒸餾器，d1810c，上海申勝生物科技有限公司電子調(diào)溫電熱套：98-1-

23、b型，天津市泰斯特儀器有限公司半自動生化儀：738plus型，上海安泰分析儀器有限公司旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：bÜchi rotavapor r-200型，瑞士bÜchi公司旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：bÜchi rotavapor r-220型，瑞士bÜchi公司冰箱：hr-231cry型，杭州華日電冰箱有限公司senco-w201恒溫水浴鍋：上海申生科技有限公司ahz-d循環(huán)水式真空泵：鞏義市英峪予華儀器廠dlsb-10130低溫冷卻循環(huán)泵：鞏義市京華儀器有限公司電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：dhg-9140型，上海一桓科技有限公司超聲波清洗器：kq5200，昆山市超聲儀器有限公司大鼠灌

24、胃器、5ml注射器、燒杯、量筒等（四）實驗方法1 藥物的制備（1）取23個處方量藥材，加12倍量的水，提取三次，每次1小時，過濾，濾液減壓濃縮至一定濃度，加入95%乙醇至乙醇濃度為60%，放置12小時后，濾過，濾液減壓濃縮至無醇味后，加水稀釋至一定濃度。（2）愛普列特500mg，加水至1000ml，配成0. 5mg/ml的溶液。（3）前列康70g，加水至1000ml，配成0.07g/ml的溶液。（4）丙酸睪丸酮注射液（25mg/ml）120ml，加橄欖油至1200ml，配成2.5mg/ml的溶液。2 動物分組、造模14和給藥70只sd大鼠常規(guī)飼養(yǎng)熟悉一周后，選取10只作為空白組，其余60只造模

25、，每只腹腔注射10%的水合氯醛溶液0.7ml，常規(guī)消毒皮膚，于無菌條件下，空白組做假手術(shù)處理，造模組經(jīng)陰囊摘除雙側(cè)睪丸，殘端處結(jié)扎，以確保止血，縫合皮膚，肌肉注射青霉素20萬u/kg。選取造模后的大鼠50只，隨機分為5組，分別為模型組、愛普列特組、前列康組、益腎克癃方高劑量組、益腎克癃方低劑量組。從去勢第8天起，造模組大鼠每日皮下注射丙酸睪酮的橄欖油溶液5 mg/kg/d，連續(xù)30天；從去勢第8天起，愛普列特組灌胃給予愛普列特5 mg/kg，前列康組灌胃給予0.7g/kg，高劑量組灌胃給予水提醇沉樣液29.3g/kg，低劑量組灌胃給予水提醇沉樣液14.6g/kg，同時空白組和模型組灌胃給予生理

26、鹽水，1次/d，連續(xù)30d。 3 實驗評價指標及測定方法 （1）大鼠一般情況的觀察每天觀察大鼠的一般情況，包括飲食變化，行為（自主活動，精神狀態(tài)），毛發(fā)變化及排尿情況。（2）大鼠前列腺濕重及指數(shù)的測定于末次次給藥24h后，內(nèi)眥眼眶取血，并立即摘取前列腺，稱得濕重，測定各組的前列腺濕重和前列腺指數(shù)（前列腺重量/大鼠體重×1000）。（3）血清中總酸性磷酸酶（acp）和前列腺特異性酸性磷酸酶（pacp）含量的測定取血后靜置30min，血液凝固后，4000 rpm / min 離心 20 min，取上層血清，按試劑盒操作，應(yīng)用半自動生化儀測定acp水平。測定原理及計算方法同測定小鼠血清中酸

27、性磷酸酶相同。再用l-酒石酸法比色測定非前列腺特異性酸性磷酸酶（npap），前列腺特異性酸性磷酸酶（pap）=acp-npap11,15。（4）前列腺組織he染色觀察及增生程度評分將取下的前列腺組織，用福爾馬林（10%的甲醛溶液）固定，4冰箱保存，石蠟包埋，切片，厚4m，經(jīng)蘇木精-伊紅染色(he染色)后光鏡觀察前列腺組織細胞結(jié)構(gòu)變化。并進行增生等級評分（未見增生為0分，可見增生則按照明顯程度分為0.5、1、1.5、2、2.5、3分，增生越明顯則分值越大）。（5）腺體上皮細胞高度及腺腔皺褶指數(shù)的測定 將腺體組織切片在放大100倍的顯微鏡下各隨機取三個視野進行拍照，結(jié)合motic軟件對照片測量分析

28、，計算大鼠前列腺腺體的上皮細胞高度（腺管面積-腺腔面積）/腺管周長和腺腔皺褶指數(shù)（腺腔周長/腺腔面積×1000）。4 統(tǒng)計學(xué)處理數(shù)據(jù)以 ± s表示，用t-test檢驗差異的顯著性。二 結(jié)果（一）大鼠的一般情況剛剛做完手術(shù)后大鼠狀態(tài)較差，但恢復(fù)一周后狀態(tài)良好，其中空白組大鼠較溫順，毛色光澤；模型組與各給藥組部分大鼠毛發(fā)蓬松，且有部分出現(xiàn)皮膚腫脹（連續(xù)皮下給予丙酸睪酮所致）；從墊料的干濕程度觀察，模型組和給藥組較空白組濕的快，且模型組較給藥組濕得快；進食量及飲水量各組間無明顯區(qū)別。（二）對去勢大鼠前列腺濕重及前列腺指數(shù)的影響結(jié)果表明，與空白組比較，愛普列特組、前列康組、2個劑量

29、組前列腺濕重和前列腺指數(shù)均有顯著性差異（p<0.05），說明造模成功；與模型組比較，益腎克癃方水提醇沉樣液高劑量組和低劑量組前列腺濕重和前列腺指數(shù)均有明顯下降，且差異均具有顯著性差異（p<0.05）。詳見表2-1。表明益腎克癃方有抗前列腺增生的作用。表2-1 對去勢大鼠前列腺濕重及前列腺指數(shù)的影響（ ± s，n=11）組別劑量（g/kg）最初體重（g）最后體重（g）前列腺濕重（g）前列腺指數(shù)（mg/g）空白組274.0±8.1359.5±24.30.5685±0.06741.59±0.30模型組217.7±10.7351.

30、7±14.91.1269±0.0369*3.21±0.34*愛普列特組0.005261.1±11.9345.2±19.00.9257±0.0462*,#2.68±0.34*,#前列康組0.7265.9±9.4343.7±19.30.8858±0.0967*,#2.58±0.50*,#高劑量組29.3265.2±8.5315.2±19.10.8434±0.0097*,#2.68±0.26*,#低劑量組14.6264.5±9.1338.5&

31、#177;18.20.9380±0.1080*,#2.78±0.41*,#注：與空白組比較，*p<0.05，* p<0.01；與模型組比較，#p<0.05，# p<0.01（三）對去勢大鼠血清中總酸性磷酸酶（acp）水平和前列腺特異性酸性磷酸酶（pacp）水平的影響實驗動物血液中acp的組織來源為前列腺、脾、肝、胃、腎、紅細胞、白細胞、血小板，但前列腺acp含量高于其他組織數(shù)百倍。結(jié)果表明，與模型組比較，益腎克癃方水提醇沉樣液高劑量組血清中acp水平均有明顯下降（p<0.05）；益腎克癃方水提醇沉樣液高劑量組血清中pacp水平明顯下降（p<

32、;0.05）。詳見表2-2。表2-2 對去勢大鼠血清中acp和pacp水平的影響（ ± s，n=11）組別劑量（g/kg）acp（u/l）pacp（u/l）空白組12.43±1.926.55±1.87模型組14.93±2.7011.80±3.61*愛普列特組0.00514.29±2.099.29±1.85*前列康組0.714.66±2.338.53±1.92高劑量組29.39.53±1.58*,#6.85±3.72#低劑量組14.612.67±1.90*8.33±1

33、.72注：與空白組比較，*p<0.05，* p<0.01；與模型組比較，#p<0.05，# p<0.01（四）對去勢大鼠前列腺組織切片光鏡下形態(tài)學(xué)的影響空白組前列腺腺腔正常大小，腔內(nèi)表面光滑，腺上皮細胞呈立方型或短柱型(見附圖1a)。模型組前列腺腺體排列緊密，腺腔大小不一，大部分腺體基本完整，鋸齒樣擴張明顯，大部分呈乳頭狀突向腺腔內(nèi)，腔內(nèi)可見粉染物質(zhì)，上皮細胞以透亮細胞為主，呈柱狀復(fù)層或假復(fù)層，至少兩層以上 (見附圖1b)。益腎克癃方高劑量組（見附圖1c）、益腎克癃方低劑量組（見附圖1d）愛普列特組（見附圖1e）、前列康組（見附圖1f）、部分或小部分腺腔變大，腺體小部分

34、呈鋸齒狀擴張及乳頭狀增生，腺上皮細胞多為單層柱狀，兼有高柱狀及短柱狀。增生程度等級評分的結(jié)果見表2-3。表2-3 對去勢大鼠前列腺組織增生程度的影響（ ± s，n=11）組別劑量（g/kg）動物數(shù)（只）增生程度評分（分）0分0.5分1分1.5分2分2.5分3分空白組14220000.78±0.51模型組00331211.75±0.72*愛普列特組0.00502540001.09±0.38#前列康組0.701441001.25±0.42*高劑量組29.311431001.10±0.57#低劑量組14.602351001.23±

35、0.47注：與空白組比較，*p<0.05，* p<0.01；與模型組比較，#p<0.05，# p<0.01（五）對去勢大鼠腺體上皮細胞高度及腺腔褶皺指數(shù)的影響實驗結(jié)果表明，與模型組比較，愛普列特組、益腎克癃方高劑量組上皮細胞高度和腺腔褶皺指數(shù)均有明顯下降（p<0.05）。詳見表2-4表2-4 對去勢大鼠上皮細胞高度及腺腔皺褶指數(shù)的影響（ ± s，n=11）組別劑量（g/kg）上皮細胞高度(m)腺腔褶皺指數(shù)（10-3/m）空白組74.14±10.3711.69±3.64模型組89.34±10.46*12.17±5.3

36、4*愛普列特組0.00567.64±9.90#9.21±2.44#前列康組0.785.46±17.6611.28±3.85高劑量組29.367.94±10.83#10.65±3.25#低劑量組14.683.30±24.4911.19±4.78注：與空白組比較，*p<0.05，* p<0.01；與模型組比較，#p<0.05，# p<0.01三 分析與討論（一）前列腺增生模型的選擇前列腺形態(tài)和機能的維持依賴于雄激素，故大鼠去勢后由于睪酮的分泌障礙可導(dǎo)致前列腺組織的萎縮，而在人為注射睪酮后繼續(xù)生長

37、，而且與劑量大小和時間長短有密切關(guān)系16,17。因此本實驗采用大鼠睪丸切除術(shù)后，注射睪酮的方法誘導(dǎo)建立大鼠前列腺增生模型。（二）對酸性磷酸酶（acp）和前列腺特異性酸性磷酸酶（pacp）的影響 酸性磷酸酶增高常見于前列腺癌、前列腺增生、前列腺炎等疾病。人體中有4種形式的acp，來源于紅細胞、溶酶體、破骨細胞及前列腺。淋巴細胞、血小板所含的acp與溶酶體型相似；粒細胞、胰腺所含的acp與前列腺acp相似；高雪氏細胞、多毛白血病細胞、巨細胞骨癌細胞所含的acp與破骨細胞acp型相似。血液中的acp的組織來源為前列腺、脾、肝、胃、腎、紅細胞、白細胞、血小板，但前列腺acp含量高于其他組織數(shù)百倍。所以

38、一般血清總acp增高與pacp增高是一致的，但為排除其他原因引起的增高，在總acp增高時測pacp是必要的。益腎克癃方主要由玄參、丹參、何首烏、淫羊藿等組成，臨床研究表明，治療前列腺增生癥有很好的療效。本實驗進一步研究表明該中藥復(fù)方能夠抑制實驗性前列腺增生大鼠模型血清acp和pacp活性的升高。由于血清中pacp主要來自前列腺組織，故血清中pacp活性的變化可以反應(yīng)前列腺狀態(tài)15。前列腺組織增生加強，血清中acp和pacp升高。實驗顯示高劑量和低劑量益腎克癃方可明顯抑制血清acp和pacp升高，因而說明益腎克癃方對前列腺組織生長的抑制作用，而且實驗結(jié)果益腎克癃方的作用優(yōu)于陽性藥愛普列特和前列康

39、。（三）對前列腺組織的影響 前列腺的主要組織成分為腺體和間質(zhì)，腺體為復(fù)合管泡狀腺，間質(zhì)由平滑肌、纖維基質(zhì)、血管、神經(jīng)等組織構(gòu)成18。前列腺增生是由間質(zhì)和上皮依不同比例混合增生的疾病，又分為基質(zhì)增生、纖維肌肉增生、肌肉增生、纖維腺瘤增生、腺瘤樣增生，其中以纖維肌肉腺瘤增生最為常見19。本研究采用sd大鼠去勢后皮下注射丙酸睪丸酮法復(fù)制前列腺增生模型，顯微鏡下及形態(tài)定量學(xué)均表明：丙酸睪丸酮所致去勢大鼠前列腺組織的腺體與間質(zhì)組織均增生，而以腺體增生為主，主要表現(xiàn)為腺腔擴張、體積增大、腺上皮數(shù)目增多，這與人增生前列腺組織的病理變化相似。本研究發(fā)現(xiàn)：益腎克癃方治療一個月，增生的腺上皮乳頭減少或消失，前列腺

40、上皮細胞萎縮，高度降低，變得較為扁平及腺體萎縮，間質(zhì)減少。應(yīng)用形態(tài)計量學(xué)對bph大鼠及正常大鼠前列腺組織的h.e.染色切片，進行半定量分析結(jié)果表明：模型組大鼠前列腺組織上皮細胞高度和腺腔褶皺指數(shù)比正常對照組均明顯增高，提示大鼠前列腺增生主要是因前列腺腺體的擴張、體積的增大所致。益腎克癃方治療組則使增生腺體萎縮，上皮細胞高度和腺腔褶皺指數(shù)變小，這些提示：益腎克癃方可抑制前列腺組織結(jié)構(gòu)性變化，有明顯的抗bph的作用，益腎克癃方高劑量組與愛普列特組比較，兩者效應(yīng)相似。四 小結(jié)本實驗采用丙酸睪丸酮誘導(dǎo)去勢大鼠形成前列腺增生模型，以大鼠前列腺濕重、前列腺指數(shù)、血清acp和pacp以及前列腺組織形態(tài)學(xué)的改

41、變?yōu)橹笜?，對益腎克癃方抗大鼠前列腺增生作用進行了評價。結(jié)果表明：1、益腎克癃方具有明顯的抗前列腺增生作用，不僅能顯著降低模型大鼠前列腺指數(shù)和前列腺濕重，而且能顯著降低模型大鼠血清中acp和 pacp的含量。其中益腎克癃方高劑量組（29.3g/ kg）無論是在降低前列腺濕重還是在降低血清中acp和pacp的水平中效果均優(yōu)于陽性藥愛普列特（0.005 g/ kg）及前列康（0.7 g/ kg）。2、益腎克癃方對模型大鼠前列腺組織形態(tài)學(xué)的改變具有明顯的改善作用，其中益腎克癃方高劑量組的效果與陽性藥愛普列特相似。實驗二 益腎克癃方對去勢大鼠前列腺增生作用機制及并發(fā)癥相關(guān)指標的初步研究一 材料與方法（一

42、）實驗動物健康清潔級雄性sd大鼠 ( 180 220 g )，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，動物合格證號：scxk(浙)2003-0001（二）藥材與化學(xué)試劑1 藥材馬鞭草、玄參、何首烏等處方中藥材均購自浙江浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥飲片廠，經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)張如松教授鑒定均符合中國藥典2005版一部有關(guān)項下的要求。2 藥品與化學(xué)試劑大鼠睪酮（t）elisa測定試劑盒：上海卓康(hyperheal)生物科技有限公司大鼠雌二醇（e2）elisa測定試劑盒，上海卓康(hyperheal)生物科技有限公司丙二醛（mda）試劑盒，南京建成生物工程研究所，批號：20101220一氧化氮（no）試劑盒，南京建成

43、生物工程研究所，批號：20101215考馬斯亮蘭蛋白測得試劑盒：南京建成生物工程研究所其余藥品和試劑同第二部分實驗一（三）實驗儀器超低溫冰箱：forma -86c 型，therom 公司培養(yǎng)箱：series water jacketed co2 incubator，therom 公司酶標儀：m680型，bio-rad公司紫外可見分光光度計：ultrospec 3300pro型，amersham公司可調(diào)微量加樣槍：thermo公司其他儀器設(shè)備同第二部分實驗一（四）實驗方法1 藥物的制備同第二部分實驗一2 動物分組、造模和給藥同第二部分實驗一3 實驗評價指標及測定方法 （1）大鼠血清中睪酮（t）、

44、雌二醇（e2）、t/e2水平的測定于末次次給藥24h后，內(nèi)眥眼眶取血，取血后靜置30min，血液凝固后，于4000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘，取上層血清測定t及e2含量。再計算出t/e2的水平。睪酮（t）測定原理：采用競爭法酶聯(lián)免疫吸附試劑盒測定。試劑盒中將抗ne抗體包被在微孔板上，酶聯(lián)親和物中含有標記了過氧化物酶的ne。實驗過程中，標準品、待測樣本中的ne與標記有酶聯(lián)親和物的ne共同競爭反應(yīng)板上包被的抗ne抗體的定量結(jié)合位點。反應(yīng)后沖洗掉為結(jié)合的部分，再加入底物反應(yīng)，底物在酶的作用下變?yōu)樗{色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。通過比較待測樣本與ne標準品的吸光度，可準確測得樣本中的t含量。實驗過程：參

45、考試劑盒說明書，按下列步驟進行：試驗前將試劑盒及待測標本放置室溫18-28平衡30min以上；取出預(yù)包被抗體的微孔板，設(shè)立空白孔，依序加入100l的標準品；樣品編號，依序加入100l的樣品上清液；在標準品孔及待測樣本孔中分別加入50l酶聯(lián)親和物，充分混勻；37溫浴60min后，充分棄盡各孔內(nèi)液體，用稀釋好的洗滌液（1：10倍蒸餾水稀釋）反復(fù)沖洗5次并扣干孔內(nèi)剩余水分；每孔依照次序，分別加入顯色液a、顯色液b各50l，充分混勻，在室溫下避光反應(yīng)15min； 反應(yīng)過后（正常情況下應(yīng)為藍色并帶有明顯的梯度）每孔加入50l的終止液，輕輕振蕩后充分混勻（正常情況下應(yīng)轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色），終止反應(yīng)；顯色反應(yīng)后在3

46、0min內(nèi)于酶標儀450nm處測定od值；根據(jù)標準曲線，計算t的含量。雌二醇（e2）的測定原理和實驗過程同睪酮（t）。（2）大鼠前列腺組織中丙二醛（mda）和一氧化氮（no）含量的測定1） 硝酸還原酶法測定大鼠前列腺組織中no的含量硝酸還原酶法測定組織中no的含量測定主要分兩步進行。第一步，測定組織中no的吸光度；第二步，測定組織的蛋白含量。然后根據(jù)下式計算no的含量：no含量=（mol/gprot）測定管吸光度-空白管吸光度標準管吸光度-空白管吸光度×標準品濃度（20mol/l*）樣本的蛋白含量（gprot/l）（20mol/l）÷ 注：*測定時標準管中加入0.4ml蒸餾

47、水及0.1ml的100mol/l kno3標準液，相當5倍稀釋，所以此處標準濃度為20mol/l。 組織中no吸光度的測定樣本準備：取大鼠前列腺組織，置于玻璃勻漿管中，加入適量的冰的生理鹽水進行勻漿，充分研磨，使腦組織勻漿化，制成10%的組織勻漿液，勻漿液2000rpm，離心10min，取上清，用以測定組織中no的吸光度。另取10l腦組織勻漿上清液用生理鹽水按1：9稀釋成1%的組織勻漿液，用以測定組織蛋白含量。測定原理：no的化學(xué)性質(zhì)活潑，在體內(nèi)代謝很快轉(zhuǎn)化為硝酸鹽（no3-）和亞硝酸鹽（no2-），而no2-很快轉(zhuǎn)化為no3-，本法利用硝酸還原酶特異性將no3-還原為no2-，通過顯色深淺測

48、定其濃度高低。實驗過程：試劑及其配制按試劑盒說明書進行，按下列表格進行操作：空白管標準管測定管雙蒸水（ml）0.50.4100mol/l標準應(yīng)用液（ml）0.1樣本（ml）0.5混合試劑（ml）0.40.40.4混勻，37準確水浴60min試劑三（ml）0.20.20.2試劑四（ml）0.10.10.1充分旋渦混勻30s，室溫靜置40min，3500-4000r/min，離心10min，取上清顯色上清（ml）0.80.80.8顯色劑（ml）0.60.60.6混勻，室溫靜置10min，蒸餾水調(diào)零，550nm，0.5cm光徑，測各管吸光度值 考馬斯亮蘭法測定組織的蛋白含量測定原理：蛋白質(zhì)分子具有-

49、nh3+基團，當棕紅色的考馬斯亮蘭顯色劑加入蛋白標準液或樣品中時，考馬斯亮蘭染料上的陰離子與蛋白nh3+結(jié)合，使溶液變?yōu)樗{色，通過測定吸光度可計算出蛋白含量。實驗過程：試劑及其配制按試劑盒說明書進行，按下列表格進行操作：空白管標準管測定管蒸餾水（ml）0.050.563g/l標準液（ml）0.05樣品（ml）0.05考馬斯亮蘭顯色劑（ml）3.03.03.0混勻，靜置10min，于595nm處，1cm光徑，蒸餾水調(diào)零，測定各管吸光度值，并按下式計算蛋白含量（g/l）蛋白含量（g/l）=測定管吸光度-空白管吸光度標準管吸光度-空白管吸光度×標準管濃度（g/l）2）大鼠前列腺組織中mda

50、的含量組織中mda的含量測定主要分兩步進行。第一步，測定組織中mda的吸光度；第二步，測定組織的蛋白含量。然后根據(jù)下式計算mda的含量：mda含量=（nmol/mgprot）測定管吸光度-空白管吸光度標準管吸光度-空白管吸光度×標準品濃度（20nmol/l*）樣本的蛋白含量（mgprot/ml）（20mol/l）÷ 組織中mda吸光度的測定樣本準備：同1）部分中組織中no吸光度的測定中的樣本準備測定原理：過氧化脂質(zhì)降解產(chǎn)物中的丙二醛（mda）可與硫代巴比妥酸（tba）* 縮合，形成紅色產(chǎn)物，在532nm處有最大吸收峰。* 因底物為硫代巴比妥酸（thibabituric ac

51、id tba）所以此法稱tba法。實驗過程：試劑及其配制按試劑盒說明書進行，按下列表格進行操作：標準管標準空白管測定管測定空白管10nmol/ml標準品（ml）0.1無水乙醇（ml）0.1測試樣品（ml）0.10.1試劑一（ml）0.10.10.10.1混勻（搖動幾下試管架）試劑二（ml）3333試劑三（ml）11150%冰醋酸（ml）1漩渦混勻器混勻，試管口用保鮮膜扎緊，用針頭刺一小孔，95水浴40min，取出后流水冷卻，然后3500轉(zhuǎn)/分，離心10分鐘。取上清液，532nm處，1cm光徑，蒸餾水調(diào)零，測各管吸光度值。（3）大鼠精囊濕重及其指數(shù)的測定：末次給藥24小時后，準確稱取大鼠體重后，

52、處死大鼠，打開腹腔，取出精囊，稱其濕重。以兩側(cè)精囊總濕重/體重得出大鼠精囊指數(shù)。（4）腎指數(shù)和肝指數(shù)的測定：末次給藥24小時后，準確稱取大鼠體重后，處死大鼠，打開腹腔，取出腎臟和肝臟，分別稱其濕重。以兩腎總濕重/體重得出大鼠腎指數(shù)，以肝總濕重/體重得出大鼠肝指數(shù)。（5）腎he染色：腎組織取出后，浸泡于福爾馬林中，石蠟包埋，切片，蘇木伊紅染色。4 統(tǒng)計學(xué)處理數(shù)據(jù)以 ± s表示，用t-test檢驗差異的顯著性。二 結(jié)果（一）對去勢大鼠血清中睪酮（t）、雌二醇（e2）的影響 從下表可以看出，與空白組相比，模型組血清中睪酮的含量顯著升高（p<0.01），可能去皮下注射丙酸睪丸酮注射液有

53、關(guān)，而雌二醇水平與空白組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義，表明在去勢條件下，通過皮下注射丙酸睪丸酮注射液，可使大鼠體內(nèi)睪酮含量顯著升高，而對雌二醇水平無明顯影響，使大鼠的前列腺組織在外源性雄激素的作用下出現(xiàn)增生。與模型組相比，愛普列特組、前列康組、益腎克癃方高劑量組均可顯著降低模型大鼠血清中的睪酮水平（p<0.01），益腎克癃方高劑量組大鼠血清中雌二醇水平與模型組相比顯著降低（p<0.01），與空白組相比也顯著降低（p<0.05）。實驗結(jié)果提示益腎克癃方抑制模型大鼠前列腺增生作用機制可能與其降低雄激素、雌激素水平有關(guān)，使模型大鼠體內(nèi)嚴重失衡的雌、雄激素比例得到改善，從而發(fā)揮抗前列腺增生作

54、用。睪酮（t）的標準曲線：y=-3.4848x+0.2847 r2=0.9976雌二醇（e2）的標準曲線：y=-2.017x+5.842 r2=0.9799表2-5 對去勢大鼠血清中睪酮（t）、雌二醇（e2）的影響（ ± s，n=11）組別劑量（g/kg）睪酮（t,ng/ml）雌二醇（e2,pg/ml）空白組1.13±0.10456.06±91.64模型組1.22±0.09*588.98±142.04愛普列特組0.0051.07±0.07#541.95±86.82前列康組0.70.96±0.08#461.69

55、77;140.85高劑量組29.30.94±0.08*,# 304.90±105.70*,#低劑量組14.61.11±0.18482.73±132.75注：與空白組比較，*p<0.05，* p<0.01；與模型組比較，#p<0.05，# p<0.01（二）對去勢大鼠前列腺組織中丙二醛（mda）和一氧化氮（no）含量的影響結(jié)果見表2-6：模型組與空白組相比大鼠前列腺組織中mda含量無顯著性差異（p>0.05），且愛普列特組、前列康組、益腎克癃方高、低劑量阻與模型組、空白組比較也無顯著性差異（p>0.05）。提示前列腺增生

56、并未引起前列腺組織的過氧化傷害。模型組與空白組相比大鼠前列腺組織中no含量有顯著性差異（p<0.05），且愛普列特組、前列康組、益腎克癃方高、低劑量組劑量組與模型組比較也有顯著性差異（p<0.05）。提示丙酸睪丸酮致去勢大鼠前列腺增生的過程中對大鼠前列腺組織有損害作用，益腎克癃方可對抗這種傷害，并且益腎克癃方高、低劑量組的對抗作用均強于陽性對照藥愛普列特、前列康。表2-6 對去勢大鼠前列腺組織中mda和no的影響（ ± s，n=11）組別劑量（g/kg）mda（mol/gprot）no（mol/gprot）空白組1.299±0.24732.227±1.

57、0223模型組1.167±0.14693.536±1.3265*愛普列特組0.0051.161±0.17681.482±0.6982#前列康組0.71.209±0.19742.197±0.5683#高劑量組29.31.192±0.20210.636±0.2126*,#低劑量組14.61.269±0.45401.122±0.6977*,#注：與空白組比較，*p<0.05，* p<0.01；與模型組比較，#p<0.05，# p<0.01（三）對去勢大鼠精囊腺濕重及其指數(shù)的影響 結(jié)果表明，與空白組比較，模型組、愛普列特