基因的定位克隆知識(shí)探索

1、 基因的定位克隆1風(fēng)音書屋千奇百怪的突變體這些突變體是怎么產(chǎn)生的呢？這些突變體是怎么產(chǎn)生的呢？突變體突變體:是某個(gè)性狀發(fā)生可遺傳變異的材料，或某個(gè)基因發(fā)生突變的材料。水稻水稻2風(fēng)音書屋（mapping）：3風(fēng)音書屋一、連鎖分析（一、連鎖分析（linkage analysislinkage analysis）1 1）概念：）概念： 基因定位的連鎖分析是根據(jù)基因在染色體基因定位的連鎖分析是根據(jù)基因在染色體上呈直線排列，不同基因相互連鎖成連鎖群的上呈直線排列，不同基因相互連鎖成連鎖群的原理，即應(yīng)用被定位的基因與同一染色體上另原理，即應(yīng)用被定位的基因與同一染色體上另一基因或遺傳標(biāo)記相連鎖的特點(diǎn)進(jìn)行定位

2、。一基因或遺傳標(biāo)記相連鎖的特點(diǎn)進(jìn)行定位。4風(fēng)音書屋2 2）重組值（）重組值（recombination fractionrecombination fraction） 是基因定位時(shí)兩個(gè)基因間遺傳圖距的量度，即基因間的遺傳距離。如果兩個(gè)基因間有1%的重組值，其遺傳圖的距離為1厘摩。（centimorgancentimorgan，cmcm）交換值交換值(rf)(%)=重組重組型的配子數(shù)型的配子數(shù)/總配子數(shù)總配子數(shù)100% 重組值越大，說明兩基因間的距離越遠(yuǎn)，基因間的連重組值越大，說明兩基因間的距離越遠(yuǎn)，基因間的連鎖強(qiáng)度越??；重組值越小，說明基因間的距離越近，基因鎖強(qiáng)度越小；重組值越小，說明基因間的

3、距離越近，基因間的連鎖強(qiáng)度越大。間的連鎖強(qiáng)度越大。5風(fēng)音書屋 3）遺傳標(biāo)記（）遺傳標(biāo)記（genetic marker） 用連鎖分析發(fā)法進(jìn)行基因定位需要已知的用連鎖分析發(fā)法進(jìn)行基因定位需要已知的dna序列作為遺序列作為遺傳標(biāo)記，這些標(biāo)記按孟德爾方式遺傳，標(biāo)記位點(diǎn)應(yīng)是多態(tài)的。傳標(biāo)記，這些標(biāo)記按孟德爾方式遺傳，標(biāo)記位點(diǎn)應(yīng)是多態(tài)的。 4）遺傳多態(tài)性：）遺傳多態(tài)性：是指在一個(gè)遺傳座位上具有一個(gè)以上的等位是指在一個(gè)遺傳座位上具有一個(gè)以上的等位基因，且各個(gè)等位基因在群體中出現(xiàn)的頻率皆高于基因，且各個(gè)等位基因在群體中出現(xiàn)的頻率皆高于1%。6風(fēng)音書屋二、三點(diǎn)測(cè)交(three-point testcross)與染

4、色體作圖 為了進(jìn)行基因定位，摩爾根和他的學(xué)生sturtevant創(chuàng)造了三點(diǎn)測(cè)交方法，即將3個(gè)基因包括在同一次交配中。進(jìn)行這種測(cè)交，一次實(shí)驗(yàn)就等于3次兩點(diǎn)試驗(yàn)。 已知在果蠅中棘眼(ec)、截翅(ct)和橫脈缺失(cv)這3個(gè)隱性突變基因都是x連鎖的。把棘眼、截翅個(gè)體與橫脈缺失個(gè)體交配,得到3個(gè)基因的雜合體ec ct +/+ + cv (ec、ct、cv的排列不代表它們?cè)趚染色體的真實(shí)順序)，取其中3雜合體雌蠅再與3隱性體ec ct cv/y雄蠅測(cè)交，測(cè)交后代如下表。7風(fēng)音書屋序號(hào)表型實(shí)得數(shù)1ec ct +2125親本型2+ + cv22073ec + cv273單交換i型4+ ct +2655e

5、c + +217單交換ii型6+ ct cv2237+ + +5雙交換型8ec ct cv3合計(jì)5318ec ct +/ + + cv ec ct cv/y測(cè)交后代數(shù)據(jù)8風(fēng)音書屋結(jié)果分析1、歸類2、確定正確的基因順序 用雙交換型與親本類型相比較，發(fā)現(xiàn)改變了位置的那個(gè)基因一定是處于中央的位置，因?yàn)殡p交換的特點(diǎn)是旁側(cè)基因的相對(duì)位置不變，僅中間的基因發(fā)生變動(dòng)。于是可以斷定這3 個(gè)基因正確排列順序是ec cv ct。親本型ec ct + + cv雙交換型+ + +ec ct cv9風(fēng)音書屋ec ct + + cvec + ct+ cv +ct ec + + cvec + + ct cvec cv ct

6、+ + +ct + + ec cv10風(fēng)音書屋3、計(jì)算重組值，確定圖距(1)、計(jì)算ctcv的重組值 忽視表中第一列(ec/+)的存在，將它們放在括弧中，比較第二、三列：(ec) ct +2125非重組(+) + cv2207(ec) + cv273非重組(+) ct +265(ec) + +217重組(+) ct cv223(+) + +5重組(ec) ct cv3ctcv間重組率=(217+223+5+3)/5318=0.084=8.4%=8.4cm11風(fēng)音書屋(3)、計(jì)算ecct的重組值 忽視表中第三列(+/cv)的存在，將它們放在括弧中，比較第一、二列：ec ct (+)2125非重組+

7、 + (cv)2207ec + (cv)273重組+ ct (+)265ec + (+)217重組+ ct (cv)223+ + (+)5非重組ec ct (cv)3ecct間重組率=(273+265+217+223)/5318=18.4%=18.4cm12風(fēng)音書屋(2)、計(jì)算eccv的重組值 忽視表中第二列(ct/+)的存在，將它們放在括弧中，比較第一、三列：ec (ct) +2125非重組+ (+) cv2207ec (+) cv273重組+ (ct) +265ec (+) +217非重組+ (ct) cv223+ (+) +5重組ec (ct) cv3eccv間重組率=(273+265+

8、5+3)/5318=10.2%=10.2cm13風(fēng)音書屋4、繪染色體圖eccvct10.28.418.418.6在計(jì)算eccv和cvct的重組值時(shí)都利用了雙交換值，可是計(jì)算ecct時(shí)沒把它計(jì)在內(nèi)，因?yàn)樗鼈冮g雙交換的結(jié)果并不出現(xiàn)重組。所以ecct之間的實(shí)際雙交換值應(yīng)當(dāng)是重組值加2倍雙交換值。即18.4%+20.1%=18.6%。當(dāng)三點(diǎn)測(cè)交后代出現(xiàn)8種表型時(shí),表明有雙交換發(fā)生,此時(shí)需用2倍雙交換值來作校正。若3個(gè)基因相距較近，往往不出現(xiàn)雙交換類型,后代只有6種表型,無需校正。標(biāo)記標(biāo)記1標(biāo)記標(biāo)記2目標(biāo)基因目標(biāo)基因14風(fēng)音書屋 三、圖位克隆 圖位克隆（map-based cloning）又稱定位克隆，

9、該方法分離基因是根據(jù)目的基因在染色體上的位置進(jìn)行基因克隆的一種方法，其原理是根據(jù)功能基因在基因組中都有相對(duì)穩(wěn)定的基因座，在利用分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)目的基因進(jìn)行精確定位的基礎(chǔ)上，使用與目的基因緊密連鎖的分子標(biāo)記篩選dna文庫(kù)，從而構(gòu)建的基因區(qū)域的物理圖譜，再利用此物理圖譜通過染色體步行（chromosome walking）逼近目的基因或通過染色體登陸（chromosome landing）（tanksley et al.，1995）的方法最終找到包含目的基因的克隆，最后通過遺傳轉(zhuǎn)化和功能互補(bǔ)驗(yàn)證最終確定目的基因的堿基序列。15風(fēng)音書屋 圖位克隆的特點(diǎn)是無需預(yù)先知道基因的dna順序，也無需預(yù)先知道其表

10、達(dá)產(chǎn)物的有關(guān)信息，但應(yīng)有以下兩方面兩方面的基本情況。 一是一是有一個(gè)根據(jù)目的基因的有無建立起來的遺傳分離群體,即定位群體，如：f2、dh、bc、ri等。16風(fēng)音書屋 二是二是開展以下幾項(xiàng)工作：（1）首先找到與目的基因緊密連鎖的分子標(biāo)記；（2）用遺傳作圖和物理作圖將目標(biāo)基因定位在染色體上的特定位置；（3）構(gòu)建含有大插入片段的基因組文庫(kù)；（bac或yac）；（4）以與目的基因連鎖的分子標(biāo)記為探針篩選基因組文庫(kù)；（5）用獲得陽(yáng)性克隆構(gòu)建目的基因區(qū)域的重疊群；（6）通過染色體步行、登陸或跳躍獲得帶有目的基因的大片段克?。唬?）通過亞克隆獲得帶有目的基因的小片段克??；（8）通過遺傳轉(zhuǎn)化和功能互補(bǔ)驗(yàn)證最終

11、確定目標(biāo)基因的堿基序列17風(fēng)音書屋m1m2構(gòu)建遺傳圖譜構(gòu)建物理圖譜染色體步移： chromosome walking 篩選基因組文庫(kù)序列分析與功能鑒定對(duì)于基因組還未測(cè)序的物種可通過染色體步移的方法進(jìn)行定位，但是對(duì)于基因組還未測(cè)序的物種可通過染色體步移的方法進(jìn)行定位，但是比較費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而對(duì)于水稻、擬南芥等基因組測(cè)序工作已經(jīng)完成的物比較費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而對(duì)于水稻、擬南芥等基因組測(cè)序工作已經(jīng)完成的物種，則不在利用染色體步移的方法進(jìn)行定位，直接從構(gòu)建遺傳圖譜到種，則不在利用染色體步移的方法進(jìn)行定位，直接從構(gòu)建遺傳圖譜到構(gòu)建物理圖譜，最后確定目標(biāo)基因的候選基因，再通過互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行構(gòu)建物理圖譜，最后確定目標(biāo)基因

12、的候選基因，再通過互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。驗(yàn)證。18風(fēng)音書屋四、分子標(biāo)記n分子標(biāo)記是以個(gè)體間遺傳物質(zhì)內(nèi)核苷酸序列變異為基礎(chǔ)的遺傳標(biāo)記，是dna水平遺傳多態(tài)性的直接的反映。n現(xiàn)在dna分子標(biāo)記技術(shù)已有數(shù)十種，廣泛應(yīng)用于遺傳育種、基因組作圖、基因定位、物種親緣關(guān)系鑒別、基因庫(kù)構(gòu)建、基因克隆等方面。 19風(fēng)音書屋分子標(biāo)記的種類 n一、基于分子雜交技術(shù)的分子標(biāo)記技術(shù)一、基于分子雜交技術(shù)的分子標(biāo)記技術(shù)：限制性片斷限制性片斷長(zhǎng)度多態(tài)性長(zhǎng)度多態(tài)性(restriction fragment length (restriction fragment length polymorphismpolymorphism，rf

13、lprflp) )n二、基于二、基于pcrpcr技術(shù)的分子標(biāo)記技術(shù)：隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)技術(shù)的分子標(biāo)記技術(shù)：隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性性dna (random amplified polymorphism dnadna (random amplified polymorphism dna，rapdrapd ) )簡(jiǎn)單重復(fù)序列簡(jiǎn)單重復(fù)序列(simple sequence repeat(simple sequence repeat，ssrssr) )n三、基于限制性酶切和三、基于限制性酶切和pcrpcr技術(shù)的技術(shù)的dnadna標(biāo)記標(biāo)記 ：擴(kuò)增擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(amplified fragment le

14、ngth (amplified fragment length polymorphismpolymorphism，aflpaflp ) ) n四、基于四、基于dnadna芯片技術(shù)的分子標(biāo)記技術(shù)芯片技術(shù)的分子標(biāo)記技術(shù) ：核苷酸多態(tài)核苷酸多態(tài)性性(single nucleotide polymorphism(single nucleotide polymorphism，snpsnp) ) 20風(fēng)音書屋 ssr即微衛(wèi)星dna，是一類由幾個(gè)（多為1-5個(gè)）堿基組成的基序（motif）串聯(lián)重復(fù)而成的dna序列，其長(zhǎng)度一般較短，廣泛分布于基因組的不同位置，如（ca）n、（at）n、（ggc）n等重復(fù)。不同

15、遺傳材料重復(fù)次數(shù)的可變性，導(dǎo)致了ssr長(zhǎng)度的高度變異性，這一變異性正是ssr標(biāo)記產(chǎn)生的基礎(chǔ)。盡管微衛(wèi)星dna分布于整個(gè)基因組的不同位置，但其兩端序列多是保守的單拷貝序列，因此可以根據(jù)這兩端的序列設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物，通過pcr技術(shù)將其間的核心微衛(wèi)星dna序列擴(kuò)增出來，利用電泳分析技術(shù)就可獲得其長(zhǎng)度多態(tài)性，即ssr標(biāo)記。 ssr21風(fēng)音書屋五、基因初步定位 目的基因的初步定位(mapping the target gene)是利用分子標(biāo)記技術(shù)在一個(gè)目標(biāo)性狀的分離群體中把目的基因定位于染色體的一定區(qū)域內(nèi)。 初定位通常使用近等基因系法(near-isogenic lines, nils)或群組分離分析法

16、(bulk segregant analysis, bsa)。22風(fēng)音書屋n近等基因系是指只有目標(biāo)性狀基因有差異，其它性狀基因相同的2個(gè)群體，可以通過連續(xù)回交的途徑獲得。n由于近等基因系需要連續(xù)的回交，所需的時(shí)間較長(zhǎng)，因此michelmore等(1991)提出了群組分離分析法（bsa法），將分離群體中研究的目標(biāo)性狀根據(jù)其類型(如抗病、感病)分成2組，將每組內(nèi)一定數(shù)量的植株dna 等量混合，形成兩個(gè)池，這兩個(gè)池僅在目標(biāo)性狀(如抗病性)上有差異。利用分子標(biāo)記技術(shù)尋找兩個(gè)池的擴(kuò)增譜帶的差異，這種多態(tài)性極可能與目標(biāo)基因連鎖。再用所有的分離后代單株，驗(yàn)證該多態(tài)性是否真正與目標(biāo)基因連鎖及連鎖距離的確定。2

17、3風(fēng)音書屋六、精細(xì)定位 在初步定位基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)并篩選離親本更近且在兩親本之間表現(xiàn)多態(tài)性的引物，然后利用f2群體中的突變體檢測(cè)篩選到的親本間多態(tài)性引物，逐步縮小范圍，將目的基因定位到染色體上一個(gè)很小的物理區(qū)間內(nèi)。24風(fēng)音書屋 舉例說明：利用ssr標(biāo)記進(jìn)行水稻drawf1基因的定位25風(fēng)音書屋基本實(shí)驗(yàn)方法nf2定位群體構(gòu)建n植物總dna的提取npcr反應(yīng)n聚丙烯酰胺凝膠電泳n引物設(shè)計(jì)26風(fēng)音書屋f2群體構(gòu)建27風(fēng)音書屋引物設(shè)計(jì)常用軟件及網(wǎng)站設(shè)計(jì)軟件： primer3.0/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgiprimer5.0（尋

18、找酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)引物）webprimer/cgi-bin/web-primer序列分析軟件：dnastar（分析序列特征，引物質(zhì)量，編輯序列）28風(fēng)音書屋基因的初步定位（bsa法）篩選親本間多態(tài)性引物篩選池間多態(tài)性引物 小群體驗(yàn)證29風(fēng)音書屋初步定位帶型分析正常親本突變親本突變池正常池rm1（親本之間有多態(tài)，池間無多態(tài)）30風(fēng)音書屋rm2(親本和池之間均有多態(tài)）正常親本突變親本突變池正常池31風(fēng)音書屋 總結(jié)：如果親本與池之間同時(shí)存在多態(tài)性的引物很有可能和目標(biāo)基因連鎖，因此再通過小群體進(jìn)行驗(yàn)證（重組交換值應(yīng)該小于50%），則可將目標(biāo)基因定位到與其

19、連鎖的標(biāo)記所在的染色體上。我們初步定位的結(jié)果是否準(zhǔn)確呢？接下來就要用我們初步定位的結(jié)果是否準(zhǔn)確呢？接下來就要用一些突變體進(jìn)行驗(yàn)證，看一下我們所選定的標(biāo)記與目一些突變體進(jìn)行驗(yàn)證，看一下我們所選定的標(biāo)記與目標(biāo)基因是否真正連鎖標(biāo)基因是否真正連鎖32風(fēng)音書屋遺傳距離=（單交換+雙交換2）/（突變體總數(shù) 2） 100引物名稱連鎖植株數(shù)目單交換植株數(shù)目雙交換植株數(shù)目rm1150191rm2158111rm316280rm4155150怎樣判斷目標(biāo)基因與這些標(biāo)記之間的位置關(guān)系及距離怎樣判斷目標(biāo)基因與這些標(biāo)記之間的位置關(guān)系及距離遠(yuǎn)近呢？遠(yuǎn)近呢？33風(fēng)音書屋 a p + - 5 10 18a p + - 6 11 12 16rm2rm334風(fēng)音書屋 交換率越高的標(biāo)記離目標(biāo)基因越遠(yuǎn)，反之離目標(biāo)基因越近，即對(duì)應(yīng)的交換株越多的標(biāo)記離目標(biāo)基因遠(yuǎn)，交換株越少的標(biāo)記離目標(biāo)基因越近。35風(fēng)音書屋rm1rm2drawf1rm3rm43.8cm2.4cm2.4cm2.0cmchr.6markerdist.