課題申報(bào)書肝移植中移植排斥反應(yīng)新機(jī)制的研究

1、（一）立項(xiàng)依據(jù)與研究?jī)?nèi)容（4000-8000字）1.項(xiàng)目的立項(xiàng)依據(jù)（研究意義、國內(nèi)外研究現(xiàn)狀及分析，附主要參考文獻(xiàn)目錄。）（基礎(chǔ)研究需結(jié)合科學(xué)研究發(fā)展趨勢(shì)來論述科學(xué)意義；應(yīng)用研究需結(jié)合國民經(jīng)濟(jì)和社會(huì)發(fā)展中迫切解決的關(guān)鍵科技問題來論述其應(yīng)用前景。）目前，移植排斥反應(yīng)仍然是制約肝移植療效的主要原因。雖然由于免疫抑制劑的臨床應(yīng)用，肝移植的1年的存活率大幅度提高，已超過了80%。但是終生服用免疫抑制劑不僅成為患者沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，而且造成機(jī)體的免疫功能低下，可能促進(jìn)肝炎及腫瘤復(fù)發(fā)，誘發(fā)感染、腫瘤等疾病。因此，找尋誘導(dǎo)特異性移植耐受的新方法，是克服移植排斥反應(yīng)的最佳途徑。特異性移植耐受是指在無需使用免疫抑

2、制藥物的情況下，受者的免疫系統(tǒng)對(duì)同種異體或異種供體抗原長期不發(fā)生免疫反應(yīng)，而對(duì)其它抗原可發(fā)生正常免疫應(yīng)答的狀態(tài)。目前認(rèn)為，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫耐受涉及免疫清除、免疫失能、免疫抑制和免疫忽視四類機(jī)制1。根據(jù)以上誘導(dǎo)免疫耐受的機(jī)制，學(xué)者們發(fā)展出許多誘導(dǎo)移植耐受的新方法2：(1)在胸腺內(nèi)直接注射表達(dá)供體抗原的細(xì)胞，在胸腺內(nèi)通過克隆清除誘導(dǎo)免疫耐受。(2)利用骨髓移植造成造血細(xì)胞嵌合體誘導(dǎo)耐受。(3)阻斷t細(xì)胞活化的共刺激信號(hào)通路。(4)輸注供體樹突狀細(xì)胞(dentritic cell，dc)誘導(dǎo)耐受。(5)針對(duì)t細(xì)胞粘附和活化相關(guān)分子的單克隆抗體：抗t細(xì)胞及t細(xì)胞亞群的單抗；抗粘附分子或細(xì)胞因子的單抗。

3、(6)其它特異性免疫抑制的方法：合成肽阻斷tcr對(duì)同種異體抗原的識(shí)別；合成肽阻斷趨化因子及其受體。以上方法均不同程度地誘導(dǎo)了對(duì)供體抗原的耐受，但它們存在如下不足：(1)成年人胸腺已經(jīng)萎縮，無法在胸腺內(nèi)直接注射表達(dá)供體抗原的細(xì)胞，故該方法適用范圍大大受限。(2)供體骨髓移植能誘導(dǎo)部分耐受，但不易控制嵌合程度，移植物抗宿主病(graft versus host disease，gvhd)的發(fā)生率大大增加。(3)dc誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞失能狀態(tài)可通過給予外源性il-2而逆轉(zhuǎn)；感染或其它因素引起機(jī)體強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答，產(chǎn)生大量的il-2等細(xì)胞因子也可以通過旁效應(yīng)解除失能的細(xì)胞克??；失能狀態(tài)的維持需要抗原的持續(xù)存

4、在，抗原的去除也能逆轉(zhuǎn)失能。(4)阻斷協(xié)同刺激通路、應(yīng)用針對(duì)t細(xì)胞粘附和活化相關(guān)分子的單克隆抗體、合成肽阻斷tcr對(duì)同種異體抗原的識(shí)別、阻斷趨化因子及其受體等方法能誘導(dǎo)出確切的免疫抑制，但是其作用范圍是全身性的、非特異性的，且一旦中止阻斷劑的供給，則移植耐受消失?？傊?， 目前誘導(dǎo)移植耐受的方法存在非特異性、容易逆轉(zhuǎn)、實(shí)際操作困難等缺陷。肝移植排斥反應(yīng)啟動(dòng)時(shí)，首先表現(xiàn)為淋巴細(xì)胞對(duì)匯管區(qū)中央靜脈周圍的浸潤，隨著排斥反應(yīng)的進(jìn)展，淋巴細(xì)胞的損傷導(dǎo)致小葉間膽管上皮細(xì)胞、中央靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的炎癥，最后波及匯管區(qū)周圍的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞，造成廣泛的肝臟炎性反應(yīng)。因此肝移植排斥反應(yīng)的過程是從匯管區(qū)啟動(dòng)，進(jìn)而擴(kuò)展至小葉間

5、膽管上皮細(xì)胞、中央靜脈內(nèi)皮細(xì)胞、匯管區(qū)周圍的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞。移植排斥反應(yīng)發(fā)生時(shí)，ctl細(xì)胞在活化后可以通過以下兩條途徑殺傷靶細(xì)胞：(1)穿孔素/顆粒酶途徑。(2)fas/fasl途徑：在ctl細(xì)胞識(shí)別靶細(xì)胞后，細(xì)胞表面表達(dá)的高水平fasl與靶細(xì)胞表面的fas相互識(shí)別，通過fas觸發(fā)靶細(xì)胞內(nèi)部的凋亡程序，使靶細(xì)胞發(fā)生程序性死亡。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)兩條途徑相互獨(dú)立。然而體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)單一阻斷fas/fasl途徑即可抑制ctl對(duì)靶細(xì)胞的殺傷，其原因可能與體內(nèi)環(huán)境有關(guān)28. 誘騙受體3(decoy receptor 3，dcr3)是一種新發(fā)現(xiàn)的可結(jié)合fasl的可溶性tnfr超家庭成員，rna印跡表明dcr3 mr

6、na 表達(dá)于胎肺、腦、肝及成人脾、結(jié)腸和肺，特別是在肺癌和結(jié)腸癌細(xì)胞系的表達(dá)很高，也可由t細(xì)胞絲裂原激活的外周血單核細(xì)胞分泌。dcr3 分子質(zhì)量為35kda，肽鏈長300個(gè)氨基酸殘基。dcr3 的配體是light、fasl、tl1a。其主要作用有：(1)與fas競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合fasl，阻斷fasl所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，這一作用可以減弱ctl和nk細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的殺傷14。(2)通過抑制light與hvea 或tr2之間的雙向信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、tl1a至dcr3的單向信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)來抑制t細(xì)胞激活。7 (3)抑制cxcl12/基質(zhì)細(xì)胞來源的因子1(sdf-1) 、fasl對(duì)t細(xì)胞的趨化作用，從而減少cd4+和cd8+t

7、細(xì)胞對(duì)腫瘤的浸潤。25. 27(4)通過調(diào)節(jié)dc分化和成熟從而抑制cd4+ t細(xì)胞增生。20(5)抑制t細(xì)胞偽足形成，阻止它們形成不可分離的細(xì)胞簇從而調(diào)節(jié)t細(xì)胞與其它細(xì)胞如apc的相互作用。7因此根據(jù)其作用機(jī)理，人們推測(cè)其可能有以下四方面的作用(1)腫瘤細(xì)胞逃避免疫監(jiān)視。（2）抗炎作用。(3)致癌作用。（4）誘導(dǎo)移植耐受。目前的研究工作已經(jīng)肯定dcr3基因?qū)δ[瘤細(xì)胞逃避免疫監(jiān)視、抑制炎癥反應(yīng)的作用，但dcr3基因的高表達(dá)與細(xì)胞癌變無相關(guān)性，不是癌基因。wu等證實(shí)dcr3減少了fasl、ifn-誘導(dǎo)的胰島細(xì)胞凋亡及胰島素釋放，可防止同種異基因胰島移植時(shí)的胰島原發(fā)性無功能。2zhang等于心臟移植

8、術(shù)前一天開始連續(xù)7天靜脈注射dcr3，小鼠心臟存活時(shí)間比對(duì)照組延長3.3天，提示dcr3可以減弱t細(xì)胞對(duì)同種異體抗原的反應(yīng)。24我們利用腺相關(guān)病毒(adeno-associated virus, aav)（aav helperfree system, stratagene 公司）作為dcr3基因的載體，將aav病毒顆粒從門靜脈、肝動(dòng)脈、膽管注入冷保存時(shí)的供肝，成功實(shí)現(xiàn)了dcr3基因在供肝的表達(dá)，在沒有使用免疫抑制劑的情況下，供肝正常存活了105天（目前仍然存活，繼續(xù)觀察中），而對(duì)照組僅存活了15天（見研究工作基礎(chǔ)）。aav helperfree system的特點(diǎn)有：病毒載體產(chǎn)生、效價(jià)滴定階段

9、均不需野生型腺病毒共感染，因此有極高的生物安全性、宿主的免疫反應(yīng)極小；aav可感染的細(xì)胞類型廣泛，感染不依賴于活躍的細(xì)胞分裂；aav病毒滴度高，常規(guī)可達(dá)107病毒顆粒/ml，經(jīng)濃縮可達(dá)1012病毒顆粒/ml；aav在允許復(fù)制的條件下可在染色體外復(fù)制，在不能復(fù)制的條件下可以5-10%的效率定點(diǎn)整合入宿主19號(hào)染色體的一個(gè)2-4kb的區(qū)域，因此aav被證明有應(yīng)用于基因長期表達(dá)的價(jià)值。我們目前的研究工作的特色有：（1）證明了腺相關(guān)病毒攜帶的dcr3基因可以誘導(dǎo)肝移植耐受。(2)采用aav helperfree system克服了逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)效率低、隨機(jī)整合入受者染色體中而致腫瘤的危險(xiǎn)的缺點(diǎn)1以

10、及腺病毒載體雖然有較高的轉(zhuǎn)導(dǎo)率,但因不能在染色體外復(fù)制或整合入受者染色體中,目的基因只能一過性表達(dá)的缺點(diǎn)2。我們目前研究工作的缺陷有：（1）dcr3基因僅在肝臟血管內(nèi)皮細(xì)胞、膽管上皮細(xì)胞表達(dá)，而急性排斥反應(yīng)啟動(dòng)時(shí)ctl細(xì)胞首先浸潤的是匯管區(qū)的中央靜脈周圍，因此它尚不能阻止急性排斥反應(yīng)的啟動(dòng)，僅能阻止ctl細(xì)胞血管內(nèi)皮細(xì)胞、膽管上皮細(xì)胞的攻擊。（2）dcr3基因轉(zhuǎn)染的血管內(nèi)皮細(xì)胞、膽管上皮細(xì)胞是成熟的細(xì)胞。雖然攜帶dcr3基因的aav可在染色體外復(fù)制或整合入宿主基因組而使dcr3基因存在長期表達(dá)的可能，但是成熟細(xì)胞存在新老交替，dcr3基因的表達(dá)隨著細(xì)胞的死亡而消失。因此為了完善我們目前的研究工

11、作，我們需要作以下的改進(jìn)：（1）將dcr3基因的表達(dá)定位于匯管區(qū)中央靜脈周圍，抑制排斥反應(yīng)的啟動(dòng)。如能進(jìn)一步將dcr3基因表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞、膽管上皮細(xì)胞、肝細(xì)胞，則更能防止個(gè)別活化的ctl細(xì)胞對(duì)它們的攻擊，從而形成抑制排斥反應(yīng)的“雙保險(xiǎn)”。（2）實(shí)現(xiàn)dcr3基因的持續(xù)表達(dá)。肝干細(xì)胞（hepatic stem cell，hsc）是指具有自我更新能力和具有分化形成肝細(xì)胞與膽管細(xì)胞潛能的原始細(xì)胞。最近有人證實(shí)它尚可分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞(gao z, mcalister vc, williams gm. repopulation of liver endothelium by bone-marrow-

12、derived cells. lancet. 2001 mar 24;357(9260):932-3.) 11。肝干細(xì)胞的基本特征可概括為兩點(diǎn)：具有多向分化能力，可向肝細(xì)胞、膽管上皮細(xì)胞、肝臟血管內(nèi)皮細(xì)胞分化。具有自我更新與自我維持能力，對(duì)肝臟損傷或疾病產(chǎn)生反應(yīng)并進(jìn)行修復(fù)。其形態(tài)特點(diǎn)是細(xì)胞體積小、核大而胞質(zhì)少、呈卵圓形、具有特殊的表面標(biāo)志如afp、肝細(xì)胞標(biāo)志（白蛋白）、膽管上皮細(xì)胞標(biāo)志（ck7、ck19）以及肝細(xì)胞、膽管上皮細(xì)胞共有的標(biāo)志(ck8、ck18)。目前有人證實(shí)其尚有血管內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)志。該類細(xì)胞不僅在胚胎肝組織中存在，而且在成年肝組織中也存在。肝內(nèi)的肝干細(xì)胞稱為卵圓細(xì)胞(hepati

13、c oval cell，hoc)或小肝細(xì)胞。它們?cè)谡Ｇ闆r下位于肝臟匯管區(qū)的hering小管d，當(dāng)肝臟受到損傷（肝毒性藥物、手術(shù)、創(chuàng)傷、缺血再灌注等）時(shí)，它們迅速增生分化，補(bǔ)充受損的肝細(xì)胞、膽管上皮細(xì)胞、肝臟血管內(nèi)皮細(xì)胞分化，因而被稱為肝干細(xì)胞池a。目前大量文獻(xiàn)證實(shí)，肝臟損傷時(shí)，肝臟有三個(gè)水平的細(xì)胞修復(fù)：肝細(xì)胞、hering 小管的雙向干細(xì)胞、hering小管周圍的來自骨髓的肝干細(xì)胞。骨髓來源的干細(xì)胞可定居于hering小管周圍，在肝臟損傷時(shí)發(fā)揮修復(fù)作用k。theise nd等通過三維觀測(cè)得出hering 小管、匯管區(qū)周圍是肝干細(xì)胞存在的場(chǎng)所的結(jié)論g。petersen 證實(shí)肝內(nèi)存在骨髓來源的干

14、細(xì)胞，theise 大鼠2%，人4-40%。alison0.5-2%(hsc8,78,79)。lagasse 30%.認(rèn)為hering管可能是人肝干細(xì)胞起源分化及滯留場(chǎng)所(theisend,saxenar,portmannbc,etal.thecanalsofheringandhepaticstemcellsinhumansj.hepa-tology,1999,30:1425-1433.)肝干細(xì)胞的肝外來源包括胰腺的上皮細(xì)胞、胰島前體細(xì)胞、骨髓造血干細(xì)胞3,4。自1999年petersen等發(fā)現(xiàn)肝卵圓細(xì)胞可來源于骨髓后,從骨髓細(xì)胞中鑒定肝干細(xì)胞成為近年研究的熱點(diǎn)。目前研究證實(shí)從骨髓中分離純化的

15、造血干細(xì)胞的多個(gè)亞群在一定的微環(huán)境或細(xì)胞因子的誘導(dǎo)下可分化為肝干細(xì)胞b。目前,在骨髓中已發(fā)現(xiàn)多種細(xì)胞亞群具有分化為肝細(xì)胞的潛能,如ktls細(xì)胞(c-kithighthylowlin-sca-1+)h、2-m-thy-1+細(xì)胞12、cd44-cd45-hla-c-kit-的多能成體前體細(xì)胞(multipotent adult progenitor cells, mapc)i及c1qrp+細(xì)胞(lin-cd45+cd38-cd34+/-)j等。這些細(xì)胞均涉及多個(gè)不同的表面標(biāo)志,可能代表著骨髓干細(xì)胞的不同發(fā)育階段或譜系中的不同分支。這些細(xì)胞因子肯定存在于細(xì)胞的微環(huán)境中，包括細(xì)胞外基質(zhì)中參與粘附過程的

16、信號(hào)分子以及參與正常細(xì)胞發(fā)育、分化、成熟的細(xì)胞因子b e。petersen 等l、theise等m,n和alison等o的研究相繼指出,骨髓干細(xì)胞或造血干細(xì)胞能夠在鼠肝內(nèi)轉(zhuǎn)化成為肝卵圓細(xì)胞甚至成熟的肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞,并同時(shí)證明這種現(xiàn)象也存在于人類體內(nèi)。用高濃度的肝細(xì)胞生長因子(hgf)誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的大鼠骨髓細(xì)胞,rt-pcr檢測(cè)到白蛋白及afp的表達(dá),免疫細(xì)胞化學(xué)也證實(shí)了經(jīng)誘導(dǎo)的細(xì)胞出現(xiàn)了afp、白蛋白及ck8/18等肝前體細(xì)胞的特征性表達(dá)。應(yīng)用磁株細(xì)胞篩選法分離人或大鼠骨髓細(xì)胞中的2m-thy-1+細(xì)胞,能夠表達(dá)肝細(xì)胞的特征p。這些骨髓來源的肝干細(xì)胞(bdhsc)肝內(nèi)移植后很快就整合入肝板,

17、并且分化為成熟的肝細(xì)胞,而在體外培養(yǎng)的過程中加入膽汁化血清可促進(jìn)它們向肝細(xì)胞方向分化。蔡云峰等用免疫磁珠法成功分離出骨髓干細(xì)胞的多個(gè)亞群，并證明大鼠骨髓內(nèi)2微球蛋白陰性(2 m- ) 細(xì)胞經(jīng)體外培養(yǎng)誘導(dǎo)后呈多角形細(xì)胞表現(xiàn), 白蛋白、afp、 ck8 / 1 8表達(dá)陽性，其他干細(xì)胞類型未見類似變化。提示該亞群骨髓干細(xì)胞有向肝干細(xì)胞分化的能力。我們參照他們介紹的方法成功分離了1.5×105數(shù)量級(jí)的肝干細(xì)胞純度為95%，培養(yǎng)7天后可達(dá)2×106數(shù)量級(jí)。經(jīng)免疫組化染色證明其有肝細(xì)胞、膽管上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞的特異性標(biāo)志，因此推測(cè)其可能分化為以上3種細(xì)胞（見研究工作基礎(chǔ)）。這些研究

18、結(jié)果都說明骨髓細(xì)胞中存在有能分化為肝細(xì)胞的干細(xì)胞群。肝臟基因治療的一大難題是被用作基因修飾的成熟肝細(xì)胞在體外不易擴(kuò)增和傳代，肝干細(xì)胞具有強(qiáng)大的增殖能力，即使經(jīng)過基因修飾仍有可能傳代，這為克服目前基因治療中的主要問題開辟了新的途徑。以肝干細(xì)胞作為載體具有一次性介入，永久性治療的特點(diǎn)，且永生化的肝干細(xì)胞無致癌的危險(xiǎn)性f?；谝陨涎芯砍晒?，我們?cè)O(shè)想利用肝干細(xì)胞在肝臟匯管區(qū)中央靜脈周圍的靶向定植并在必要時(shí)分化補(bǔ)充受損或衰老的血管內(nèi)皮細(xì)胞、膽管上皮細(xì)胞、肝細(xì)胞的生物學(xué)特性，以腺相關(guān)病毒為載體將dcr3基因轉(zhuǎn)入從雄性近交系wistar大鼠骨髓中分離純化的肝干細(xì)胞，將雌性近交系wistar大鼠肝臟植入雌性近

19、交系lewis大鼠，同時(shí)將轉(zhuǎn)染dcr3基因的肝干細(xì)胞經(jīng)門靜脈注入移植后的肝臟。dcr3基因隨著肝干細(xì)胞的定植主要在匯管區(qū)持續(xù)表達(dá)，必要時(shí)部分隨著肝干細(xì)胞的進(jìn)一步分化而表達(dá)在血管內(nèi)皮細(xì)胞、膽管上皮細(xì)胞、肝細(xì)胞，從而在啟動(dòng)（主要）、攻擊（次要）兩個(gè)環(huán)節(jié)抑制排斥反應(yīng)的發(fā)生。dcr3基因強(qiáng)大的免疫抑制作用被局限在肝臟之中，從而誘導(dǎo)出特異針對(duì)肝臟的移植耐受狀態(tài)。參考文獻(xiàn)1. arnold b. levels of peripheral t cell tolerance. transplantation immunology. 2002,10(2-3):109-1142. goddard s, adams

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30、1170.m.,. .,2000,31235 240.n.,.,2000,3211 16.0o.,.,2000,406257.1p.,.,2001,288156 164.2.項(xiàng)目的研究?jī)?nèi)容、研究目標(biāo)，以及擬解決的關(guān)鍵問題。（此部分為重點(diǎn)闡述內(nèi)容）2.1 研究?jī)?nèi)容2.1.1構(gòu)建攜帶dcr3基因的腺相關(guān)病毒載體，并將其轉(zhuǎn)染aav293細(xì)胞，收集aav病毒顆粒備用。2.1.2從雄性近交系wistar大鼠股骨、脛骨抽取骨髓，分離出肝干細(xì)胞，用上述腺相關(guān)病毒顆粒轉(zhuǎn)染，并進(jìn)行表達(dá)鑒定。2.1.3將雌性近交系wistar大鼠肝臟植入雌性近交系lewis大鼠，同時(shí)將轉(zhuǎn)染的雄性近交系wistar大鼠的肝干細(xì)胞經(jīng)

31、門靜脈注入肝臟。2.1.4根據(jù)y染色體及aav病毒載體自帶的綠色熒光蛋白（gfp）標(biāo)志確定轉(zhuǎn)基因肝干細(xì)胞在供肝中的定植、分布情況。2.1.5檢測(cè)轉(zhuǎn)入肝干細(xì)胞的dcr3基因在供肝中的表達(dá)情況。2.1.6觀測(cè)肝移植術(shù)后移植排斥反應(yīng)的發(fā)生情況。2.2研究目標(biāo)：本課題擬構(gòu)建攜帶dcr3基因的腺相關(guān)病毒，將其轉(zhuǎn)染雄性近交系wistar大鼠骨髓來源的肝干細(xì)胞；將雌性近交系wistar大鼠肝臟植入雌性近交系lewis大鼠，同時(shí)將轉(zhuǎn)染dcr3基因的肝干細(xì)胞經(jīng)門靜脈注入移植后的肝臟；使dcr3基因在供肝中長期表達(dá)，從而誘導(dǎo)特異針對(duì)肝臟的移植耐受狀態(tài)。探討：(1)轉(zhuǎn)基因肝干細(xì)胞在供肝中的定植、分布情況。(2)轉(zhuǎn)入

32、肝干細(xì)胞的dcr3基因在供肝中的表達(dá)情況。(3)轉(zhuǎn)基因肝干細(xì)胞在供肝中的分布及其基因表達(dá)與移植耐受的關(guān)系。2.3擬解決的關(guān)鍵問題2.3.1腺相關(guān)病毒轉(zhuǎn)染肝干細(xì)胞的效率：干細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)染難度較大，是本課題的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。本課題成員（刪去）于2001年用腺病毒成功感染了神經(jīng)干細(xì)胞，成功率約 80%90%，且經(jīng)傳代培養(yǎng) 12代后仍具干細(xì)胞特性。腺相關(guān)病毒轉(zhuǎn)染效率高于腺病毒，轉(zhuǎn)染的細(xì)胞類型較腺病毒更廣泛。因此本課題組有能力完成腺相關(guān)病毒對(duì)肝干細(xì)胞的轉(zhuǎn)染。2.3.2轉(zhuǎn)基因肝干細(xì)胞在供肝匯管區(qū)中定植的數(shù)量：肝干細(xì)胞在匯管區(qū)的定植數(shù)量與肝臟受到的損傷程度有關(guān)。損傷越重，肝干細(xì)胞在匯管區(qū)的定植數(shù)量越多，反之亦

33、然。肝移植時(shí)肝臟缺血再灌注對(duì)肝臟已是一種損傷，為了進(jìn)一步提高肝干細(xì)胞在匯管區(qū)的定植數(shù)量，可在冷保存時(shí)切除大鼠肝臟的一葉，然后完成肝移植。3.擬采取的研究方案及可行性分析。（包括有關(guān)方法、技術(shù)路線、實(shí)驗(yàn)手段、關(guān)鍵技術(shù)等說明）3.1研究方案3.1.1 dcr3基因的克隆，參照pitti rm等介紹的方法進(jìn)行。3.1.2構(gòu)建攜帶dcr3基因的腺相關(guān)病毒載體，并用其感染aav293細(xì)胞進(jìn)行體外表達(dá)鑒定、收集aav病毒顆粒備用。3.1.3從雄性近交系wistar大鼠股骨、脛骨抽取骨髓，分離肝干細(xì)胞并進(jìn)行純化、鑒定，參照itzhak avital等介紹的方法進(jìn)行。3.1.4腺相關(guān)病毒載體轉(zhuǎn)染肝干細(xì)胞，采用

34、直接感染方法。3.1.5體外試驗(yàn)：表達(dá)dcr3基因的肝干細(xì)胞抑制fasl誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞凋亡試驗(yàn)；表達(dá)dcr3基因的肝干細(xì)胞抑制fasl誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞趨化試驗(yàn)3.1.6動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：大鼠肝移植采用袖套法，移植完成時(shí)將轉(zhuǎn)染dcr3基因的肝干細(xì)胞經(jīng)門靜脈注入肝臟；分別于術(shù)后3天、7天、14天、21天、28天取血液及肝臟標(biāo)本，采用常規(guī)生化法檢測(cè)肝功能，northern blot、western blot檢測(cè)dcr3基因在肝臟中的表達(dá)情況，免疫組化法檢測(cè)受體cd4+、cd8+淋巴細(xì)胞在供肝中的浸潤情況，tunel法檢測(cè)供肝中細(xì)胞凋亡情況，常規(guī)石蠟切片he染色觀察移植排斥反應(yīng)的發(fā)生情況。3.2技術(shù)路線構(gòu)建攜帶d

35、cr3基因的腺相關(guān)病毒載體載體體外表達(dá)鑒定、收集aav病毒顆粒轉(zhuǎn)染從雄性近交系wistar大鼠股骨、脛骨抽取骨髓，分離、純化hsc體外試驗(yàn)：表達(dá)dcr3基因的肝干細(xì)胞抑制fasl誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞凋亡試驗(yàn)、抑制fasl誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞趨化試驗(yàn)植入雌性近交系lewis大鼠 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：分別于術(shù)后3天、7天、14天、21天、28天取血液及肝臟標(biāo)本，采用常規(guī)生化法檢測(cè)肝功能，northern blot、western blot檢測(cè)dcr3基因在肝臟中的表達(dá)情況，免疫組化法檢測(cè)受體cd4+、cd8+淋巴細(xì)胞在供肝中的浸潤情況，tunel法檢測(cè)供肝中細(xì)胞凋亡情況，常規(guī)石蠟切片he染色觀察移植排斥反應(yīng)的發(fā)生情況切取

36、雌性近交系wistar大鼠 肝臟經(jīng)門靜脈注入供肝3.3可行性分析3.3.1理論上，骨髓來源的肝干細(xì)胞是肝臟匯管區(qū)卵圓細(xì)胞、嗜堿性小肝細(xì)胞的前體細(xì)胞。研究證明經(jīng)門靜脈注入的肝干細(xì)胞定植的肝臟匯管區(qū)的hering小管，可分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞、膽管上皮細(xì)胞、肝細(xì)胞。匯管區(qū)是肝移植排斥反應(yīng)時(shí)ctl細(xì)胞首先浸潤的區(qū)域，血管內(nèi)皮細(xì)胞、膽管上皮細(xì)胞、肝細(xì)胞是ctl細(xì)胞攻擊的靶細(xì)胞。因此肝干細(xì)胞將轉(zhuǎn)染的免疫抑制基因帶入肝臟并匯管區(qū)及血管內(nèi)皮細(xì)胞、膽管上皮細(xì)胞、肝細(xì)胞中持續(xù)表達(dá)，從而誘導(dǎo)特異針對(duì)肝臟的移植耐受狀態(tài)在理論上是可行的。3.3.2本研究所涉及的技術(shù)均為成熟的免疫學(xué)技術(shù)；本研究所擁有本研究所需的設(shè)備和條件

37、。4.本項(xiàng)目的特色與創(chuàng)新之處。本研究利用了肝干細(xì)胞在肝臟定植、分化的靶向性，將其作為免疫抑制分子的載體，使非特異性的免疫抑制分子的作用局限于肝臟之中，克服了免疫抑制分子作用范圍過大的缺點(diǎn)，從而誘導(dǎo)特異針對(duì)肝臟的移植耐受狀態(tài)。5.年度研究計(jì)劃及預(yù)期研究結(jié)果。（包括擬組織的重要學(xué)術(shù)交流活動(dòng)、國際合作與交流計(jì)劃等）年度研究計(jì)劃2005.01-2005.09dcr3基因的克隆，構(gòu)建攜帶dcr3基因的腺相關(guān)病毒載體備用。2005.10-2006.06分離、純化、鑒定雄性近交系大鼠骨髓來源的肝干細(xì)胞，并用腺相關(guān)病毒進(jìn)行轉(zhuǎn)染；dcr3基因的體外表達(dá)鑒定；所轉(zhuǎn)染的dcr3基因的體外功能實(shí)驗(yàn)。2006.07-2

38、007.06完成肝移植的動(dòng)物模型，將轉(zhuǎn)染后的肝干細(xì)胞經(jīng)門靜脈注入肝臟。按期取肝臟標(biāo)本，根據(jù)y染色體標(biāo)志染色及gfp，確定轉(zhuǎn)基因肝干細(xì)胞在供肝中的定植、分布情況；檢測(cè)轉(zhuǎn)入肝干細(xì)胞的基因在肝臟中的表達(dá)情況；移植排斥反應(yīng)的發(fā)生情況。2007.07-2007.12補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)遺漏，整理實(shí)驗(yàn)資料，統(tǒng)計(jì)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，撰寫論文。預(yù)期研究結(jié)果1.證明轉(zhuǎn)染dcr3基因的肝干細(xì)胞能在供肝匯管區(qū)及部分血管內(nèi)皮細(xì)胞、膽管上皮細(xì)胞、肝細(xì)胞中持續(xù)表達(dá)，同時(shí)誘導(dǎo)出長期的肝移植免疫耐受。2.在國外學(xué)術(shù)期刊上發(fā)表論文2-3篇，在國內(nèi)核心期刊發(fā)表論文6-8篇，并在國內(nèi)學(xué)術(shù)會(huì)議交流。(二）研究基礎(chǔ)與工作條件1.工作基礎(chǔ)（與本項(xiàng)目相關(guān)的

39、研究工作積累和已取得的研究工作成績(jī)）2月底至3月初出結(jié)果。2.工作條件（包括已具備的實(shí)驗(yàn)條件，沿缺少的實(shí)驗(yàn)條件和擬解決的途徑，包括利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室和部門開放實(shí)驗(yàn)室的計(jì)劃與落實(shí)情況。）刪去3.申請(qǐng)人簡(jiǎn)歷（包括申請(qǐng)者和項(xiàng)目組主要成員的學(xué)歷和研究工作簡(jiǎn)歷，近期已發(fā)表與本項(xiàng)目有關(guān)的主要論著目錄和獲得學(xué)術(shù)獎(jiǎng)勵(lì)情況及在本項(xiàng)目中承擔(dān)的任務(wù)。）刪去（三）經(jīng)費(fèi)申請(qǐng)說明（要求按照國家自然科學(xué)基金經(jīng)費(fèi)管理辦法認(rèn)真填寫，購置5萬元以上固定資產(chǎn)及設(shè)備等，須逐項(xiàng)說明與項(xiàng)目研究的直接相關(guān)性及必要性。）（四）其他附件清單（附件材料復(fù)印后隨紙質(zhì)申請(qǐng)書一并上交）（隨紙質(zhì)申請(qǐng)書一同報(bào)送的附件清單，如：具有中級(jí)技術(shù)職稱申請(qǐng)者的推薦

40、信或在職研究生申請(qǐng)項(xiàng)目的導(dǎo)師推薦信等。）登記序號(hào)： 項(xiàng)目編號(hào)：中醫(yī)藥、中西醫(yī)結(jié)合科研項(xiàng)目課題設(shè)計(jì)書課題名稱：痛痹顆粒對(duì)骨關(guān)節(jié)炎細(xì)胞凋亡和增殖的機(jī)理研究申報(bào)單位： 江蘇省中醫(yī)院課題負(fù)責(zé)人： 朱萱萱計(jì)劃年限：郵政編碼： 210029 聯(lián)系電話： 8661714130306申報(bào)日期：江蘇省中醫(yī)藥局制填寫提綱一、立項(xiàng)依據(jù)：與選題直接相關(guān)的國內(nèi)外現(xiàn)狀、水平和發(fā)展趨勢(shì)；選題的理論和實(shí)踐依據(jù)；研究目的、意義；本研究達(dá)到的科學(xué)技術(shù)水平，預(yù)期社會(huì)經(jīng)濟(jì)效益和應(yīng)用推廣前景。二、科研假說或技術(shù)構(gòu)思，主要研究?jī)?nèi)容、關(guān)鍵技術(shù)、目標(biāo)（達(dá)到的主要技術(shù)指標(biāo)或技術(shù)經(jīng)濟(jì)指標(biāo)），技術(shù)特征及創(chuàng)新之處，開發(fā)項(xiàng)目應(yīng)說明開發(fā)規(guī)模。三、研究試

41、驗(yàn)方法及技術(shù)路線（工藝路線）。四、現(xiàn)有工作條件和基礎(chǔ)：開展本項(xiàng)研究的技術(shù)優(yōu)勢(shì)，現(xiàn)有的主要儀器設(shè)備及應(yīng)用合格實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的基本條件等；已有工作基礎(chǔ)，預(yù)試驗(yàn)情況。五、計(jì)劃進(jìn)度：根據(jù)總的研究期限、年度計(jì)劃進(jìn)度，分別列出具體的目標(biāo)和進(jìn)度的考核指標(biāo)。六、參加（協(xié)作）單位意見及具體分工（附協(xié)議書）。七、經(jīng)費(fèi)概算（包括其他部門的撥款、貸款、自籌記憶取得的自主）和核算依據(jù)，以及分年度使用計(jì)劃。填寫說明一、內(nèi)容填寫自備附頁，用紙大小和封頁一致，字跡清楚，裝訂整齊后按申報(bào)要求上報(bào)。二、填寫提綱所列內(nèi)容，要全面詳細(xì)、如實(shí)填寫。三、封面上“登記序號(hào)”“項(xiàng)目編號(hào)”請(qǐng)勿填寫。1、 立項(xiàng)依據(jù)1.1 研究目的、意義骨關(guān)節(jié)炎（os

42、teoarthritis，oa）又稱退行性關(guān)節(jié)病，以關(guān)節(jié)軟骨發(fā)生彌漫性龜裂、纖維化和脫失及因骨組織增生性變化為特征的一組臨床征候群，是多見于中年以后的慢性進(jìn)行性關(guān)節(jié)疾患。該病發(fā)病率隨年齡增長而升高，據(jù)調(diào)查，在美國目前2億多人口中，就有骨關(guān)節(jié)炎4500萬，發(fā)病率占總?cè)丝诘?0%，在老年人中所占比例更高，50歲以上人群中，oa的患病率僅次于心血管疾病，位居第二位。在我國，根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查顯示，5564歲的人群中發(fā)病率達(dá)40%，而65歲以上人群的患病率達(dá)60%90%。隨著計(jì)劃生育政策的長久實(shí)施及經(jīng)濟(jì)發(fā)展，我國已進(jìn)入老齡化社會(huì)，oa的發(fā)病率還將越來越高，這不僅嚴(yán)重危害人民的生活、健康，對(duì)社會(huì)也將造成很

43、大負(fù)擔(dān)。同時(shí)世界其他國家也面臨著同樣的問題，因而oa引起了國際、國內(nèi)醫(yī)學(xué)界的相當(dāng)重視。近年來對(duì)oa的研究頗多，在發(fā)病機(jī)制、檢測(cè)手段以及治療方法上均取得較大進(jìn)步，但總的來說還缺乏令人滿意的突破性進(jìn)展。西藥治療oa的主要手段是非甾體藥，但存在副作用大、作用單一及有較多禁忌癥等缺點(diǎn)。雖然中藥治療oa也取得了一些經(jīng)驗(yàn)，但對(duì)其具體的作用機(jī)制有深入研究的卻很少，因此在中醫(yī)理論的指導(dǎo)下，運(yùn)用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)，對(duì)療效確切的中藥復(fù)方進(jìn)行深入的機(jī)理研究，使中藥治療oa的療效在國際先進(jìn)行列中占一席之地，是擺在我們面前非常重要的課題。1.2 國內(nèi)外現(xiàn)狀水平和發(fā)展趨勢(shì)近十年來，國內(nèi)外對(duì)oa進(jìn)行了較深入地研究，大致歸納如下：

44、1.2.1 流行病學(xué)研究已廣泛開展在近100種不同類型的關(guān)節(jié)疾病中，oa是影響人類健康最常見的關(guān)節(jié)疾患之一，沒有明顯的種族和地域差異，本病的患病率隨年齡增加而增高，故隨著人類平均壽命的延長，患病率也有增高的趨勢(shì)。felson等報(bào)道70歲以下人群膝oa患病率為7%（男6.4%，女11.4%），80歲以上為11.2%（男5.4%，女15.8%）；而放射學(xué)膝oa70歲以上為27.4%（男30.4%，女25.1%），80歲以上為43.7%。butter等報(bào)道，44歲以下、4559歲、60歲以上人群中，放射血oa 患病率各為6.2%、21.6%和42.0%。國內(nèi)陳順樂等隊(duì)13541名鋼鐵工人的調(diào)查結(jié)果顯

45、示，癥狀性oa患病率2.2%；無癥狀性oa患病率53%，其中3039、4049、5059歲患病率各為11%、27%和62%。汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院統(tǒng)計(jì)551例，結(jié)果40歲以下、4049、5059和60歲以上各占12.2%、17.4%、26.1%和44.3%。另外不同關(guān)節(jié)oa易感性不同。美國在衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)中心調(diào)查結(jié)果，oa患病率以手最高，以下依次為足、膝、髖。國內(nèi)陳順樂等調(diào)查結(jié)果oa是頸椎最多，以下依次為腰椎、膝、手和腕。本病性別差異在脊柱差別不大，但手、膝、髖oa均以女性較多，且女性骨關(guān)節(jié)炎的遺傳易感性較男性高。在framingham的研究中，felaon等發(fā)現(xiàn)女性體重減少11磅，骨關(guān)節(jié)炎形成的風(fēng)險(xiǎn)相應(yīng)減

46、少50%。 saase等調(diào)查結(jié)果，膝oa患病率男、女峰值分別為24.7%和54.6%。根據(jù)1994年統(tǒng)計(jì)，在美國，骨關(guān)節(jié)炎的消耗為155億美元，約為類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的3倍，其中一半以上消耗緣于工作喪失。在我國雖未作全國大范圍的普查，但隨著老齡化社會(huì)進(jìn)程的不斷加快，oa的發(fā)病率會(huì)越來越高，這必將給家庭、社會(huì)帶來沉重負(fù)擔(dān)。1.2.2 病因、發(fā)病機(jī)制有了巨大突破目前基礎(chǔ)研究認(rèn)為軟骨的損傷與退變是oa的根本，隨著分子生物學(xué)免疫學(xué)的發(fā)展，近年來眾多學(xué)者對(duì)oa關(guān)節(jié)軟骨退行性改變的原因從不同角度進(jìn)行了大量研究，其發(fā)病機(jī)制仍未完全明了，又提出了許多學(xué)說，如軟骨下骨內(nèi)高壓學(xué)說：由于骨血液動(dòng)力學(xué)的改變，在骨髓腔容積不

47、變的前提下增加內(nèi)容物引起壓力增高，即表現(xiàn)為骨內(nèi)壓力增高。骨內(nèi)高壓持續(xù)增高存在下關(guān)節(jié)滑液ph值下降，成分改變，干擾并破壞了軟骨細(xì)胞的正常代謝導(dǎo)致細(xì)胞變性壞死，膠原纖維解聚，蛋白多糖分解，軟骨下骨破壞、修復(fù)，最終產(chǎn)生骨性關(guān)節(jié)炎。自由基學(xué)說：認(rèn)為自由基對(duì)軟骨細(xì)胞dna和pg的合成具有抑制作用。自由基作用軟骨細(xì)胞后，引發(fā)膜脂質(zhì)過氧化，使脂質(zhì)過氧化代謝產(chǎn)物丙二醛增多，丙二醛可與dna發(fā)生交聯(lián)，自由基也可直接攻擊軟骨細(xì)胞dna即合成dna所需的酶，使dna鏈斷裂、堿基損傷從而影響了dna的合成，也造成前列腺（pg）合成障礙。骨關(guān)節(jié)炎時(shí)，滑膜、滑液、血管翳內(nèi)常有中性白細(xì)胞、巨嗜細(xì)胞浸潤，其表面受免疫復(fù)合物、

48、補(bǔ)體等作用能釋放大量o2-和h2o2；細(xì)胞因子學(xué)說：細(xì)胞因子對(duì)骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生、發(fā)展起了重要作用，如白細(xì)胞介素-1（il-1）、白細(xì)胞介素-6(il-6)、腫瘤壞死因子（tnf）等在oa中水平明顯增高。il-1具有刺激軟骨細(xì)胞分泌一氧化氮、前列腺e和il-6的作用，引起滑膜炎癥和疼痛，同時(shí)il-1也是軟骨基質(zhì)降解的主要驅(qū)動(dòng)因子；軟骨酶降解學(xué)說：oa軟骨細(xì)胞的基質(zhì)降解酶類的合成與分泌率明顯增加，并與關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重程度密切相關(guān)。參與降解基質(zhì)大分子的降解酶類可以增加達(dá)到幾倍。酸性和中性蛋白酶可以降解蛋白多糖的核心蛋白?；|(zhì)金屬蛋白酶，尤其是基質(zhì)溶素和膠原酶，參與關(guān)節(jié)軟骨的降解過程，這些酶類可以降解細(xì)胞外

49、基質(zhì)的所有成分，與循環(huán)系統(tǒng)中的纖維蛋白溶酶和局部合成的纖溶酶原一起，快速降解軟骨。在滑膜細(xì)胞和軟骨細(xì)胞產(chǎn)生的il-1和tnf的作用下，軟骨細(xì)胞以酶原的形式分泌大量的基質(zhì)金屬蛋白酶，而對(duì)金屬蛋白酶組織抑制劑無影響，使二者失衡從而增加對(duì)軟骨主要成分型膠原和蛋白聚糖合成的抑制作用，使軟骨進(jìn)行性破壞；一氧化氮學(xué)說：no是一種細(xì)胞間信使分子，可介導(dǎo)許多生物學(xué)現(xiàn)象。nos可催化重要炎性介質(zhì)no的產(chǎn)生，oa患者血清、滑液中no含量明顯高于正常。no可通過抑制軟骨細(xì)胞增殖，促進(jìn)軟骨細(xì)胞凋亡，改變蛋白多糖和膠原蛋白的合成與分泌功能，同時(shí)使軟骨細(xì)胞分泌透明質(zhì)酸減少，滑膜粘蛋白解聚，抑制軟骨細(xì)胞合成軟骨基質(zhì)，促進(jìn)軟

50、骨細(xì)胞糖酵解，使軟骨破壞。細(xì)胞凋亡學(xué)說：細(xì)胞凋亡是細(xì)胞死亡的形式之一，許多正常組織均可發(fā)現(xiàn)凋亡，但凋亡亢進(jìn)與不足則會(huì)引起相關(guān)疾病，在骨關(guān)節(jié)炎患者軟骨中軟骨細(xì)胞的凋亡有異常表現(xiàn)，且凋亡細(xì)胞數(shù)目與骨關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重程度明顯相關(guān)。凋亡小體存在于軟骨細(xì)胞小孔或間隙內(nèi)，其產(chǎn)生的焦磷酸鹽能從溶液中沉積鈣，有ntpph（nucleosid triphosphate pyrophos phohydrolase）和堿性磷酸酶作用,造成余下軟骨細(xì)胞修復(fù)過程失敗，而逐漸發(fā)展成關(guān)節(jié)軟骨的完全丟失。oa軟骨細(xì)胞凋亡主要通過兩種相互獨(dú)立的途徑完成，一種是同滑膜炎癥無關(guān)的途徑,由no介導(dǎo);另一種是同滑膜炎癥相關(guān)的途徑,由fas介

51、導(dǎo)。典型的oa不存在明顯的炎癥反應(yīng),此時(shí)軟骨細(xì)胞凋亡以no途徑為主;當(dāng)產(chǎn)生炎癥反應(yīng)時(shí),則通過as途徑加劇軟骨細(xì)胞凋亡和關(guān)節(jié)破壞。no通過兩種方式造成組織及細(xì)胞損傷。一是高濃度的no能抑制多種與線粒體呼吸傳遞系統(tǒng)及檸檬酸循環(huán)有關(guān)的酶,從而抑制線粒體呼吸,造成組織損傷;二是no與超氧化陰離子2-反應(yīng),生成氧化亞硝基陰離子onoo-,在酸性條件下(如病理?xiàng)l件)迅速分解為oh-和no2自由基,這兩種自由基具有很強(qiáng)的細(xì)胞毒性,可造成組織細(xì)胞損傷。在oa患者中,受損區(qū)軟骨細(xì)胞的凋亡比例明顯高于未受損區(qū)。fas表達(dá)的結(jié)果與其相符,oa受損區(qū)的fas表達(dá)遠(yuǎn)高于未受損區(qū),提示fas表達(dá)可誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡。除no

52、途徑和fas途徑外,還有一些因素可導(dǎo)致軟骨細(xì)胞凋亡、關(guān)節(jié)破壞,如il-1、il-8、tnf-、pge2、aggrecan g1區(qū)等。1.2.3 治療方面有了不少新方法目前中西醫(yī)治療oa的藥物較多，西藥治療oa主要有三大類，第一類為快作用藥，即非甾體藥，特點(diǎn)是發(fā)揮作用快，但副作用較大，對(duì)胃腸、肝腎、血小板均有較大影響，oa多為老年人，長期服用此類藥尤其不能耐受，且部分藥物價(jià)格不菲，而且由于過分的鎮(zhèn)痛，導(dǎo)致病人失去警惕過分運(yùn)動(dòng)，以致出現(xiàn)“消炎痛髖”，從長期療效來看反而不佳，最新觀點(diǎn)認(rèn)為乙酰氨基酚應(yīng)作為治療oa的首選藥，但尚有一定爭(zhēng)議，且同樣存在上述副作用；第二類為慢作用藥，發(fā)揮作用慢，療效不確切，

53、價(jià)格昂貴，臨床上尚未廣泛運(yùn)用；第三類為軟骨保護(hù)劑，尚未問世。關(guān)節(jié)清理術(shù)、膝關(guān)節(jié)置換術(shù)，適應(yīng)癥較少，費(fèi)用高，創(chuàng)傷大，病人難以接受。中哦藥治療oa的研究取得了可喜的進(jìn)步，但中藥治療仍存在較多共性的問題：多屬臨床經(jīng)驗(yàn)，無對(duì)照組，特別是西藥對(duì)照組觀察，處方不固定。缺乏用客觀的最新的國際公認(rèn)的、量化的臨床觀察指標(biāo)及療效判斷標(biāo)準(zhǔn)為手段來尋找治療oa的中藥。未針對(duì)oa發(fā)病機(jī)制進(jìn)行臨床及動(dòng)物試驗(yàn)從生化、免疫、病理、細(xì)胞分子水平來探討中藥的藥物作用機(jī)理。缺乏高效的、作用綜合、副作用小的新藥。中醫(yī)認(rèn)為oa屬痹癥中的痹、痛痹、骨痹，認(rèn)為其病因與年老體衰、長期勞損、外感風(fēng)寒濕邪有關(guān)，明確指出肝腎虧虛、氣血不足、筋骨失

54、養(yǎng)為oa的發(fā)病基礎(chǔ)，而寒濕、痰瘀為病理因素及病理產(chǎn)物。周尊謙等人在傳統(tǒng)中醫(yī)理論基礎(chǔ)上，闡述了膝oa骨內(nèi)高壓血瘀證氧自由基之間的密切關(guān)系；謝林等論述了膝oa與血瘀證之間的內(nèi)在聯(lián)系，旨在為運(yùn)用活血化淤藥治療oa提供理論依據(jù)。治療方面從古到今絕大部分醫(yī)家皆針對(duì)其病因病機(jī)采用益肝腎、強(qiáng)筋骨、補(bǔ)氣血治其本；散寒通絡(luò)、化痰勝濕治其標(biāo)。獨(dú)活寄生湯是用于治療風(fēng)寒濕痹、關(guān)節(jié)疼痛和腦血管后遺癥的傳統(tǒng)固防，具有補(bǔ)肝腎、活血通絡(luò)之功，臨床常見本方加減治療oa，療效比較肯定。朱健兒以本方加味治療262例，總有效率94.7%。單文龍等用本方加減治療骨關(guān)節(jié)炎24例，有效率為87.5%。陸智報(bào)道用本方加減治療104例，總有效

55、率91.3%。1.2.4 實(shí)驗(yàn)研究方面有了較大的進(jìn)展隨著對(duì)oa發(fā)病機(jī)理的不斷深入認(rèn)識(shí)，對(duì)oa的實(shí)驗(yàn)研究方面也開始了向多層次多角度的方向發(fā)展。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)不再只局限于微循環(huán)和一般抗炎、鎮(zhèn)痛試驗(yàn)，現(xiàn)已使用針對(duì)oa的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，并采用相關(guān)的指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)。目前實(shí)驗(yàn)研究?jī)?nèi)容主要有以下幾個(gè)方面，研究最多的是oa的血液流變學(xué)、氧自由基及一氧化氮含量等，這些試驗(yàn)一般均可通過建立骨關(guān)節(jié)炎的模型來完成，也可通過使用其它相似的模型檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)來進(jìn)行，如可建立急性血淤模型來檢查血液流變學(xué)指標(biāo)，使用老齡動(dòng)物通過檢測(cè)體內(nèi)sod及mda含量推斷藥物的抗氧自由基的能力等。在no對(duì)oa影響的實(shí)驗(yàn)中，一般采用硝酸還原酶法來測(cè)定no含量

56、，運(yùn)用pt-pcr技術(shù)測(cè)定nos基因表達(dá)。il-1、il-6、tnf等細(xì)胞因子、軟骨降解酶尤其是基質(zhì)金屬蛋白酶、誘導(dǎo)關(guān)節(jié)滑膜炎癥的物質(zhì)如纖溶酶原/纖溶酶原激活物和前列腺素pge2、軟骨細(xì)胞的細(xì)胞凋亡及增殖情況、性激素水平等也越來越多地被作為檢測(cè)指標(biāo)使用到實(shí)驗(yàn)研究中來。1.3 選題的理論和實(shí)踐依據(jù)祖國醫(yī)學(xué)并無骨關(guān)節(jié)炎的病名，從歷代文獻(xiàn)來看本病應(yīng)歸屬于“骨痹”、“痛痹”范疇。我們認(rèn)為oa病人除了肝腎虧虛，寒濕痹阻外，一般oa病人體重超重較多，也即為痰濕偏盛之體，另外脾虛生濕及寒濕痹阻日久濕聚成痰，痰淤交阻是引起膝關(guān)節(jié)腫脹畸形、活動(dòng)受限的重要因素，所謂頑癥怪病皆質(zhì)之于痰淤?；诂F(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)oa發(fā)病機(jī)理的深入研究，我們?cè)谘a(bǔ)益肝腎、活血通絡(luò)基礎(chǔ)上，結(jié)合中藥對(duì)緩解軟骨降解，增加軟骨細(xì)胞功能，抑制滑膜增生及炎癥的研究成果，于1995年即對(duì)備急千金要方中的獨(dú)活寄生湯進(jìn)行化裁，重用活血化淤，加用化痰清熱之品，總結(jié)制定出了高效、藥源廣泛、安全可行的痛痹顆粒，并于1999年采用痛痹顆粒的組方治療膝oa，方中以獨(dú)活為君藥，以祛下焦與筋骨間風(fēng)寒濕邪；威靈仙舒筋通絡(luò)止痹痛；淫羊藿、懷牛膝補(bǔ)肝腎，強(qiáng)筋骨，通經(jīng)絡(luò)，其中懷