農(nóng)殘分析可見紫外分光光法PPT課件

1、一、分光光度法的基本概念 分光光度法是根據(jù)物質(zhì)對光具有選擇性的吸收特征而建立起來的一種分析方法，通常又稱吸收光譜法。吸收光譜是可見光譜、紫外光譜和紅外光譜的統(tǒng)稱。 吸收光譜是由物質(zhì)吸收光能而產(chǎn)生。光具有波粒二重性，它既是電磁波又是輻射能。（一）光的波動性 光作為電磁波，具有波動性的特征，可用波長（）、頻率（v）及波數(shù)（）來表示。三者的關(guān)系可用以下表示。 式中：波長 c光速 v頻率 波數(shù)，為每厘米長度中波的數(shù)目，即波長的倒數(shù)，單位為1/cm。cvcv1第1頁/共90頁（二）光的微粒性普朗克公式 光作為輻射能又具有微粒性的特征。所謂微粒性，即指光是由光量子（或光子）的一種粒子組成。光輻射的能量是一

2、份一份的。單個光量子的能量與波長的關(guān)系可用普朗克（plank）公式表示 式中：E能量； h普朗克常量 從公式可見，光量子的波長與其能量成反比，波長愈長，能量愈小。（三）可見紫外、紅外光區(qū)的劃分 根據(jù)電磁波具有波粒二重性的特點，可把自然界存在的各種電磁波按波長順序排列成譜，稱為電磁波譜，如表61所示。1cEhvhhc第2頁/共90頁第3頁/共90頁 可將電磁波波長劃分為若干波段區(qū)域各波段能量不同，引起物質(zhì)運動的形式亦不同。物質(zhì)吸收紫外光和可見光則引起分子中價電子的躍遷；物質(zhì)吸收紅外光則引起分子振動，因此可見紫外光譜又稱為電子光譜，紅外光譜又稱為分子振動光譜。 本章討論可見及紫外分光光度法，由于可

3、見紫外吸收光譜是由電子躍遷產(chǎn)生的，因此波長為100800nm的光線才有足夠的能量引起電子躍遷。 分為三個區(qū)域: 100200nm 遠紫外區(qū) 200400nm 近紫外區(qū) 400800nm 可見光區(qū)域。第4頁/共90頁二、可見紫外分光光度計 分光光度法使用的儀器是分光光度計。分光光度計的種類很多，其儀器結(jié)構(gòu)的主要部件都是由光源、分光系統(tǒng)（單色器）、吸收池、檢測器和記錄儀所組成。見圖61。第5頁/共90頁第6頁/共90頁（一）光源 在可見紫外分光光度計上常用的光源是鎢絲燈和氫弧燈(或氘燈) 可見光區(qū)用鎢絲白熾燈，其波長在3202500nm之間。 紫外光區(qū)用氫弧燈或氘燈，其波長在180375nm。 用

4、氫燈或氘燈作為光源，燈管上必須裝有石英窗（因玻璃對紫外光有吸收）。第7頁/共90頁（二）單色器 單色器是指能將不同波長的入射光分散為單色光的裝置，主要由透鏡（聚焦作用）、輸入輸出狹縫（阻擋不需要的光）和散射裝置（把白色光散成不同波長的光，是一種分辨器）組成。散射器是單色器的核心，由棱鏡或衍射光柵組成。玻璃棱鏡只能用于可見光區(qū)；石英棱鏡或反射光柵可用于紫外、可見及近紅外光區(qū)。 棱鏡的色散原理：不同波長的光在玻璃或石英中的折射率不同，波長短的光折射率大，波長長的光折射率小，當平行的混合光經(jīng)過棱鏡后，就會使不同波長的光按次序偏折分開，而成光譜。其光波由紫外線到長波方向越來越密。第8頁/共90頁 光柵

5、的色散原理：光柵是在石英或玻璃表面上刻劃許多等距離的平行線，大約每2.45cm刻1500030000條線?？叹€處不透光，光只能在兩條刻線中間的平面處透過去。這些平面形成極微小的縫，光透過小縫時即產(chǎn)生繞射現(xiàn)象。較長的光波偏折的角度大，較短的光波偏折角度小。 從棱鏡或光柵射出的光經(jīng)旋轉(zhuǎn)反射鏡就可依次射出狹縫，經(jīng)聚焦后達到吸收池。 現(xiàn)代高級分光光度計往往采用雙單色器，即包含兩個光柵或兩個棱鏡，或一個棱鏡一個光柵，這樣可以減少雜散光，提高儀器的分辨能力。第9頁/共90頁（三）吸收池 吸收池是用以盛裝樣品溶液進行測定的容器。 可見光區(qū)用玻璃吸收池；紫外區(qū)需用石英吸收池。 池厚（內(nèi)徑）有0.5，1，2cm

6、等幾種，一般使用1cm的，吸收池的光潔度對測定影響很大，透明光學(xué)面不得用手指拿，不得用毛刷等硬物擦洗，通常用擦鏡紙擦洗。測定時如遇揮發(fā)性液體或氣體，需蓋上池蓋，以免溶液揮發(fā)影響測定濃度或產(chǎn)生氣體損害儀器部件。第10頁/共90頁（四）檢測器 檢測器的功能是檢測光信號并將其轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘枴?檢測器主要部件為光電池或光電倍增管等。 光電倍增管是當前應(yīng)用最多的一種檢測器，它的作用是利用二次電子發(fā)射以放大光電流，放大倍數(shù)可達108倍。對檢測器的要求是靈敏度高、對輻射響應(yīng)時間短、對輻射能量響應(yīng)的線性關(guān)系良好、噪音小、性能穩(wěn)定等。第11頁/共90頁（五）測量信號指示系統(tǒng) 用光電倍增管作檢測器，需要將檢測器信號

7、放大以后用記錄器記錄下來，不同型號分光光度計記錄裝置不同，目前許多由微處理機控制的紫外可見分光光度計，可自動調(diào)零，自動篩選波長，自動設(shè)置參數(shù)、掃描與計算均自動完成，大大減少了人為誤差。第12頁/共90頁三、分光光度法的基本定律（一）光吸收定律 用分光光度法進行定量分析是以朗伯比爾定律(LambertBeers Law)為依據(jù)的，它是描述各種類型的電磁輻射被介質(zhì)吸收規(guī)律的基本定律，簡稱比爾定律。定律具體內(nèi)容是：當一束平行的單色光（I0）射入具有平行平面的吸光介質(zhì)（溶液）時，一部分（I）透過介質(zhì)（溶液），一部分光被介質(zhì)（溶液）所吸收。光的強度隨介質(zhì)的厚度及吸光物質(zhì)的濃度的遞增而依指數(shù)規(guī)律遞減。第1

8、3頁/共90頁 比爾定律基本公式如下：式中：A吸光度（absorbence） T透光度（transmittance）或稱透射率； I0入射光強度； I透過強度； L光程長度即樣品溶液的厚度（通常為吸收池的 厚度）； C樣品溶液的濃度； K 。此公式一般適合于稀溶液，也可用于氣體或固體。a b s o rp tiv ityAL C吸 光 系 數(shù)0ITI1loglogATKCLT 第14頁/共90頁 在具體應(yīng)用時，被測溶液濃度可用mol/L或百分濃度來表示。 用mol/L來表示時，用L為1cm比色池，相應(yīng)的吸光系數(shù)稱為摩爾吸光系數(shù)（molar absorptivity）用符號表示 用百分濃度g/1

9、00ml來表示時，L為1cm比色池，相應(yīng)吸光系數(shù)稱為百分吸光系數(shù)，用符號 表示。 E與的關(guān)系如下： 式中： m物質(zhì)的分子量11cmE11cm10Em11cmE0.1m第15頁/共90頁 測定值得意義 (1) 根據(jù)值的大小，可以確定化合物吸光度的強弱， 值104為強吸收， 103104為較強吸收， 102103為較弱吸收， 102為弱吸收。 (2) 值大小與電子躍遷種類及電子在兩個能級間躍遷的幾率有關(guān)，如不飽和雙鍵化合物，可以產(chǎn)生*躍遷， 值則很大，屬于強吸收。又如n*及*躍遷，所需能量相差不多，但二者中*躍遷幾率較大，因此值比n*的大，約為104，屬強吸收。 (3) 值可以衡量不同物質(zhì)在同一波

10、長下吸收能力的強弱，在同一波長下， 值越大吸收光能力愈強。 (4) 對同一化合物而言，在不同波長下具有不同的值，但在一定波長下，它又是一個特征常數(shù)，因此可作為有機化合物定性鑒定的參數(shù)之一。 (5) 值是衡量分析靈敏度高低的依據(jù)之一， 值越大，靈敏度越高。第16頁/共90頁（二）吸收曲線 吸收曲線又稱為光譜曲線或光吸收曲線，是指用固定濃度及吸收池的厚度，在不同波長下用分光光度計測得相應(yīng)的吸光度（A），然后以波長為橫坐標，吸光度值為縱坐標作圖，所得的吸光度波長曲線，即為吸收曲線。如圖62所示。第17頁/共90頁第18頁/共90頁 曲線的峰稱為吸收峰，它所對應(yīng)的波長稱為最大吸收波長，用max表示。曲

11、線的谷所對應(yīng)的波長稱為最小吸收波長，用min表示。峰旁一個小的曲折稱為肩峰，在吸收曲線的波長最短一端不成峰形的部分，稱為末端吸收。吸收曲線有時也可用或log作為縱坐標。此外也可用百分透光度為縱坐標，但應(yīng)用較少。 圖63繪出了不同濃度的“稀禾定”溶液的吸收曲線。從圖中看出，同一物質(zhì)即使?jié)舛雀淖?，其吸收曲線形狀及最大吸收波長不變，三種濃度的最大吸收波長均為283nm。第19頁/共90頁第20頁/共90頁 吸收曲線的用途： （1）吸收曲線的特征和形狀是由分子的電子結(jié)構(gòu)決定的，它反映了物質(zhì)分子中能級的變化情況； （2）它描述了物質(zhì)對不同波長光的吸收能力，在定量分析中可作為選擇最大吸收波長的依據(jù)； （3

12、）吸收曲線體現(xiàn)了物質(zhì)的特性，不同物質(zhì)具有不同特征的吸收曲線，因此可用作定性鑒定的依據(jù)。第21頁/共90頁（三）對比爾定律的偏離 根據(jù)比爾定律的原則，當吸收池厚度不變，以吸光度對濃度作圖時，應(yīng)得到一條通過原點的直線，但在實際工作中，吸光度與濃度之間的線性關(guān)系常常發(fā)生偏離，使曲線彎曲，發(fā)生正偏差或負偏差。如圖64所示。第22頁/共90頁第23頁/共90頁 偏離比爾定律的因素主要有： 1被測溶液濃度過大 比爾定律只適用于測定稀溶液，在濃度高時由于產(chǎn)生吸收的組分中粒子密度變大，以致每個粒子都可以影響鄰近粒子的電荷分布，這種粒子間的相互作用，使吸收輻射的能力發(fā)生了改變，以致發(fā)生偏離。 2化學(xué)偏離 由于吸

13、收組分的締合、解離、光化學(xué)作用或與溶劑的相互作用，使吸收峰的形狀、位置、強度以及精細結(jié)構(gòu)都發(fā)生變化，導(dǎo)致偏離。 3雜光的影響 比爾定律要求被測溶液吸收的光是單色光，但事實上由于分光光度計的單色器的輸出狹縫分離出的光?；煊信c選定譜帶無關(guān)的雜光，這種多色光，則導(dǎo)致對比爾定律的偏離。一般良好的可見紫外分光光度計在全譜域雜光可保持低于0.1。由表62可見，含雜光的比率越高，對測定靈敏度的影響就愈大。第24頁/共90頁第25頁/共90頁 4譜帶寬度的影響 在實際測定樣品時，為了保證足夠的光強，分光光度計的狹縫必須保持一定寬度，因此，由出射狹縫投射到被測物質(zhì)上的光，并不是真正的單色光，而是一個有限寬度的譜

14、帶，稱為光譜帶通。隨著光譜帶通寬度的增大，光源譜帶增寬，譜帶的精細結(jié)構(gòu)逐漸消失，峰值吸光度降低，工作曲線的斜率也隨之降低，從而偏離比爾定律。 5其它因素的影響 除上述主要因素外，試樣中含有懸浮率或膠粒，以及會產(chǎn)生熒光的物質(zhì)都會使透射光強度減少而偏離比爾定律。第26頁/共90頁 (四)精密度與檢出限 1精密度 可見及紫外分光光度計產(chǎn)生誤差的主要來源，在于吸光度的測量誤差。 根據(jù)比爾定律公式可以改寫為 上式左邊換成自然對數(shù)，然后兩邊取微分，可得： 上述公式兩式相除，經(jīng)過整理可得下式： 1logTbclogTbcdTdTb c0.434d0.434dTTlogTcc第27頁/共90頁 如以有限值表示

15、又可以寫成 式中： 濃度相對誤差， T透光率T測量中的絕對誤差。 通常市售的分光光度計透光率的測量誤差一般在0.002到0.01之間。假設(shè)透光率測量誤差T為0.005，通過以上公式計算，可得到與T及A的函數(shù)關(guān)系數(shù)據(jù)列于表63。0.434TTlogTcccc第28頁/共90頁表63 濃度百分誤差的變差與透過率T、吸光度A的函數(shù)關(guān)系（假定為T0.005）透過率T 吸光度A 濃度百分誤差 100 0.950.02210.20.900.0464.740.800.0972.800.700.1552.000.600.2221.630.500.3011.440.400.3991.360.300.5231.3

16、80.200.6991.550.101.0002.170.0301.5234.750.020 1.699 6.38 cc第29頁/共90頁 2檢出限 檢出限不僅決定于吸光系數(shù)。也決定于所用儀器的噪聲水平。對多數(shù)商品分光光度計而言，1吸收(T0.99，A0.004)與其最小可測信號相符。 在理想情況下，摩爾吸光系數(shù)可高達105，如使用1cm光程吸收池，吸光度范圍在0.1 1.5時，濃度范圍則為1106 1.5105 molL。 如果待測化合物的摩爾吸光系數(shù)為105，使用10cm吸收池則近似檢出限將是4109 molL。 第30頁/共90頁四、分子結(jié)構(gòu)與電子光譜 （一）可見及紫外吸收光譜的產(chǎn)生 物

17、質(zhì)的分子在室溫下，一般處于基態(tài)能級，當它受到電磁輻射的作用時，吸收一定能量的光子，使分子受到激發(fā)，就從原來能量較低的基態(tài)能級躍遷到能量較高的能級(激發(fā)態(tài))，而產(chǎn)生吸收光譜。 分子躍遷有三種類型，即電子躍遷，振動躍遷及旋轉(zhuǎn)躍遷，這三種躍遷所需的能量不同，可以產(chǎn)生三種不同的吸收光譜，即電子光譜、振動光譜及轉(zhuǎn)動光譜。 振動光譜及轉(zhuǎn)動光譜能級躍遷需要能量較小，位于紅外區(qū)及遠紅外區(qū)，電子躍遷所需能量最大，在120eV(電子伏特)之間，位于可見與紫外光區(qū)，這種光譜又稱為電子光譜或可見紫外光譜。本章要討論的可見紫外光譜就是由電子躍遷所產(chǎn)生的。 第31頁/共90頁 1有機化合物中價電子的類型 在有機化合物中有

18、幾種不同性質(zhì)的價電子，根據(jù)分子中電子成鍵的種類不同，可分為三種類型：形成單鍵的電子稱為鍵電子；形成雙鍵的電子稱鍵電子，氧、氮、硫、鹵素等含有未成鍵的電子稱為孤對n電子。以醛基為例示意如下： 當有機化合物吸收紫外光時，這些價電子可以從基態(tài)躍遷到較高的能級狀態(tài)(受激態(tài))，此時電子所占的軌道稱為*，*反鍵軌道。第32頁/共90頁 2電子躍遷的類型 有機化合物分子中電子躍遷的方式與鍵的性能有關(guān)。電子躍遷主要有下面幾種類型，即*、n*、n*及*。各種躍遷所需能量大小為 *n*n* 見圖66所示。 通常當電子由一個能級躍遷到另一個能級時，同時伴隨有振動能級和轉(zhuǎn)動能級的躍遷。因此，所得到的吸收光譜不是線狀光

19、譜而是帶狀光譜。 第33頁/共90頁第34頁/共90頁 (二)幾個常用術(shù)語 1生色基(又稱發(fā)色基團) 有機分子中能夠吸收紫外或可見光而引起電子躍遷的不飽和基團叫做生色基 (Chromophores)又稱發(fā)色基團(Chromophoric group)。 生色基主要是指共軛多烯系統(tǒng)，含有未成鍵電子對的雙鍵結(jié)構(gòu)或基團、芳香基團及部分含有未成鍵電子對雜原子的基因。常見生色基的最大吸收峰見表64。第35頁/共90頁第36頁/共90頁 2助色基(又稱助色團) 某些含有未成鍵電子對的原子或基團，稱為助色基(Auxochrome)，助色基本身在紫外區(qū)沒有特征吸收帶，但當它們與生色基連在一起時，可以使生色基所

20、產(chǎn)生的吸收峰向長波方向移動，并使其強度增加。這類基團有OH、NH2、SH、 SO3H、 COOH、 Cl、 Br等。 3紅移、藍移、增色效應(yīng)、減色效應(yīng) 紅移(Bathchromic)：指因結(jié)構(gòu)變化(如順反異構(gòu))、共軛體 系加大、助色基效應(yīng)、溶液pH變化等引起吸收峰向長波 移動的效應(yīng)。 藍移(Hypsochromic)：指由于取代基或溶劑等的影響，使吸收峰向短波方向移動的效應(yīng)。 增色效應(yīng)(Hyperchromic effect)：由于結(jié)構(gòu)變化或其它原因使吸收強度增加的現(xiàn)象。 減色效應(yīng)(Hypochromlc effect)：使吸收強度減弱的現(xiàn)象。第37頁/共90頁(三)有機化合物結(jié)構(gòu)與電子躍遷及

21、吸收譜帶的關(guān)系 1飽和單鍵碳氫化合物 只含鍵電子，電子結(jié)合的很牢固，只有吸收很大能量后才能產(chǎn)生*躍遷。在近紫外區(qū)沒有吸收峰，只有在遠紫外區(qū)(10一200 nm)才有吸收峰。這已超出了紫外可見分光光度計的范圍，應(yīng)用不多。 2飽和烴中氫被氧、氮、硫、鹵素等原子所取代 由于這類原子中有孤對n電子(如HH2、OH、S、X等)n電子較電子容易激發(fā)，可產(chǎn)生n*躍遷，此種躍遷所需能量較*小。含這些原子的化合物在150250 nm的紫外區(qū)有吸收峰、少部分在近紫外區(qū)(200 nm)有吸收。表65列出了能進行n*躍遷的一些基團和原子。第38頁/共90頁第39頁/共90頁 3不飽和碳氫化合物 含有鍵電子，它比n電子

22、更易于激發(fā)可以產(chǎn)生*躍遷，此種躍遷的能量較*及n*都小。吸收峰大都位于紫外區(qū)(200 nm)。 具有共軛雙鍵的化合物，由于相間的與鍵相互作用。形成大鍵，使電子更容易激發(fā)，可使吸收峰波長向長波方向移動。共軛分子的吸收光譜通常有兩條譜帶，一種稱為K帶(德文“共軛作用”得名)，是由*躍遷所產(chǎn)生。這種躍遷是整個共軛鍵的基態(tài)向激發(fā)態(tài)的躍遷。例如CCCCCCCC；另一種稱為R帶(德文“基團”得名)為n*躍遷所產(chǎn)生。為共軛體系一端的單個生色基的躍遷。如CO、NO2、NN、NO等。 第40頁/共90頁第41頁/共90頁 4芳香族化合物 主要包括苯及芳香雜環(huán)的衍生物： (1)苯：苯為環(huán)狀共軛體系。 其紫外光譜特

23、征是具有*躍遷所引起的三組譜帶。 在180184nm處(47000)、有強吸收的E1帶，因在遠紫外區(qū)，實用意義不大。 在204nm處(7900)有中強吸收的E2帶，E2帶在末端范圍，也不常用。 在230270 nm處(200)有弱吸收的B帶。B帶是由*躍遷及振動效應(yīng)的重疊引起的一系列銳峰，又稱“精細結(jié)構(gòu)”吸收峰。在氣體或非極性溶劑中精細結(jié)構(gòu)較清楚，在極性溶劑中，精細結(jié)構(gòu)消失。圖67、圖68分別為苯的紫外光譜及苯酚的B吸收帶。第42頁/共90頁第43頁/共90頁 (2)苯的單取代物： 在苯環(huán)上有取代基時，復(fù)雜的B吸收帶一般都簡單化，向長波移動，同時吸收強度增加。 烷基取代：由于超共軛作用(hyp

24、erconjugation)產(chǎn)生紅移，但效應(yīng)不大。 帶弧對電子基團取代：如NH2、OH、OK等由于弧對電子與苯環(huán)上的電子產(chǎn)生n共軛使吸收強度增加產(chǎn)生紅移。 與苯環(huán)共軛的不飽和基團取代：如CHCH、CO、NO2等。由于共軛，產(chǎn)生新的電子軌道，使波長顯著紅移。 總之、取代苯對光譜紅移影響的大小與取代甚的拉電子和推電子的程度有關(guān)。表67列出一些單取代苯的紫外吸收數(shù)據(jù) 第44頁/共90頁第45頁/共90頁 (3)苯的二取代物： 在二取代苯中，由于取代基的性質(zhì)和取代位置不同，產(chǎn)生的影響也不同。 當一個吸電基(如NO2、CO)及一個供電基(如OH、OCH3、X)互為對位時，由于兩代基的效應(yīng)相反，產(chǎn)生協(xié)同作

25、用，使波長顯著紅移。若兩個效應(yīng)相反的取代基互為間位或鄰位時，則二取代苯與各單取代苯的波長區(qū)別很小。例如 為280nm， 為 380nm， 為280nm。NH2NH2NO2NH2O2N第46頁/共90頁 當兩個取代基都是吸電基或都是供電基時，由于效應(yīng)相同，兩個基團不能協(xié)同，則吸收峰往往不超過單取代基時的波長，且鄰、間、對位三個異構(gòu)體的波長也相近。例如 為260nm， 為258nm， 為255nm， 為255nm。 NO2COOHNO2COOHO2NCOOHNO2第47頁/共90頁 (4)稠環(huán)芳香族化合物： 此類化合物由于共軌體系增加，使波長紅移，吸收強度增加。 例如萘有三個吸收譜帶，E1譜帶為2

26、20nm，100000，E2譜帶為275nm，5700，B吸收帶為312nm，250。菲的譜帶E1為252nm，50000，E2293nm，16000，B譜帶為330 nm，250。表69列出了一些稠環(huán)芳烴的吸收譜帶。第48頁/共90頁第49頁/共90頁 (5)雜芳環(huán)化合物 五元雜芳環(huán)化合物：如吡咯、呋喃、噻吩，可看作是環(huán)戊二烯的C1被雜原子取代。因此，紫外光譜與環(huán)戊二烯相似。一般有兩個吸收峰，在200 nm附近有一個峰，屬K帶，在238nm附近還有一個峰，類似苯環(huán)的B帶。例如： 200nm，238.5nm 200nm，252nm 211nm，240nm 231nm，269.5nm 六元雜芳環(huán)

27、化合物：六元雜芳環(huán)化合物的紫外光譜與苯相類似，例吡啶在257nm有吸收峰與苯的B帶相似，也有精細結(jié)構(gòu)，而其n*躍遷引起的弱峰多被B帶覆蓋。極性溶劑可使吡啶的B帶吸收強度明顯增高，這可能是吡啶氮原子上的弧對電子與極性溶劑形成氫鍵的原故。ONHS第50頁/共90頁 5吸收譜帶 躍遷類型相同的吸收峰稱為吸收譜帶又稱吸收帶?；衔锝Y(jié)構(gòu)不同，躍遷類型不同、因而有不同的吸收帶。在前面化合物結(jié)構(gòu)與電子躍遷的關(guān)系中已提到各種吸收帶?，F(xiàn)將吸收帶的種類與特點扼要總結(jié)如下： (1)R吸收帶：由n*躍遷產(chǎn)生的吸收帶，它具有雜原子和雙鍵的共軛基團。如， ，NO2，NC等。該帶的特點是吸收強度很弱，處于長波方向，吸收峰波

28、長一般在270 nm以上。 (2)K吸收帶：由共軛的*躍遷產(chǎn)生的吸收帶，其特點是吸收峰很強104。共軛雙鍵增加，波長紅移，而且吸收強度增加。K帶是共軛分子的特征吸收帶，借此可判斷化合物中共軛結(jié)構(gòu)。CO第51頁/共90頁 (3)B吸收帶：這是芳香族化合物的特征吸收帶，由苯的*躍遷所產(chǎn)生。為一寬峰并出現(xiàn)精細結(jié)構(gòu)。吸收峰在230一270 nm之間，B帶的精細結(jié)構(gòu)常用來識別芳香族化合物，但當苯環(huán)取代后或用極性溶劑時，精細結(jié)構(gòu)消失。 (4)E吸收帶；E帶可分為El、E2兩個吸收帶。二者可分別看成是苯環(huán)中的乙烯鍵和共軛乙烯鍵所引起的，也屬*躍遷。E1帶吸收峰在l 84nm左右，在遠紫外區(qū)不常用。E2帶在2

29、03nm處有吸收，E2帶有些書籍也稱它為K帶。E2帶可因苯環(huán)上引入助色基而向紅移。當苯環(huán)上引入生色基時，吸收峰顯著紅移，此時E2帶就稱為K帶。第52頁/共90頁五、定 量 分 析（一）試 樣 的 制 備 1溶劑的選擇 可見紫外分光光度測定，通常都是在溶液中進行，因此選擇合適的溶劑十分重要。 選擇溶劑應(yīng)考慮的原則是：對試樣有良好的溶解能力和選擇性；在測定波段內(nèi)溶劑本身無明顯吸收；溶劑不得與被測組分發(fā)生化學(xué)反應(yīng)；被測組分在溶劑中具有良好的吸收峰形。 對于紫外光譜分析，選擇溶劑更為重要，因為極性溶劑對電子躍遷產(chǎn)生的譜帶有影響。因此在紫外測定時，在溶解度允許的范圍內(nèi)，應(yīng)盡量選擇極性小的溶劑。分光光度法

30、常用的有機溶劑見表610。第53頁/共90頁第54頁/共90頁 2樣品的凈化 樣品中含有雜質(zhì)，會直接影響分光光度法的測定結(jié)果，因此，測定前必須進行凈化。 農(nóng)藥原藥和制劑中都含有許多雜質(zhì)，測定前都必須進行凈化處理，常用的方法有薄層層析、液液分配、柱凈化等。也可以用水解、氧化還原或調(diào)節(jié)酸堿性方法等，消除干擾。第55頁/共90頁(二)測量條件的選擇 1波長的選擇 應(yīng)選擇被測組分最強吸收帶的最大吸收波長(max)作為測量波長。因為在max處，待測組分每單位濃度的吸光度值變化最大，測量靈敏度較高，而且吸收曲線在最大波長附近較為平坦，可以較好的遵守比爾定律。 有時為避開雜質(zhì)的干擾，而選擇靈敏度稍低的不受干

31、擾的次強吸收峰或肩峰等進行測量。 2狹縫寬度的選擇 狹縫寬度直接影響測定靈敏度和校正曲線的線性范圍。狹縫寬度增大，在一定范圍內(nèi)可使靈敏度下降，校正曲線線性變壞，偏離比爾定律。狹縫也不是越小越好，狹縫太小，入射光強度變?nèi)?，也不利于測定。一般應(yīng)選擇不減少吸光度時的最大狹縫寬度為測量寬度。第56頁/共90頁 3吸光度與濃度之間關(guān)系的確定 在確定了分析條件之后，必須用一系列標準溶液制作一條標準曲線，標推曲線的濃度范圍應(yīng)接近實際試樣的濃度，并在此濃度上下一定范圍包括待測樣品的濃度范圍，通過標準曲線的制作，可以了解遵循比爾定律的濃度范圍。 4空白溶液的選擇 空白溶液亦稱為參比溶液，在分光光度法測定樣品時都

32、需要有空白溶液作為參比。在儀器上將空白溶液的透光率調(diào)成100，以作為測量時的相對標準。 空白溶液除了具有參比作用外，在分光光度測定中，還可以用來抵消某些雜質(zhì)的干擾例如所用試劑或溶劑不純、顯色劑本身有顏色、以及無法去除的雜質(zhì)色澤等，都會影響吸光度的測定，此時可用相應(yīng)的空白溶液消除其影響。第57頁/共90頁 (三)反 應(yīng) 條 件 1顯色劑的選擇 在可見光區(qū)進行分光光度測定時，常需選擇合適的顯色劑將被測組分轉(zhuǎn)變?yōu)橛猩衔锘蚪j(luò)合物，然后進行測定。 選擇顯色劑的原則是： 顯色反應(yīng)靈敏度高，般應(yīng)在100 ppm以內(nèi)； 顯色劑選擇性好，對雜質(zhì)無反應(yīng)或反應(yīng)??； 顯色穩(wěn)定性好，生成的有色化合物顏色要穩(wěn)定，組成

33、要恒定； 符合比爾定律； 受溶液的酸度、溫度等因子影響要小等。 第58頁/共90頁 2顯色條件的選擇 顯色條件包括試劑的濃度、溶液的酸度、顯色時間、反應(yīng)溫度、雜質(zhì)的干擾等。 (1)試劑的濃度： 顯色過程中加入的試劑或顯色劑的量，會影響有色化合物的組成，常使顏色發(fā)生變化，因此試劑(顯色劑)的加入量必須通過實驗確定，應(yīng)做一條吸光度與試劑(顯色劑)濃度的變化曲線，在吸光度值恒定的范圍內(nèi)確定試劑(顯色劑)的濃度。 (2)溶液的酸度： 顯色過程都是在一定的酸度條件下進行的，酸度高低對絡(luò)合物的形成，顏色的穩(wěn)定性，水解、沉淀等都有很大影響。顯色反應(yīng)的最佳酸度范圍可以通過實驗確定，即做一條吸光度與溶液pH值的

34、變化曲線，在吸光度值恒定部分對應(yīng)的pH值，即為最佳酸度范圍。第59頁/共90頁 (3)顯色時間： 顯色過程中由于顯色反應(yīng)不同，需要的時間也不同，有時顏色不穩(wěn)定，放置時間過長就會變色或退色，影響測定結(jié)果。因此，顯色反應(yīng)后，必須在適當時間內(nèi)測定吸光度，通過實驗確定合適的顯色時間。 (4)反應(yīng)溫度： 顯色反應(yīng)一般在室溫下進行，但個別反應(yīng)需要在特定的溫度下進行，因此，需要根據(jù)反應(yīng)性質(zhì)選擇合適的反應(yīng)溫度。 (5)雜質(zhì)的干擾： 試樣中的雜質(zhì)對顯色反應(yīng)會造成很大干擾，必須去除雜質(zhì)干擾的影響。 去除雜質(zhì)的方法有：加入掩蔽劑，選擇合適的顯色條件；選擇不受干擾的測定波長，利用空白溶液的抵消或通過薄板、柱層析、離子

35、交換等方法，使被測組分與干擾雜質(zhì)分離。第60頁/共90頁六、在農(nóng)藥分析中的應(yīng)用(一)農(nóng)藥分析的特點 1測量范圍廣 大多數(shù)農(nóng)藥為芳香族化合物，化合物本身或其衍生物在可見紫外區(qū)都有吸收峰。在農(nóng)藥分析上，配合薄層法凈化，可用于測定原藥及制劑中有效成分含量，也可劇定農(nóng)藥殘留量及痕量農(nóng)藥，其靈敏度和準確度可與近代儀器相比美。 2操作簡便快速 可見紫外分光光度計，儀器成本較低，易于掌握隨著近代分光光度計的產(chǎn)生，在測量計算方面通過微機控制，使測定結(jié)果既快速又準確， 3有較好的準確度 一般的濃度測量，相對誤差在13范圍內(nèi)。如用示差分光光度法，誤差可以減少到千分之幾。 4既可定量也可用于定性 除可用于大多數(shù)農(nóng)藥

36、的定量分析外，還可以作為定性手段，并常和紅外光譜、核磁共振相配合，作為定性鑒定的工具。第61頁/共90頁(二)可見比色分析 可見比色分析法就是吸收光譜在可見光范圍內(nèi)的分光光度法?？梢姽獠ㄩL范圍是由紫色的400nm到紅色的760nm。 隨著分光光度計的發(fā)展，比色測定已由分光光度計代替了舊時的比色計。分光光度計與比色計相比，具有準確、省時、選擇性好的優(yōu)點，現(xiàn)代的分光光度計都具有掃描功能，可以通過吸收曲線，找出被測物質(zhì)的最佳吸收波段，還可以從吸收曲線上選擇合適的條件，以減少雜質(zhì)的干擾。第62頁/共90頁 農(nóng)藥的可見光比色分析有以下幾種情況： 農(nóng)藥有效成分本身帶有顏色，可以直接進行比色，這種農(nóng)藥數(shù)量很

37、少，如敵克松原藥為黃棕色，在波長435nm處有最大吸收峰。故可直接進行比色測定。 農(nóng)藥本身無色，經(jīng)化學(xué)反應(yīng)，引入或生成一個顯色基團而變成有顏色的化合物，此過程稱為“顯色”，大多數(shù)農(nóng)藥都需要顯色，才能進行測定。 (1)經(jīng)化學(xué)反應(yīng)可以生成有色化合物，如對硫磷經(jīng)堿解后形成對硝基酚而呈黃色。五氯酚經(jīng)氧化形成四氯代苯醌呈黃色。 (2)引入顯色基團生成有色化合物：如農(nóng)藥經(jīng)酸、堿水解產(chǎn)生酚類或芳胺，可與偶氮試劑進行偶合形成有色化合物，偶氮試劑則稱為顯色劑。第63頁/共90頁 1含氯農(nóng)藥的顏色反應(yīng) (1)吡啶堿顯色反應(yīng)(Fujiwara反應(yīng)) 含鹵素農(nóng)藥在堿性溶液中，與吡啶短時間加熱，至少有兩個鹵原子和一個碳

38、原子成鍵，產(chǎn)生紅色或藍色。 如DDT與含有呫啐酚的吡啶溶液及氫氧化鉀加熱生成紅色。可在510 nm處測定光密度。 三氯殺螨醇在堿性條件下，水解產(chǎn)生氯仿，氯仿在堿吡啶作用下生成紅色，可在535nm處測光密度。氯丹可以產(chǎn)生紫色(404nm)，毒殺芬可產(chǎn)生黃色(400 nm)，七氯、克菌丹、敵敵畏等都有此反應(yīng)，反應(yīng)過程中，含有水或乙醇對顏色形成有干擾。 第64頁/共90頁 (2)硝化甲醇鈉法；含氯芳香族農(nóng)藥，經(jīng)硝化后加甲醇鈉，形成四硝基衍生物，經(jīng)分子重排變?yōu)轷剑仕{色。如對位DDT、對位DDD及三氯殺螨醇形成藍色(598nm)；DDE，DDA形成紅色（420nm），鄰位DDT形成紫色(590511

39、nm)。第65頁/共90頁 六六六需加堿水解成l，2，4三氯代苯再經(jīng)硝化與甲醇鈉反應(yīng)形成6氯2，4二硝基間苯二酚，呈黃色，可在415nm處測定光密度。 666C H Cl12 42 46 堿硝化乙醇鈉， ，三氯苯，二硝基 氯間苯二酚第66頁/共90頁 (3)脫氯磺化顯色反應(yīng)： DDT，甲氧 DDT等在1乙醇氫氧化鉀镕液中，脫掉一分子氯化氫，再與濃硫酸反應(yīng)，即呈現(xiàn)顏色，DDT為桃紅色；甲氧DDT為紫色。 (4)二苯胺氯化鋅顯色反應(yīng)： 狄氏劑、毒殺芬等經(jīng)與二苯胺、氯化鋅混合熔融，而形成藍綠色化合物，將此化合物用丙酮或冰醋酸溶解，即可進行比色。 (5)濃硫酸與鉻變酸顯色反應(yīng)； 鹵代苯氧乙酸類與濃硫酸

40、反應(yīng)產(chǎn)生甲醛，再與鉻變酸(1，8二羥萘、3，6二磺酸)加熱到150出現(xiàn)紫色。第67頁/共90頁 2含磷農(nóng)藥的顏色反應(yīng) (1)鉬藍比色法測全磷： 含磷農(nóng)藥用高氯酸及硫酸混合液，消化分解成無機磷，在酸性條件下與鉬酸銨及偏釩酸銨反應(yīng)形成磷鉬雜多酸，顯黃色，在420 nm處測定光密度。 PO3312MoO423NH424H (NH4)3PO412MoO312H2O 如在鉬酸銨中加入1氨基2萘酚4磺酸試劑或SnCl2則顯藍色，在735nm處測定光密度，所有有機磷農(nóng)藥均可用此法測定全磷含量。第68頁/共90頁 (2) 4(對硝基芐基)吡啶(NBP)反應(yīng)： 有機磷農(nóng)藥在乙醇中與4(對硝基芐基)吡啶在100加

41、熱1217min，冷卻后加入四乙撐戊胺丙酮液(或嗎啉丙酮液)30 min呈藍色，在580 nm處測定光密度。此法可測定馬拉硫磷、樂果、倍硫磷等含硫或不含硫有機磷農(nóng)藥。第69頁/共90頁 (3)皂化比色法： 含硝基有機磷化合物，堿解后，產(chǎn)生對硝基苯酚化合物，呈黃色，可在420480nm波長范圍內(nèi)測光密度。如對硫磷、甲基對硫磷、殺螟松均可用此法測定。 (4)與氯化鈀反應(yīng)： 含硫磷酸酯類在酸性條件下與氯化鈀反應(yīng)形成黃色或褐色螯合物。二硫代磷酸酯形成11螯合物，一硫代形成12螯合物。 第70頁/共90頁 (5)形成銅鹽絡(luò)合物： 二硫代磷酸酯類，在堿性條件下，水解成二烷基二硫代磷酸，與銅離子在四氯化碳溶液中反應(yīng)，呈黃綠色，在420 nm下測定光密度。如馬拉硫磷、甲拌磷、乙硫磷、亞胺硫磷等均有此反應(yīng)。但樂果無此反應(yīng)，因樂果堿解后生成硫代磷酸和硫醇：第71頁/共90頁 3氨基甲酸酯類 氨基甲酸酯類農(nóng)藥經(jīng)堿解后形成酚類與偶氮試劑反應(yīng)形成重氮鹽而顯色。 甲萘威、克百威等經(jīng)堿解后生成萘酚，與對硝基苯偶氮氟硼酸的甲醇溶液反應(yīng)，呈黃色，在590 nm處測光密度或加入對硝基氯化重氮苯在酸性條件下呈黃褐色。第72頁/共90頁 速滅威等經(jīng)堿解后生成苯酚類，在弱酸下與對硝基氯化重氮苯反應(yīng)呈黃色。如在堿性條件下，則形成亮紅色染料可在490 nm處測定光密度。第73頁