液體內(nèi)沉淀試驗(yàn)PPT課件

1、第六章 沉淀反應(yīng)第六章第六章 沉淀反應(yīng)沉淀反應(yīng)第一節(jié)第一節(jié) 沉淀反應(yīng)的特點(diǎn)沉淀反應(yīng)的特點(diǎn)第二節(jié)液體內(nèi)沉淀試驗(yàn)第二節(jié)液體內(nèi)沉淀試驗(yàn) 一、絮狀沉淀試驗(yàn)一、絮狀沉淀試驗(yàn) 二、免疫濁度測(cè)定二、免疫濁度測(cè)定第三節(jié)凝膠內(nèi)沉淀試驗(yàn)第三節(jié)凝膠內(nèi)沉淀試驗(yàn) 一、單向擴(kuò)散試驗(yàn)一、單向擴(kuò)散試驗(yàn) 二、雙向擴(kuò)散試驗(yàn)二、雙向擴(kuò)散試驗(yàn)第四節(jié)第四節(jié) 免疫電泳技術(shù)免疫電泳技術(shù) 一、對(duì)流免疫電泳一、對(duì)流免疫電泳 二、火箭免疫電泳二、火箭免疫電泳 三、免疫電泳三、免疫電泳 四、免疫固定電泳四、免疫固定電泳思考題小結(jié)第一節(jié)第一節(jié) 沉淀反應(yīng)原理及特點(diǎn)沉淀反應(yīng)原理及特點(diǎn)沉淀反應(yīng)（precipitation）是指可溶性抗原與相應(yīng)抗體在適當(dāng)條

2、件（ph、電解質(zhì)等）下發(fā)生特異性結(jié)合而出現(xiàn)的沉淀現(xiàn)象,其特性與經(jīng)典的抗原抗體反應(yīng)相同。1898年kraus首次發(fā)現(xiàn)毒素-抗毒素的沉淀現(xiàn)象；1905年bechgold 發(fā)現(xiàn)沉淀可以在明膠中進(jìn)行；1965年mancini發(fā)明單向免疫擴(kuò)散技術(shù)；上世紀(jì)70年代免疫濁度法出現(xiàn)。上述技術(shù)的發(fā)明發(fā)展，使得沉淀反應(yīng)向快速、準(zhǔn)確、微量、自動(dòng)化方向發(fā)展，在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中的應(yīng)用越來越廣泛。形成肉眼可見的大的免疫復(fù)合物。沉淀線或沉淀環(huán)的觀察以及免疫比濁法中的終點(diǎn)法就是測(cè)定此階段形成的復(fù)合物第一階段第二階段沉淀反應(yīng)分兩個(gè)階段抗原抗體特異性結(jié)合，快速但不可見。免疫比濁法中的速率法就是利用此階段測(cè)定免疫復(fù)合物形成的速率。經(jīng)典的

3、沉淀反應(yīng)在第二階段觀察或測(cè)量沉淀線或沉淀環(huán)等來判斷結(jié)果，稱為終點(diǎn)法需要幾十分鐘到數(shù)小時(shí)；在第一階段測(cè)定免疫復(fù)合物形成的速率，稱為速率法。免疫濁度測(cè)定絮狀沉淀試驗(yàn)單向擴(kuò)散試驗(yàn)雙向擴(kuò)散試驗(yàn)對(duì)流免疫電泳火箭免疫電泳免疫電泳免疫固定電泳液體內(nèi)沉淀試驗(yàn)?zāi)z內(nèi)沉淀試驗(yàn)?zāi)z免疫電泳技術(shù)沉淀反應(yīng)可分三類第二節(jié)液體內(nèi)沉淀試驗(yàn)第二節(jié)液體內(nèi)沉淀試驗(yàn) 絮狀沉淀試驗(yàn)是將抗原與相應(yīng)抗體混合，在電解質(zhì)存在的條件下，抗原抗體結(jié)合形成肉眼可見的絮狀沉淀物。方法受抗原抗體比例的影響非常明顯應(yīng)用于測(cè)定抗原抗體反應(yīng)的最適比例(三種類型)一、 絮狀沉淀試驗(yàn)抗原稀釋法：抗原最適比例抗體稀釋法：抗體最適比例方陣滴定法：抗原抗體最適比例絮狀

4、沉淀試驗(yàn)將抗原作系列稀釋，與恒量濃度的抗血清等量混合反應(yīng)后，產(chǎn)生的沉淀物隨抗原量的變化而不同?？乖贵w比例適當(dāng)時(shí)，形成的沉淀物最多。將抗體作系列稀釋，與恒量濃度的抗血清等量混合反應(yīng)后，產(chǎn)生的沉淀物隨抗體量的變化而不同。將以上兩種方法結(jié)合，將抗原抗體同時(shí)稀釋，找出最佳比例。表表6-1 6-1 最適比方陣測(cè)定法最適比方陣測(cè)定法抗體抗體稀釋度稀釋度抗原稀釋度抗原稀釋度1/101/101/201/201/401/401/801/801/1601/1601/3201/3201/6401/640對(duì)照對(duì)照1/51/5+ + + + + + + + + + + + + + +1/101/10+ + + + +

5、 + + + + + + + + + +1/201/20+ + + + + + + + + + + + + + +1/401/40+ + + + + + + + + + +1/801/80+ + + + 當(dāng)當(dāng)可溶性抗原可溶性抗原與相應(yīng)抗體特異結(jié)合，二者比例合與相應(yīng)抗體特異結(jié)合，二者比例合適時(shí)，在特殊的緩沖液中它們快速形成一定大小適時(shí)，在特殊的緩沖液中它們快速形成一定大小的抗原抗體復(fù)合物，使反應(yīng)液體出現(xiàn)濁度的改變的抗原抗體復(fù)合物，使反應(yīng)液體出現(xiàn)濁度的改變。利用現(xiàn)代光學(xué)測(cè)量儀器與自動(dòng)化檢測(cè)分析相結(jié)。利用現(xiàn)代光學(xué)測(cè)量儀器與自動(dòng)化檢測(cè)分析相結(jié)合對(duì)濁度進(jìn)行測(cè)定從而檢測(cè)微量抗原或抗體合對(duì)濁度進(jìn)行測(cè)定從而檢

6、測(cè)微量抗原或抗體。 原 理二、免疫濁度測(cè)定1.1.抗原抗體的比例：反應(yīng)體系中保持抗體過量抗原抗體的比例：反應(yīng)體系中保持抗體過量高劑量鉤狀反應(yīng)(high dose hook effect)：當(dāng)抗原過剩時(shí)，形成的ic分子小，而且容易離解，濁度反而下降。用抗體檢測(cè)抗原，當(dāng)反應(yīng)液中抗體過量時(shí)，在一定范圍內(nèi)，ic的形成量與抗原量的遞增正比，當(dāng)抗原量遞增至抗原抗體最佳比例時(shí)，ic的形成到達(dá)高峰。如再增加抗原量，ic的形成量反而減少。因此，如檢測(cè)時(shí)抗原過量則得出錯(cuò)誤的檢測(cè)結(jié)果。 反應(yīng)體系中保持抗體過量。2.2.抗體的質(zhì)量抗體的質(zhì)量 ：特異性強(qiáng)，效價(jià)高，親和力：特異性強(qiáng)，效價(jià)高，親和力強(qiáng)并使用強(qiáng)并使用r r型

7、抗體型抗體( (等價(jià)帶寬等價(jià)帶寬) ) 3.3.抗原抗體反應(yīng)液的最適抗原抗體反應(yīng)液的最適phph為為6.56.58.5 8.5 4.4.使用增濁劑使用增濁劑影響因素免疫濁度測(cè)定1.1.透射免疫比濁法透射免疫比濁法2.2.散射免疫比濁法散射免疫比濁法 3.3.免疫膠乳比濁法免疫膠乳比濁法 分類免疫濁度測(cè)定l經(jīng)典的沉淀試驗(yàn)有四個(gè)缺點(diǎn)無法克服：操作繁瑣；靈敏度低(10-100g)；時(shí)間長；難以自動(dòng)化。 第三節(jié)凝膠內(nèi)沉淀試驗(yàn)第三節(jié)凝膠內(nèi)沉淀試驗(yàn) 可溶性抗原和相應(yīng)抗體在凝膠中擴(kuò)散，形成可溶性抗原和相應(yīng)抗體在凝膠中擴(kuò)散，形成濃度梯度，在抗原抗體相遇并且濃度比例適濃度梯度，在抗原抗體相遇并且濃度比例適當(dāng)?shù)奈?/p>

8、置形成肉眼可見的沉淀線或沉淀環(huán)。當(dāng)?shù)奈恢眯纬扇庋劭梢姷某恋砭€或沉淀環(huán)。 常用的凝膠有瓊脂、瓊脂糖、葡聚糖或聚丙常用的凝膠有瓊脂、瓊脂糖、葡聚糖或聚丙烯酰胺凝膠。烯酰胺凝膠。要求：要求：1 1、單價(jià)特異性抗血清（是指血清只與其、單價(jià)特異性抗血清（是指血清只與其特異性抗原發(fā)生反應(yīng)）；特異性抗原發(fā)生反應(yīng)）； 2 2、標(biāo)準(zhǔn)品；、標(biāo)準(zhǔn)品； 3 3、靈敏度、靈敏度1.251.25g/ml原理原理：抗體與待測(cè)的抗原,在兩者比例合適的部位結(jié)合形成沉淀環(huán)。環(huán)的大小與抗原的濃度成正相關(guān)。技術(shù)要點(diǎn)：將抗體混入0.9%瓊脂糖內(nèi)（50），未凝固前傾注成平板，凝固后打孔（直徑35mm ），孔中加入抗原溶液和不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)

9、品，置濕盒內(nèi)37,2448h 觀察孔周圍是否出現(xiàn)沉淀環(huán)。定量試驗(yàn) 一、單向擴(kuò)散試驗(yàn) （平板法）傾注平板打孔加樣 放置372448h觀察沉淀環(huán) 單向擴(kuò)散試驗(yàn)（平板法）沉淀環(huán)的直徑與待測(cè)標(biāo)本含量兩種計(jì)算方法mancini曲線：大分子抗原（igm） 時(shí)間擴(kuò)散48h，常數(shù)kcd2普通坐標(biāo)紙曲線 fahey曲線：小分子抗原（igg,iga）擴(kuò)散時(shí)間24h常數(shù)klogcd 半對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙曲線 c為抗原濃度， d為沉淀環(huán)直徑單向擴(kuò)散試驗(yàn) （平板法）t1為1624h；t2為2448h；t3為48h以上,可見t3為直線，t1為反拋物線t1為1624h；t2為2448h；t3為48h以上,可見t1為直線，t3為反拋

10、物線mancini曲線fahey曲線影響因素：影響因素：抗體質(zhì)量抗體質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)準(zhǔn)曲線 ，質(zhì)控血清，質(zhì)控血清結(jié)果與真實(shí)含量不符結(jié)果與真實(shí)含量不符單克隆抗體單克隆抗體+ +多態(tài)性抗原多態(tài)性抗原= =假性假性降低；降低； 多克隆抗體多克隆抗體+ +單克隆病單克隆病= =假性假性升高；升高；雙環(huán)現(xiàn)象雙環(huán)現(xiàn)象抗原性相同、擴(kuò)散率不同的兩抗原性相同、擴(kuò)散率不同的兩個(gè)組分：個(gè)組分：重鏈病人血清中的重鏈病人血清中的重鏈與正常重鏈與正常iga單向擴(kuò)散試驗(yàn)上排為5個(gè)不同濃度的參考品；下排為患者血清，下排右2為異常病理血清 單向擴(kuò)散試驗(yàn) （平板法） 原理：將抗原抗體分別加在瓊脂糖不同的對(duì)應(yīng)孔中，兩者在凝膠中自由擴(kuò)

11、散，在比例合適處形成白色沉淀線。 技術(shù)要點(diǎn)：平板玻璃上傾注一層均勻的瓊脂糖薄層，凝固后打孔，孔徑為3mm，孔間距在35 mm之間，在相對(duì)的孔中加入抗原或抗體，放置濕盒371824h 后，觀察孔周圍是否出現(xiàn)沉淀環(huán)。鑒定抗原抗體的最基本、最常見的方法之一 二、雙向擴(kuò)散試驗(yàn) （平板法）1. 抗原或抗體的存在與否以及相對(duì)含量(位置)的估計(jì)2.抗原或抗體相對(duì)分子量（形狀）的估計(jì) 雙向擴(kuò)散試驗(yàn) （平板法）應(yīng)用3.抗原性質(zhì)的分析 雙向擴(kuò)散試驗(yàn) （平板法）ababab應(yīng)用4.抗體效價(jià)的滴定 5.抗原或抗體純度的鑒定 :mixag+ab / mixab+ag= one band(pure)/ several b

12、and(impure)雙向擴(kuò)散試驗(yàn) （平板法）簡(jiǎn)單易行，用途廣泛；靈敏度低1.25g/ml，反應(yīng)慢，不能精確定量雙向擴(kuò)散試驗(yàn) （平板法）第四節(jié)免疫電泳技術(shù)第四節(jié)免疫電泳技術(shù)優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)： 1. 1.加快反應(yīng)的速度。加快反應(yīng)的速度。 2. 2.提高了靈敏度（提高了靈敏度（g/ml）。）。3.3.增加了分辨率。增加了分辨率。 電泳分析沉淀反應(yīng)抗原抗體反應(yīng)的高度特異性電泳技術(shù)的高分辨率、快速、微量免疫電泳技術(shù)原理：雙向擴(kuò)散+ 電泳比雙向擴(kuò)散試驗(yàn)靈敏度提高8 16倍技術(shù)要點(diǎn)：制備1.2%巴比妥瓊脂凝膠板，在其上成對(duì)打孔，孔徑3mm，孔距6 mm，于陰極側(cè)孔內(nèi)加待測(cè)血清，陽性側(cè)孔加抗血清，電泳條件34ma

13、/cm，30min1h，ph8.6 buffer。一、對(duì)流免疫電泳蛋白質(zhì)抗原常帶較強(qiáng)的負(fù)電荷，在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)抗體球蛋白(pi6-7)帶負(fù)電荷較少，籍電滲(水流)作用向負(fù)極泳動(dòng) 對(duì)流免疫電泳igg3/igg4igg1/igg2結(jié)果分析：結(jié)果分析：無沉淀線出現(xiàn)則表明無相無沉淀線出現(xiàn)則表明無相應(yīng)的抗原。應(yīng)的抗原。沉淀線位于抗原抗體孔中沉淀線位于抗原抗體孔中間，說明兩者比例較適合間，說明兩者比例較適合。沉淀線偏向抗原孔一方，沉淀線偏向抗原孔一方，表示抗體濃度抗原，反表示抗體濃度抗原，反之，則是抗體濃度抗原之，則是抗體濃度抗原濃度。濃度。對(duì)流免疫電泳+電泳時(shí)凝膠中抗體不移動(dòng)，樣品孔中的抗原向正極泳動(dòng)

14、，隨著抗原量的逐漸減少，抗原泳動(dòng)的基底區(qū)越來越窄，抗原抗體分子復(fù)合物形成的沉淀線逐漸變窄，形成一個(gè)形狀如火箭的不溶性復(fù)合物沉淀峰，抗體濃度固定時(shí)，峰的高度與抗原量呈正相關(guān)。 原理單向免疫擴(kuò)散電泳,定量檢測(cè)技術(shù)二、火箭免疫電泳1.2%巴比妥瓊脂糖約55，加入適量抗血清，混勻后制板，打孔，孔內(nèi)加待測(cè)樣品，樣品孔放負(fù)極側(cè)， 6h后觀察瓊脂板上沉淀峰，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出待測(cè)樣品濃度。技術(shù)要點(diǎn)火箭免疫電泳火箭免疫電泳圖為標(biāo)準(zhǔn)抗原；為標(biāo)本-+火箭免疫電泳示意圖沉淀峰高抗原濃度1.測(cè)定沉淀峰高度2.在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查找 相應(yīng)抗原濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線染色標(biāo)本結(jié)果火箭免疫電泳1.1.瓊脂（無電滲或電滲很小的）影響火箭形

15、狀不規(guī)則瓊脂（無電滲或電滲很小的）影響火箭形狀不規(guī)則。2.2.電泳終點(diǎn)時(shí)間的確定（電泳終點(diǎn)時(shí)間的確定（云霧狀、圓形云霧狀、圓形火箭窄峰火箭窄峰）。）。3.3.標(biāo)本數(shù)量多時(shí)應(yīng)先通電后加樣標(biāo)本數(shù)量多時(shí)應(yīng)先通電后加樣, ,防止寬底峰形防止寬底峰形. .4.igg4.igg定量時(shí)，可用甲醛與定量時(shí)，可用甲醛與iggigg上的氨基結(jié)合（甲?；系陌被Y(jié)合（甲酰化），只帶負(fù)電荷，抵消了電滲作用。），只帶負(fù)電荷，抵消了電滲作用。 影響因素火箭免疫電泳提高靈敏度：免疫自顯影技術(shù)（加入125i標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)抗原，免疫競(jìng)爭(zhēng)性法檢測(cè)目的抗原）原理：區(qū)帶電泳雙向擴(kuò)散1、將蛋白質(zhì)抗原在凝膠中電泳分成肉眼不可見的若干區(qū)帶 2

16、、沿電泳方向挖一與之平行的抗體槽，加入相應(yīng)抗血清進(jìn)行雙向擴(kuò)散 。 技術(shù)要點(diǎn)：制備瓊脂板打孔，加樣于孔內(nèi)，電泳23ma/cm ，0.51h后，槽內(nèi)加入相應(yīng)抗血清作雙向擴(kuò)散。三、免疫電泳純化抗原和抗體成分的分析及正常和異常免疫球蛋白的識(shí)別與鑒定影響因素抗原抗體比例不當(dāng),需測(cè)抗原抗體最適比 抗血清的的抗體譜 ，混合抗血清的使用電泳條件直接影響分辨率應(yīng)用免疫電泳+-免疫電泳示意圖骨髓瘤血清正常人血清albuminalpha 1alpha 2beta gamma免疫電泳原理，不同之處是將抗血清直接加于電泳后的蛋白質(zhì)區(qū)帶表面，抗原抗體在凝膠中直接發(fā)生沉淀反應(yīng)，在適當(dāng)位置形成抗原抗體復(fù)合物，經(jīng)染色后，可對(duì)各

17、類免疫球蛋白及其輕鏈進(jìn)行分型 原理區(qū)帶電泳沉淀反應(yīng)四、免疫固定電泳先將患者血清或血漿(未變性)在醋纖膜或瓊脂上作區(qū)帶電泳，根據(jù)血清蛋白質(zhì)的電荷不同將其分開，然后將igg、iga、igm、輕鏈和輕鏈的抗血清加于分離的蛋白質(zhì)泳道，參考泳道則加蛋白質(zhì)固定劑，用于區(qū)帶對(duì)照，作用一定時(shí)間后洗去游離蛋白質(zhì)，染色后則可見被固定的相應(yīng)m蛋白成分。 技術(shù)要點(diǎn)免疫固定電泳左圖為igg 型, 中圖為igg 型，右為正常（無單鏈） sp g am sp g am spg am 免疫固定電泳示意圖antibody:分辨率強(qiáng)，敏感度高，操作周期短，僅分辨率強(qiáng)，敏感度高，操作周期短，僅需數(shù)小時(shí)，結(jié)果易于分析。需數(shù)小時(shí)，結(jié)果

18、易于分析。 應(yīng)用最常用于m蛋白的鑒定與分型，也用于尿中本周氏蛋白質(zhì)的檢測(cè)與、 分型，腦脊液中寡克隆蛋白的檢測(cè)與分型。優(yōu)點(diǎn)免疫固定電泳m蛋白：經(jīng)免疫電泳及化學(xué)分析證明它是由單克隆漿細(xì)胞分泌的結(jié)構(gòu)均一的免疫球蛋白或多肽鏈亞單位(輕鏈)，即單克隆免疫球蛋白，或稱m蛋白。 1.1.主要用于血液、體液中蛋白質(zhì)的測(cè)定。主要用于血液、體液中蛋白質(zhì)的測(cè)定。2.2.優(yōu)點(diǎn)：穩(wěn)定性好，敏感度高，精確度高，簡(jiǎn)便快優(yōu)點(diǎn)：穩(wěn)定性好，敏感度高，精確度高，簡(jiǎn)便快速，易于自動(dòng)化，無放射性核素污染，適合大批量速，易于自動(dòng)化，無放射性核素污染，適合大批量標(biāo)本檢測(cè)。標(biāo)本檢測(cè)。3.3.對(duì)流免疫電泳與火箭免疫電泳技術(shù)由于電滲的緣對(duì)流免疫電泳與火箭免疫電泳技術(shù)由于電滲的緣故已不推薦使用。故已不推薦使用。4.4.免疫電泳擴(kuò)散時(shí)間長，影響因素多，結(jié)果不易分免疫電泳擴(kuò)散時(shí)間長，影響因素多，結(jié)果不易分析。析。5.5.免疫固定電泳分辨力強(qiáng)，敏感度高，結(jié)果易于分免疫固定電泳分辨力強(qiáng)，敏感度高，結(jié)果易于分析，常用于析，常用于m m蛋白的鑒定與分型。蛋白的鑒定與分型。 沉淀反應(yīng)在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中的應(yīng)用 沉淀反應(yīng)是指可溶性抗原與相應(yīng)抗體在適當(dāng)條件下發(fā)沉淀反應(yīng)是指可溶性抗原與相應(yīng)抗體在適當(dāng)條件下發(fā)生特異性結(jié)合而出的沉淀現(xiàn)象生