重組質(zhì)粒的構(gòu)建

1、.重組質(zhì)粒構(gòu)建生物學(xué)屠仁軍(新浪)一、載體與外源片段（PCR產(chǎn)物）的雙酶切為了保證做連接反應(yīng)時有足夠的外源DNA片段，應(yīng)該加入1ug的DNA進(jìn)行酶切反應(yīng)；兩種酶分別加1ul，10buffer 2ul，1ug的DNA，加水至20ul。（因此要跑膠分析DNA以及載體的濃度，取1-2ul，電泳檢測其含量。1ul體積太少，可以將其稀釋在9ul水中，再加loading buffer。6ul 15000bp的marker，2500bp條帶的亮度約是100ng DNA?？蓪Ρ萴arker的亮度算出酶切回收的DNA的濃度，以便于確定連接反應(yīng)時的用量。Image J軟件可以做灰度分析。）雙酶切反應(yīng)結(jié)束后，使用P

2、CR cleanup試劑盒回收DNA與載體。回收完之后用同樣的方法分析其濃度。（也可以用分光光度計直接測量DNA的濃度，但是，一般酶切反應(yīng)之后其濃度會比較小，取1ul稀釋100倍之后濃度很低，可能已經(jīng)低于儀器的測量范圍，而電泳靈敏度很高，還可一排除雜帶、RNA、蛋白質(zhì)等對濃度的干擾。）二、連接反應(yīng)載體100ng，DNA片段根據(jù)大小，1ul buffer，1ul T4連接酶，加水至10ul；16連接12-16h。載體（約0.03pmol）與外源DNA的摩爾比大約1：3-1：10之間，根據(jù)載體與DNA片段的長度，可算出需要的量。因?yàn)檩d體的大小一般在5kb-10kb，因此，嚴(yán)格的算出0.03pmol

3、的載體的質(zhì)量意義不大，大約100ng即可。如果時間比較緊張，可以25連接15min，之后可取5ul進(jìn)行轉(zhuǎn)化，剩余5ul于16繼續(xù)連接。三、質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌中從-70中取出感受態(tài)，指尖輕轉(zhuǎn)融化后立即插入冰上，5ul連接產(chǎn)物+100ul感受態(tài)大腸桿菌，充分混勻后冰浴30min，然后42熱激90s，熱激時不要晃動EP管。然后立即插入冰上，靜置2min。（連接產(chǎn)物的量盡量不超過感受態(tài)體積的5%，否則會降低轉(zhuǎn)化效率，從而得不償失。）在超凈臺中向EP管中加入700ul 無抗性LB培養(yǎng)基，然后37搖床培養(yǎng)45min-1h；4000rpm離心3min，在超凈臺中棄去700ul上清，然后輕輕吹打殘留的菌

4、液沉淀，涂平板；（涂平板的玻璃棒要在酒精燈上燒熱滅菌，后冷卻）37培養(yǎng)箱先正放15min，之后倒置培養(yǎng)12-16h。（超過16h，則陽性克隆周圍會生出衛(wèi)星菌落，原因是陽性克隆會分泌水解氨芐的酶到培養(yǎng)基中，水解其周圍的氨芐，因此，平板上的DH5、雜菌等會生長。）四、重組子的挑取培養(yǎng)挑選單克隆到2ml LB培養(yǎng)基中，37培養(yǎng)8-16h，可提質(zhì)粒。（要在管壁上部用注射器的針頭燒熱，戳個小洞，因?yàn)榇竽c桿菌是好氧的，無菌會生長緩慢）其實(shí)在挑克隆培養(yǎng)的時候就可以PCR鑒定，先配好PCR反應(yīng)體系，在超凈臺中，同一個克隆，一半用于搖菌培養(yǎng)，一半用小的槍頭挑取在對應(yīng)的PCR體系里涮一下，即可作為模版進(jìn)行PCR反

5、應(yīng)。PCR時要做陰性、陽性對照。陰性對照，用槍頭在沒有菌落的培養(yǎng)基上沾一下做模版（PCR靈敏度很高，要排除連接體系中的殘留的DNA對結(jié)果影響的可能），陽性對照用最初PCR擴(kuò)增DNA片段時的模版。也可以等37培養(yǎng)8-16h之后取1ul菌液做模版鑒定，或者提質(zhì)粒之后，用質(zhì)粒做模版進(jìn)行鑒定，均可。五、質(zhì)粒的提取與電泳檢測1.在超凈臺中取300ul菌液與無菌EP管中，4保存，待鑒定是否成功后取100ul菌液+100ul 50%甘油保種，送200ul菌液到公司測序，不正確的丟掉即可。（如果質(zhì)粒量很多，也可以送5-10ul質(zhì)粒測序）2.取1ml菌液到新的EP管,12000 rpm離心30s，棄上清，再將7

6、00ul剩余菌液于同一EP管，12000 rpm離心30s，棄上清。然后瞬時離心，將殘留液體吸干。（槍頭不能重復(fù)使用）3.加入預(yù)冷的200ul溶液I(4低溫保存)。反復(fù)吹打混勻。（一定要混勻，不然會影響裂解效果，可以用渦旋混合器震蕩混勻）4.加入200ul溶液II，蓋緊管口，輕輕快速顛倒離心管3-5次。（不要劇烈震蕩，防止基因組DNA、質(zhì)粒斷裂，可以懸空加試劑，這樣不用換槍頭，而且比較快，下同）5.觀察到溶液變清后，立即加入預(yù)冷的200ul溶液III。顛倒3-5次，顛倒時用手指輕彈離心管底部，混勻。冰浴5min。12000rpm離心10min。6.取400ul上清至另一干凈的離心管中（盡量不要

7、吸到白色的沉淀物質(zhì)，如果效果不理想，可以轉(zhuǎn)移400ul上清至新離心管，12000rpm，5min，之后在轉(zhuǎn)移上清），加入500ul異丙醇，充分混勻。室溫放置2min，12000rpm離心10min。7.棄上清，加入700ul 75%的乙醇，輕輕顛倒兩次，12000rpm離心5min，重復(fù)操作一次。8.棄上清，然后瞬時離心，用Tip頭將殘留酒精吸干?？諝庵懈稍?0min。9.加入50-100ul Elution Solution(65預(yù)熱)溶解質(zhì)粒。10.取1ul質(zhì)粒，加9ul DDW，2ul 6*loading buffer，混勻電泳檢測質(zhì)粒濃度。六、酶切鑒定或者PCR檢測大約酶切1ug質(zhì)粒進(jìn)

8、行鑒定。如果質(zhì)粒含量太少，即便能夠切下目的條帶，也有可能看不到。（為了節(jié)約，鑒定時取0.25-0.5ul的酶，20ul體系，酶切30min-1h，即可電泳跑膠）PCR檢測，則將提取的質(zhì)粒稀釋10-100倍到適合做模版的濃度（taq酶的說明書上有說明），利用目的片段的引物，使用普通的taq酶PCR即可。注意事項：1.移液器使用結(jié)束后調(diào)回最大量程放歸遠(yuǎn)處。2.本實(shí)驗(yàn)屬于微量操作，用量極少的步驟必須嚴(yán)格注意吸取量的準(zhǔn)確性并確保樣品全部加入反應(yīng)體系中。3.不論是酶切還是連接反應(yīng)，加樣的順序應(yīng)該是，先加雙蒸水，其次是緩沖液和DNA，最后加酶。而酶液要在加入前從-20的冰箱取出，酶管放置冰上，取酶液時吸頭

9、應(yīng)從表面吸取，防止由于插入過深而使吸頭外壁沾染過多的酶液。取出的酶液應(yīng)立即加入反應(yīng)混合液的液面以下，并充分混勻。4.Ep管的蓋子應(yīng)蓋緊，防止水浴過程中水汽進(jìn)入管內(nèi)，并做好標(biāo)記以防樣品混淆。5.制備凝膠時，應(yīng)避免瓊脂糖溶液在微波爐里加熱時間過長，否則溶液將會暴沸蒸發(fā)，影響瓊脂糖濃度。制膠時要除去氣泡。拔梳子時要特別小心，以防凝膠與支持物脫離。6.上樣時要小心操作，避免損壞凝膠或?qū)悠凡鄣撞康哪z刺穿。也不要快速擠出吸頭內(nèi)的樣品，避免擠出的空氣將樣品沖出樣品孔。7.紫外線對眼睛和皮膚均有傷害，對眼睛尤甚。觀察電泳條帶時要確保紫外光源得到適當(dāng)遮蔽，并應(yīng)戴好目鏡或眼罩，避免皮膚直接暴露在紫外線下。割膠

10、回收動作要快，避免紫外照射時間過長，使得DNA突變。8.實(shí)驗(yàn)中注意更換槍頭，以避免試劑的污染，懸空滴加試劑的話，可以連續(xù)使用。堿裂解法質(zhì)粒提取的原理溶液I，50 mM葡萄糖/25 mM Tris-Cl/10 mM EDTA，pH 8.0；溶液II，0.2 N NaOH/1% SDS；溶液III，3 M醋酸鉀/2 M醋酸。溶液I的作用葡萄糖后最大的好處只是懸浮后的大腸桿菌不會快速沉積到管子的底部。因此，如果溶液I中缺了葡萄糖其實(shí)對質(zhì)粒的抽提本身而言，幾乎沒有任何影響。所以說溶液I中葡萄糖是可缺的。EDTA是Ca2+和Mg2+等二價金屬離子的螯合劑，配在分子生物學(xué)試劑中的主要作用是：抑制DNase

11、的活性，和抑制微生物生長。在溶液I中加入高達(dá)10 mM的EDTA，無非就是要把大腸桿菌細(xì)胞中的所有二價金屬離子都螯合掉。如果不加EDTA，其實(shí)也沒什么大不了的，只要不磨洋工，只要是在不太長的時間里完成質(zhì)粒抽提，就不用怕DNA會迅速被降解，因?yàn)樽罱K溶解質(zhì)粒的TE緩沖液中有EDTA。如果哪天你手上正好缺了溶液I，可不可以抽提質(zhì)粒呢？實(shí)話告訴你，只要用等體積的水，或LB培養(yǎng)基來懸浮菌體就可以了。有一點(diǎn)不能忘的是，菌體一定要懸浮均勻，不能有結(jié)塊。溶液II的作用這是用新鮮的0.4 N的NaOH和2的SDS等體積混合后使用的。要新從濃NaOH稀釋制備0.4N的NaOH，無非是為了保證NaOH沒有吸收空氣中

12、的CO2而減弱了堿性。其實(shí)破細(xì)胞的主要是堿，而不是SDS，所以才叫堿法抽提。事實(shí)上NaOH是最佳的溶解細(xì)胞的試劑，不管是大腸桿菌還是哺乳動物細(xì)胞，碰到了堿都會幾乎在瞬間就溶解，這是由于細(xì)胞膜發(fā)生了從bilayer（雙層膜）結(jié)構(gòu)向micelle（微囊）結(jié)構(gòu)的相變化所導(dǎo)致。用了不新鮮的0.4 N NaOH，即便是有SDS也無法有效溶解大腸桿菌，自然就難高效率抽提得到質(zhì)粒。如果只用SDS當(dāng)然也能抽提得到少量質(zhì)粒，因?yàn)镾DS也是堿性的，只是弱了點(diǎn)而已。很多人對NaOH的作用誤以為是為了讓基因組DNA變性，以便沉淀，這是由于沒有正確理解一些書上的有關(guān)DNA變性復(fù)性的描述所導(dǎo)致。有人不禁要問，既然是NaO

13、H溶解的細(xì)胞，那為什么要加SDS呢？那是為下一步操作做的鋪墊。這一步要記住兩點(diǎn)：第一，時間不能過長，因?yàn)樵谶@樣的堿性條件下基因組DNA片斷會慢慢斷裂；第二，必須溫柔混合，不然基因組DNA也會斷裂?；蚪MDNA的斷裂會帶來麻煩。溶液III的作用溶液III加入后就會有大量的沉淀，但大部分人卻不明白這沉淀的本質(zhì)。最容易產(chǎn)生的誤解是，當(dāng)SDS碰到酸性后發(fā)生的沉淀。如果你這樣懷疑，往1%的SDS溶液中加如2M的醋酸溶液看看就知道不是這么回事了。大量沉淀的出現(xiàn)，顯然與SDS的加入有關(guān)系。如果在溶液II中不加SDS會怎樣呢，也會有少量的沉淀，但量上要少得多，顯然是鹽析和酸變性沉淀出來的蛋白質(zhì)。既然SDS不是

14、遇酸發(fā)生的沉淀，那會不會是遇鹽發(fā)生的沉淀呢？在1的SDS溶液中慢慢加入5 N的NaCl，你會發(fā)現(xiàn)SDS在高鹽濃度下是會產(chǎn)生沉淀的。因此高濃度的鹽導(dǎo)致了SDS的沉淀。但如果你加入的不是NaCl而是KCl，你會發(fā)現(xiàn)沉淀的量要多的多。這其實(shí)是十二烷基硫酸鈉（sodium dodecylsulfate）遇到鉀離子后變成了十二烷基硫酸鉀（potassium dodecylsulfate, PDS），而PDS是水不溶的，因此發(fā)生了沉淀。如此看來，溶液III加入后的沉淀實(shí)際上是鉀離子置換了SDS中的鈉離子形成了不溶性的PDS，而高濃度的鹽，使得沉淀更完全。大家知道SDS專門喜歡和蛋白質(zhì)結(jié)合，平均兩個氨基酸上

15、結(jié)合一個SDS分子，鉀鈉離子置換所產(chǎn)生的大量沉淀自然就將絕大部分蛋白質(zhì)沉淀了，讓人高興的是大腸桿菌的基因組DNA也一起被共沉淀了。這個過程不難想象，因?yàn)榛蚪MDNA太長了，長長的DNA自然容易被PDS給共沉淀了，盡管SDS并不與DNA分子結(jié)合。那么2 M的醋酸又是為什么而加的呢？是為了中和NaOH，因?yàn)殚L時間的堿性條件會打斷DNA，所以要中和之?；蚪MDNA一旦發(fā)生斷裂，只要是50100 kb大小的片斷，就沒有辦法再被PDS共沉淀了。所以堿處理的時間要短，而且不得激烈振蕩，不然最后得到的質(zhì)粒上總會有大量的基因組DNA混入，瓊脂糖電泳可以觀察到一條濃濃的總DNA條帶。很多人誤認(rèn)為是溶液III加入后基因組DNA無法快速復(fù)性就被沉淀了，這是天大的誤會，因?yàn)樽冃缘囊埠脧?fù)性的也好，DNA分子在中性溶液中都是溶解的。NaOH本來是為了溶解細(xì)胞而用的，DNA分子的變性其實(shí)是個副產(chǎn)物，與它是不是沉淀下來其實(shí)沒有關(guān)系。溶液III加入并混合均勻后在冰上放置，目的是為了PDS沉淀更充分一點(diǎn)。質(zhì)粒檢測瓊脂糖電泳進(jìn)行鑒定質(zhì)粒DNA時，多數(shù)情況下你能看到三條帶，但千萬不要認(rèn)為你看到的是超螺旋、線性和開環(huán)這三條帶。堿法抽提得到