植物組織與器官培養(yǎng)

1、3.1 植物組織培養(yǎng) 植物組織培養(yǎng)植物組織培養(yǎng)是指將植物組織（如花藥組織、胚乳、皮層等）給予適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件下，誘導(dǎo)其長成新的完整植株的一種實(shí)驗(yàn)技術(shù)。 植物組織培養(yǎng)再生的植物“試管植物”。3.1.1 發(fā)展歷史 1902年德國植物學(xué)家哈貝爾蘭德(haberlandt)提出了器官和組織可以不斷分割直至單個(gè)細(xì)胞的觀點(diǎn)。并首次分離植物并進(jìn)行培養(yǎng)，但未獲成功。被譽(yù)為“植物組織培養(yǎng)之父”。 1943年，美國懷特（white）正式提出植物細(xì)胞具有全能性，認(rèn)為每個(gè)植物細(xì)胞具有該植物的全部遺傳信息和發(fā)育成完整植株的能力。 1934年，荷蘭植物學(xué)家溫特溫特發(fā)現(xiàn)了生長生長素素，即吲哚乙酸。 1948年，斯科克斯科克解

2、決了如何從離體組織和器官中誘導(dǎo)植物再生的問題，并確定了腺嘌呤腺嘌呤/生長素的比例是控制芽和根形生長素的比例是控制芽和根形成的一個(gè)重要條件成的一個(gè)重要條件。 1958年，施圖爾德施圖爾德從胡羅卜根韌皮部愈傷組織獲得單細(xì)胞，并誘導(dǎo)形成胚狀體再生了植株。這是世界上首次通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)首次通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)了植物細(xì)胞具有全能性了植物細(xì)胞具有全能性。 20世紀(jì)60年代以來，植物組織培養(yǎng)植物組織培養(yǎng)開始走向大規(guī)模的應(yīng)用階段。組織培養(yǎng)技術(shù)被譽(yù)為農(nóng)業(yè)發(fā)展史上的第四次綠色革命第四次綠色革命。 進(jìn)行植物組織培養(yǎng)，只需要少量的材料就能獲得大量的植株，不僅可以節(jié)約大量的種子、肥料，還節(jié)約了大量的耕地，因此可以在工廠中進(jìn)行育苗。

3、3.1.2 植物組織培養(yǎng)再生植株的途徑1、器官發(fā)生途徑2、體細(xì)胞胚發(fā)生途徑3.1.2.1 器官發(fā)生途徑 植物的離體器官發(fā)生器官發(fā)生是指培養(yǎng)條件下的組織或細(xì)胞團(tuán)（ 愈傷組織） 分化形成不定根（adventitious roots） 、不定芽（adventitious shoots） 等器官的過程。 植物細(xì)胞脫分化是已有特定結(jié)構(gòu)和功能的植物組織的細(xì)胞，在一定的條件下被誘導(dǎo)改變?cè)械陌l(fā)育途徑，逐步失去原有的分化狀態(tài)，轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂蟹稚芰Φ呐咝约?xì)胞的過程。 愈傷組織：愈傷組織：脫分化后的細(xì)胞經(jīng)過細(xì)胞分脫分化后的細(xì)胞經(jīng)過細(xì)胞分裂產(chǎn)生無組織結(jié)構(gòu)、無明顯極性的松散裂產(chǎn)生無組織結(jié)構(gòu)、無明顯極性的松散的細(xì)胞團(tuán)。的

4、細(xì)胞團(tuán)。即即由外植體組織增生的細(xì)胞產(chǎn)生的一團(tuán)不定型的疏散排列的薄壁細(xì)胞。 愈傷組織細(xì)胞是分化的，但還沒形成組織上的結(jié)構(gòu)，因此愈傷組織培養(yǎng)過程中沒有明顯的組織或器官上的分化。 愈傷組織可以用繼代培養(yǎng)的方式長期保存，也可以通過懸浮培養(yǎng)而迅速增殖用作無性系；也可以用作原生質(zhì)體培養(yǎng)時(shí)原生質(zhì)體的來源。 外植體：外植體：植物體上切取下來進(jìn)行培養(yǎng)的部分組織或器官。即植物組織培養(yǎng)中用來進(jìn)行離體無菌培養(yǎng)的離體材料，可以是器官、組織、細(xì)胞和原生質(zhì)體等。 繼代培養(yǎng)：繼代培養(yǎng)：是指愈傷組織在培養(yǎng)基上生長一段時(shí)間后，營養(yǎng)物枯竭，水分散失，并已經(jīng)積累了一些代謝產(chǎn)物，此時(shí)需要將這些組織轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)基上，這種轉(zhuǎn)移稱為繼代培

5、養(yǎng)或傳代培養(yǎng)。離體培養(yǎng)條件下， 經(jīng)過愈傷組織再分化器官一般要經(jīng)過四個(gè)生長階段。（一）啟動(dòng)期：誘導(dǎo)外植體細(xì)胞脫分化和分裂。（二）外植體經(jīng)過誘導(dǎo)形成愈傷組織形成愈傷組織。（三）擬分生組織 的形成。當(dāng)把愈傷組織轉(zhuǎn)移到有利于有序生長的條件下以后， 首先在若干部位成叢出現(xiàn)類似形成層的細(xì)胞群， 通常稱之為“生長中心”， 也稱為擬分生組織，它們是愈傷組織中形成器官的部位。（四）器官原基及器官形成器官原基及器官形成。通過器官發(fā)生形成再生植株大體上有三種方式： 第一種方式是先芽后根先芽后根: 第二種方式為先根后芽先根后芽: 第三種方式是同時(shí)生根發(fā)芽同時(shí)生根發(fā)芽:在愈傷組織的不同部位形成芽和根，再通過維管組織的聯(lián)

6、系形成完整植株。 在有些情況下， 外植體不經(jīng)過典型的愈傷組織即可形成器官原基。這一途徑有兩種情況： 一是外植體中已存在器官原基， 進(jìn)一步培養(yǎng)即形成相應(yīng)的組織器官進(jìn)而再生植株， 如莖尖、根尖分生組織培養(yǎng)； 另一種情況是外植體某些部位的細(xì)胞， 在重新分裂后直接形成分生細(xì)胞團(tuán)，然后由分生細(xì)胞團(tuán)形成器官原基。這種不經(jīng)過愈傷組織直接發(fā)生器官的途徑在以品種繁殖為目的的離體培養(yǎng)中具有重要的實(shí)踐意義。 研究表明， 在葉肉細(xì)胞再生植株過程中，最初分裂細(xì)胞的第一次分裂軸向是十分重要的。在不經(jīng)過愈傷組織的器官分化中，這次平周分裂既是葉肉細(xì)胞的脫分化，同時(shí)也是該細(xì)胞轉(zhuǎn)變發(fā)育方式極性的確定?，F(xiàn)在，有人把最先啟動(dòng)分裂的這

7、些細(xì)胞稱之為感受態(tài)細(xì)胞。植物組織培養(yǎng)的基本步驟 （一）培養(yǎng)材料的采集 （二）培養(yǎng)材料的消毒 （三）制備外植體 （四）接種和培養(yǎng) （五）根的誘導(dǎo) （六）練苗（一）培養(yǎng)材料的采集1、受精卵2、發(fā)育中的分生組織：根尖、嫩莖、幼葉、花3、雌雄配子、單倍體細(xì)胞 其中莖尖最常用。（二）培養(yǎng)材料的消毒1、自來水沖洗 蒸餾水沖洗 無菌紗布或吸水紙吸干水分 消毒刀片切成小塊。2、70%酒精浸泡消毒30-60s。3、漂白粉飽和液或0.01%升汞水中消毒10min。4、無菌水沖洗3-4次。（三）制備外植體 在無菌環(huán)境下，將已消毒的材料用無菌刀、剪、鑷等，剝?nèi)パ康镊[片、嫩枝的外皮或種皮胚乳（葉片不需剝皮）。然后切成0

8、.2-0.5cm厚的小片。 操作中嚴(yán)禁用手接觸材料。（四）接種和培養(yǎng)1、接種：無菌環(huán)境下，將切好的外植體立即接種在培養(yǎng)基上，每瓶接種4-10個(gè)。2、封口：接種后，瓶、管用無菌棉或蓋封口，培養(yǎng)皿無菌膠帶封口。3、溫度：25左右。4、增殖：在新梢形成后需繼代培養(yǎng)。把材料分株或切段轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基中。蝴蝶蘭試管苗工廠化生產(chǎn)蝴蝶蘭試管苗工廠化生產(chǎn)（五）根的誘導(dǎo) 繼代培養(yǎng)形成的不定芽和側(cè)芽一般沒有根，必須轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)。1月后可獲健壯根系。（六）練苗 先將培養(yǎng)容器打開，于室內(nèi)自然光照3天，后取出小苗，自來水沖洗掉根系上培養(yǎng)基，栽入消毒后的基質(zhì)中。 移栽前注意遮蔭，水分管理，保持較高空氣濕度。

9、 3.1.2.2 體細(xì)胞胚發(fā)生途徑 離體培養(yǎng)下沒有經(jīng)過受精過程，但經(jīng)過了胚胎發(fā)育過程所形成的胚的類似物（不管培養(yǎng)的細(xì)胞是體細(xì)胞還是生殖細(xì)胞），統(tǒng)稱為體細(xì)胞胚或胚狀體。 這一定義有以下幾方面的界定： 其一，體細(xì)胞胚是離體培養(yǎng)的產(chǎn)物，只限于在離體培養(yǎng)范圍使用， 以區(qū)別于無融合生殖胚； 其二，體細(xì)胞胚起源于非合子細(xì)胞，以區(qū)別于合子胚； 其三，體細(xì)胞經(jīng)過了胚胎發(fā)育過程，以區(qū)別于離體培養(yǎng)中器官發(fā)生形成個(gè)體的途徑。（一）體細(xì)胞胚的形成途徑1體細(xì)胞胚從外植體上直接發(fā)生 莖表皮、葉、子葉、下胚軸等外植體分化細(xì)胞經(jīng)過脫分化后均可以產(chǎn)生胚狀體。如：在以葉片為外植體的培養(yǎng)中， 體細(xì)胞胚的直接形成可分為兩個(gè)階段： 1

10、）誘導(dǎo)期。在此階段中，葉片表皮細(xì)胞或亞表皮細(xì)胞感受培養(yǎng)刺激， 進(jìn)入分裂狀態(tài)。2）是胚胎發(fā)育期。在這一階段， 形成的瘤狀物繼續(xù)發(fā)育， 經(jīng)過球形胚、心形胚等發(fā)育過程，最后形成體細(xì)胞胚。2懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的體細(xì)胞胚胎發(fā)生 在胡蘿卜細(xì)胞懸浮培養(yǎng)中， 體細(xì)胞胚胎形成的細(xì)胞學(xué)觀察表明， 其培養(yǎng)物中存在兩種類型的細(xì)胞：一是自由分散在培養(yǎng)基中的大而高度液泡化的細(xì)胞，這類細(xì)胞一般不具備胚胎發(fā)生潛力； 二是成簇成團(tuán)的體積小而細(xì)胞質(zhì)致密的細(xì)胞，這類細(xì)胞具有成胚能力， 因而，把這類細(xì)胞團(tuán)又稱為胚性細(xì)胞團(tuán)。 胚性細(xì)胞團(tuán)轉(zhuǎn)移到適宜的胚胎發(fā)生培養(yǎng)基上以后， 其外圍的許多細(xì)胞開始第一次不均等分裂，靠近細(xì)胞團(tuán)方向的一個(gè)細(xì)胞較大，

11、以后發(fā)育成類似胚柄的結(jié)構(gòu)。另一個(gè)細(xì)胞則繼續(xù)分裂形成類似原胚的結(jié)構(gòu)， 以后經(jīng)過類似于體內(nèi)的發(fā)育過程，經(jīng)球形期、心形期等發(fā)育階段形成完整的體細(xì)胞胚。 通過懸浮細(xì)胞系再生體細(xì)胞胚，由于胚性細(xì)胞可以繼代增殖，因此可以提高胚胎的生產(chǎn)效率。3經(jīng)過愈傷組織的體細(xì)胞胚發(fā)生 經(jīng)過愈傷組織的胚胎發(fā)生需要三個(gè)培養(yǎng)階段： 第一階段是誘導(dǎo)外植體形成愈傷組織； 第二階段是誘導(dǎo)愈傷組織胚性化； 第三階段是體細(xì)胞胚形成。 在以幼胚、胚以及子葉為外植體時(shí)，通?？梢灾苯诱T導(dǎo)胚性愈傷組織產(chǎn)生， 進(jìn)而發(fā)生體細(xì)胞胚。因此， 經(jīng)過愈傷組織的體細(xì)胞胚胎發(fā)生，胚性愈傷組織的形成是培養(yǎng)的關(guān)鍵。進(jìn)而發(fā)生原胚，經(jīng)過不同時(shí)期完成體細(xì)胞胚胎發(fā)育 4、

12、單細(xì)胞發(fā)生途徑主要指小孢子或大孢子細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)生胚狀體。5、原生質(zhì)體發(fā)生途徑原生質(zhì)體是去掉細(xì)胞壁后裸露的球形細(xì)胞。培養(yǎng)植物原生質(zhì)體，再生細(xì)胞壁后，經(jīng)過分裂產(chǎn)生的細(xì)胞團(tuán)也可以形成胚狀體。3.1.3 植物組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基1）無機(jī)鹽：大量元素（氮、硫、磷、鉀、鈣、鎂）、微量元素（鐵、錳、銅、鋅、氯、硼、鉬）。一般只含無機(jī)鹽的培養(yǎng)基叫基本培養(yǎng)基，只有很少幾種植物組織能夠培養(yǎng)和維持下去。2）有機(jī)物：糖類、氨基酸、維生素、醇類。3）調(diào)節(jié)物：生長素、細(xì)胞分裂素、赤霉素 注意：選用完全已知的合成化合物，不大主張用復(fù)雜的天然產(chǎn)物，如酵母提取物、番茄汁、椰子汁等。 植物激素：自然狀態(tài)下產(chǎn)生的、對(duì)生長發(fā)育有顯著作用的

13、微量有機(jī)物。 包括：生長素、細(xì)胞分裂素、赤霉素、乙烯等。 生長素：促進(jìn)細(xì)胞分裂、誘導(dǎo)根的分化。常用的有吲哚乙酸（iaa）、2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-d）、萘乙酸（naa）、吲哚丁酸（iba) 細(xì)胞分裂素：促進(jìn)細(xì)胞分裂、誘導(dǎo)芽的形成。常用的有6-芐氨基嘌呤（ba）、6-呋喃氨基嘌呤（又稱激動(dòng)素，kt）常用培養(yǎng)基（1）富鹽平衡培養(yǎng)基：ms、ls、bl、bm、er（2）高硝態(tài)氮培養(yǎng)基：b5、n6、sh（3）中鹽培養(yǎng)基：nitsch、miller、h（4）低鹽培養(yǎng)基：white、ws、he、hb3.1.4 植物組織培養(yǎng)問題分析（一）起始材料對(duì)器官分化的影響1母體植株的遺傳基礎(chǔ)2外植體的類型：外植體

14、對(duì)誘導(dǎo)反應(yīng)及其再生能力的影響體現(xiàn)在外植體的生理狀態(tài)上?？傮w來講，生理狀態(tài)年輕，來源于生長活躍或生長潛力大的組織和器官的細(xì)胞更有利于培養(yǎng)，但具體到不同的植物類型則有較大差異。 外植體選取合理與否，不僅影響培養(yǎng)的難易，而且有時(shí)甚至影響分化的程度和器官類型。1974 年tran thanh van 等取煙草正在開花的植株的薄層表皮進(jìn)行培養(yǎng)，結(jié)果不同部位的表皮外植體所形成的芽的類型不同。（二）激素對(duì)器官分化的調(diào)控 激素在細(xì)胞生長與個(gè)體發(fā)育中具有重要的調(diào)控作用。離體培養(yǎng)下的器官分化，在大多數(shù)情況下是通過外源提供適宜的植物激素而實(shí)現(xiàn)的。在眾多的植物激素中， 生長素與細(xì)胞分裂素是兩類主要的植物激素， 在離體

15、器官分化調(diào)控中占有主導(dǎo)地位。 離體培養(yǎng)中， 外源激素在細(xì)胞內(nèi)的吸收和代謝影響到激素的活性從而影響其培養(yǎng)效果。（三）光照對(duì)器官分化的影響 光照時(shí)間、強(qiáng)度以及光質(zhì)對(duì)器官分化均有影響。 由于培養(yǎng)條件下光合作用能力較低，因此光照的作用更大程度上是調(diào)節(jié)細(xì)胞的分化狀態(tài)，而不是合成光合產(chǎn)物。 光照對(duì)器官發(fā)生的調(diào)節(jié)可能與其對(duì)培養(yǎng)物內(nèi)源激素平衡的調(diào)節(jié)有關(guān)。3.2 植物胚胎培養(yǎng) 植物胚胎培養(yǎng)：指對(duì)植物的胚及胚器官（如子房、胚珠）進(jìn)行人工離體無菌培養(yǎng)，使其發(fā)育成幼苗的技術(shù)。1、成熟胚培養(yǎng)：指子葉期至發(fā)育成熟的胚的培養(yǎng)。2、幼胚培養(yǎng)：指早期原胚、球性期胚、心形期胚、魚雷期胚的培養(yǎng)。3、胚乳培養(yǎng)：指處于細(xì)胞期的胚乳組織

16、的離體培養(yǎng)。4、胚珠和子房培養(yǎng)：胚珠培養(yǎng)指未受精或受精后的胚珠的離體培養(yǎng)。子房培養(yǎng)指授粉和未授粉的子房的離體培養(yǎng)。3.3 毛狀根培養(yǎng) 毛狀根：又名發(fā)狀根，是植株或組織、器官受到發(fā)根農(nóng)桿菌感染后而形成的類似頭發(fā)一樣的根組織。 發(fā)根農(nóng)桿菌中有個(gè)ri質(zhì)粒， ri質(zhì)粒具有兩個(gè)功能區(qū)，其中t-dna區(qū)上有生長素合成基因，生長素可以誘導(dǎo)根的形成。三種毛狀根培養(yǎng)方法1、外植體接種法：取植物的葉片、莖段、葉柄等無菌外植體，與發(fā)根農(nóng)桿菌共培養(yǎng)2-3天，將植物的外植體移到含有抗生素的選擇培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，經(jīng)過多次繼代培養(yǎng)可產(chǎn)生毛狀根。2、莖桿接種法：將植物種子消毒后，在合適的培養(yǎng)基上萌發(fā)，長出無菌苗。取莖尖繼續(xù)培養(yǎng)，等無菌植株生長到一定時(shí)候，將植株的莖尖、葉片切去，剩下莖桿和根部，在莖桿上劃出傷口，將帶ri質(zhì)粒的發(fā)根農(nóng)桿菌接種在傷口處和莖的頂部切口處，經(jīng)過一段時(shí)間培養(yǎng)，在接種部位產(chǎn)生毛狀根。3、原生質(zhì)體-農(nóng)桿菌共培養(yǎng)法：將原生質(zhì)體培養(yǎng)3-5天后，加入發(fā)根農(nóng)桿菌進(jìn)行共培養(yǎng)，然后