生物樣品的預處理

1、生物樣品的預處理生物樣品的預處理 初級分離階段初級分離階段primary separationprimary separation primary separationprimary separation的任務的任務 分離細胞和培養(yǎng)液分離細胞和培養(yǎng)液 破碎細胞釋放產(chǎn)物破碎細胞釋放產(chǎn)物 溶解包含體溶解包含體 復原蛋白質(zhì)復原蛋白質(zhì) 濃縮產(chǎn)物濃縮產(chǎn)物 去除大部分雜質(zhì)去除大部分雜質(zhì)生物樣品的預處理 不同來源樣品分離的預處理 植物組織提取物的制備 動物組織提取物的制備 細菌中重組蛋白的提取制備 細胞的破碎與分離 常見的方法 細胞破碎技術的發(fā)展方向1 不同來源樣品分離的預處理 樣品來源：植物、動物、微生物

2、，例如：植物或動物細胞培養(yǎng)液、微生物發(fā)酵液、動物血液、乳液和動植物組織提取液等。 生物樣品中往往含有大量有機物、無機物及各種微量元素等，因此對目標組分進行初步富集和分離，對干擾組分進行初步去除等工作都屬于預處理。生物樣品特征： 目標產(chǎn)物濃度普遍較低，懸浮液大部分是“水”，組分復雜，是含有細胞、細胞碎片、蛋白質(zhì)、核酸、脂類、糖類、無機鹽類等多種物質(zhì)的混合物； 分離過程很容易發(fā)生失活現(xiàn)象，ph、離子強度、溫度等變化常常造成產(chǎn)物的失活； 性質(zhì)不穩(wěn)定，易隨時間變化，如受空氣氧化，微生物污染，蛋白水解作用等。分離過程注意點分離過程注意點 迅速加工，縮短停留時間 控制好操作溫度和ph 減少和避免與空氣接觸

3、受污染的機會 總體設計好各組分的分離順序不同來源樣品分離的預處理1.1 植物組織中活性物質(zhì)的提取1.1.1 酶的提取 植物組織中所存在的酚類化合物使植物中提取酶的過程變得復雜。 植物組織被破壞時，酶和酚類處混合接觸狀態(tài)，很易發(fā)生反應。產(chǎn)物苯醌和單寧酸類會繼續(xù)和酶蛋白反應, 使目的酶失去活性。為此去除酚類化合物或避免反應是必須進行的步驟。酚類化合物與蛋白質(zhì)的結(jié)合方式酚類化合物與蛋白質(zhì)的結(jié)合方式可逆結(jié)合 酚類化合物的兩個羥基與蛋白質(zhì)分子形成氫鍵，例如肽鍵的co端和nh端不可逆結(jié)合 酚類化合物的兩個相鄰羥基被氧化為鄰苯醌之后，通過共價鍵與蛋白質(zhì)分子中的自由氨基以及巰基結(jié)合 引起蛋白質(zhì)活性基團集合，引

4、起聚集、交叉結(jié)合和沉淀（酶促褐變作用）預處理需要注意： 溫度盡可能低 提取液的量要保證“充分浸入” 加入足量酚類吸附劑 加入足量氧化酶抑制劑 攪拌轉(zhuǎn)速要恰當 phph要控制在合適范圍，一般5.55.57 7酚類吸附劑的種類： 天然和合成的聚合物 清蛋白 尼龍粉 聚乙烯吡咯烷酮-可溶的（pvp） 通過-co-n=與酚羥基形成氫鍵 聚乙烯聚吡咯烷酮-不溶的（pvpp） 聚乙烯和聚丙烯樹脂，如離子交換樹脂xad-2、-4和-7 聚苯乙烯的離子交換樹脂，包括陰離子交換樹脂（bio-rad ag1-x8,ag2-x8和dowex-1）和陽離子交換樹脂（dowex-50） 表面疏水，易吸附帶疏水基團的化合

5、物酚氧化酶抑制劑 抗氧化劑：2-巰基乙醇，二硫蘇糖醇(dtt)，二硫赤蘚糖醇(dte) ，抗壞血酸鹽 前三種既是多酚氧化酶的抑制者又是醌的清除劑 抗壞血酸鹽能阻止醌重新還原成酚， 在低濃度的醌存在下就很易被消耗，因此須在相對較高的濃度條件下使用（50mmol/l）1.1.2 rna的提取 從植物組織中提取rna是進行植物分子生物學方面研究的必要前提。 northern雜交分析、純化mrna以用于體外翻譯或建立cdna文庫、rt-pcr及差示分析等過程中需要高質(zhì)量的rna 能否有效地去除多糖、酚類化合物、萜類化合物rnase和干擾rna提取的其它代謝產(chǎn)物是提取高質(zhì)量植物rna成敗的關鍵。 酚類化

6、合物與rna不可逆結(jié)合 導致rna活性喪失、用苯酚或氯仿抽提時rna丟失、形成不溶性復合物 多糖會形成難溶的膠狀物，與rna共沉淀 萜類化合物和rnase會造成rna的化學降解和酶解酚類化合物的干擾及對策 還原劑法 2-巰基乙醇(me) 、二硫蘇糖醇（dtt）或cys 來防止酚類物質(zhì)被氧化，硼氫化鈉（nabh4）是可還原醌的還原劑 螯合劑法 pvp和pvpp中的-con基有很強的結(jié)合多酚化合物的能力，其結(jié)合能力隨著多酚化合物中芳環(huán)羥基數(shù)量的增加而加強 tris-硼酸法 硼酸可與酚類靠氫鍵形成復合物，抑制了酚類物質(zhì)的氧化及其與rna的結(jié)合 牛血清白蛋白（bsa）法 原花色素類物質(zhì)與bsa間可產(chǎn)生

7、類似于抗原抗體間的相互作用，形成可溶性的或不溶性的復合物，減小了原花色素類物質(zhì)與rna結(jié)合的機會 丙酮法 用-70的丙酮抽提冷凍研磨后的植物材料,可有效從云杉、松樹、山毛櫸等富含酚類化合物的植物材料中分離到高質(zhì)量的rna 通過li+或ca2+沉淀rna的方法可以將未被氧化的酚類化合物去除。多糖的干擾及對策 植物組織往往富含多糖，而多糖的許多理化性質(zhì)與rna很相似，較難將它們分開。含多糖的rna沉淀難溶于水，或溶解后產(chǎn)生粘稠狀的溶液，對rna提取造成較大的干擾。 對策： sds-鹽酸胍處理； 高濃度na+或k+離子下，苯酚、氯仿抽提； 低濃度乙醇沉淀多糖； 醋酸鉀沉淀多糖。蛋白雜質(zhì)的影響及對策

8、蛋白質(zhì)是污染rna樣品的又一個重要因素。由于rnase和多酚氧化酶亦屬于蛋白質(zhì)，因而要獲得完整的、高質(zhì)量的rna就必須有效地去除蛋白雜質(zhì)。 常規(guī)方法： 冷凍條件下研磨植物材料以抑制rnase等的活性； 提取緩沖液中含有蛋白質(zhì)變性劑，如苯酚、胍、sds、十六烷基三甲基溴化銨（ctab）等，這樣在勻漿時可以使蛋白質(zhì)變性，凝聚； 利用蛋白酶k來降解蛋白雜質(zhì)，進一步可以用苯酚、氯仿抽提去除蛋白質(zhì)。次級代謝產(chǎn)物的影響及對策 從植物組織中提取高質(zhì)量rna的另一個難點是許多高等植物組織尤其是成熟組織能產(chǎn)生某些水溶性的次級代謝產(chǎn)物，這些次級代謝產(chǎn)物很容易與rna結(jié)合并與rna共同被抽提出來而阻礙具有生物活性的

9、rna的分離。 由于不能確定次級代謝產(chǎn)物具體是什么物質(zhì)，目前沒有什么特殊的方法來解決這個問題1.1.3 多糖的提取 多糖廣泛存在于植物、微生物（細菌和真菌）和海藻中，來源很廣。 我國是中藥的起源之地，而糖類是中藥材中普遍存在的成分，在對各種中藥材的化學成分研究的過程中，人們都少不了對其中多糖的關注。 動植物中或微生物胞內(nèi)多糖的釋放步驟： 去除表面脂質(zhì)，常用醇或醚回流脫脂； 脫脂殘渣用溶液提取(即冷水，熱水，0.11.0 mol/l naoh，1%醋酸或1%苯酚等)； 提取液除雜：對于無機鹽及低分子量的有機物質(zhì)可用透析法、離子交換樹脂或凝膠過濾法除去；對于大分子雜質(zhì)可用酶消化(如蛋白酶、木質(zhì)素酶

10、)，乙醇或丙酮等溶劑沉淀法或金屬絡合物法。蛋白雜質(zhì)的影響及對策 多糖提取液中除去蛋白質(zhì)是一個很重要的步驟，常用的方法有 sevag法 氯仿：戊醇（或正丁醇）：多糖水溶液=5：1：6 較溫和 三氟三氯乙烷法 多糖水溶液：三氟三氯乙烷=1：1 效率高、不易大量應用 三氯乙酸法 多糖水溶液中滴加3%三氯乙酸 較劇烈，不適合含呋喃糖殘基的多糖 酶解法 前三種方法不適合糖肽的分離 三氯醋酸法和sevag法的脫蛋白效果相近，并且蛋白酶法與sevag法相結(jié)合除蛋白的效果較好。1.2 動物組織預處理注意事項 勻漿化前的預處理(冷凍) 提取物緩沖液的選擇(中性) 蛋白酶抑制劑的添加 保護劑的添加(-巰基乙醇、e

11、dta、輔酶等) 提取液的澄清( 高速離心、沉淀、吸附等)1.3 微生物物質(zhì)的提取制備 各種發(fā)酵產(chǎn)品，由于菌種不同和發(fā)酵液特性不同，其預處理方法的選擇也有所不同。 大多數(shù)發(fā)酵產(chǎn)物存在于發(fā)酵液中，也有少數(shù)產(chǎn)物存在于菌體中，或發(fā)酵液和菌體中都含有。 對于胞外產(chǎn)物，經(jīng)預處理應盡可能使目的產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到液相，然后經(jīng)固液分離除去固相； 對于胞內(nèi)產(chǎn)物，則應首先收集菌體或細胞，經(jīng)細胞破碎后，目的產(chǎn)物進入液相，隨后再將細胞碎片分離。大腸桿菌重組蛋白的提取制備 多拷貝質(zhì)粒上強啟動子過量表達重組蛋白質(zhì)使整個細胞的蛋白質(zhì)表達水平提高,但大多情形下會導致諸如包含體的不溶性蛋白聚集的形成重組菌e. coli m15(pqe

12、32-agn)外源基因的誘導表達(a未誘導，b誘導)包含體包含體 包含體（inclusion bodies）是無定形的蛋白質(zhì)的聚集，不被任何膜所包圍。細胞破碎后，包含體呈顆粒狀，致密，低速離心就可以沉淀。 包含體難溶于水中，在變性劑溶液（如鹽酸胍、脲）中才能溶解。在這些溶液中，溶解的蛋白質(zhì)呈變性狀態(tài)，即所有的氫鍵、疏水鍵全被破壞，疏水側(cè)鏈完全暴露，但一級結(jié)構(gòu)和共價鍵不被破壞。因此當除去變性劑時，一部分蛋白質(zhì)可以自動折疊成具有活性的正確構(gòu)型，這一折疊過程稱為蛋白質(zhì)的復性。 包含體主要由蛋白質(zhì)構(gòu)成，其中大多是基因表達產(chǎn)物。這些基因表達產(chǎn)物沒有生物活性。為此，欲獲得天然活性態(tài)的目標產(chǎn)物，必需分離包含

13、體后，溶解包含體并使其中的目標蛋白恢復應有的天然活性。所以，包含體的出現(xiàn)增加了生化工程師生物分離設計的難度重組蛋白的提取步驟 大腸桿菌的酶解 采用溶菌酶或超聲破碎方法來破壁 包含體的清洗 用溶劑清洗包含體能進一步除去雜蛋白 從包含體中溶解重組蛋白（變性） 選擇和優(yōu)化溶解液（一般為尿素和鹽酸胍），使包含體中重組蛋白溶解 重組蛋白的復性 稀釋法、透析法、層析法、分子伴侶等2 細胞的破碎與分離 細胞的破碎： 用一定方法（機械法、物理法、化學法、酶法等）打開細胞壁或膜，使細胞內(nèi)含物有效地釋放出來。 提取： 目的物從胞內(nèi)轉(zhuǎn)移到外界溶液中。細胞提取劑 提取液（液體目的物） 沉淀洗滌提取物（固體目的物）破碎

14、勻漿離心2.1 細胞的破碎方法2.1.1 機械法 原理：機械運動產(chǎn)生剪切力的作用破細胞組織搗碎法 適合：硬度較大的動、植物組織高速勻漿法 特點 破碎程度高，而其機械剪切力對生物大分子的破壞較少，處理量大。 原理 利用高壓使細胞懸浮液通過針性閥，由于突然減壓和高速沖擊撞擊環(huán)使細胞破裂。 適用 較柔軟、易分散的組織細胞高速勻漿機高速勻漿機 高速勻漿法為大規(guī)模細胞破碎的常用方法，設備由高壓泵和勻漿閥組成。研磨法與珠磨法 研磨法(實驗室規(guī)模) 由陶瓷的研缽和研桿組成，加入少量研磨劑（如精制石英砂、玻璃粉、硅藻土） 珠磨法(工業(yè)規(guī)模) 進入珠磨機的細胞懸浮液與極細的玻璃小珠、石英沙、氧化鋁等研磨劑（直徑

15、1mg/ml1mg/ml. . 吸附法 目的物濃度1mg/ml1mg/ml時可用此法. . 減壓透析或超濾 1. 1. 減壓透析 原理：在滲出液外抽真空，使膜兩邊形成壓差，加速膜內(nèi)物質(zhì)透出。 2. 2. 超濾屬加壓膜分離技術之一. . 干膠溶漲法 加入具一定孔徑微孔能吸水的凝膠，如葡聚糖凝膠、聚丙烯酰胺 方式：直接加入或在半透膜外吸收. . 多聚物吸水法 pegpeg、pvppvp、cmccmc等具強大吸水力，可在半透膜外吸收。. . 減壓蒸餾（真空旋轉(zhuǎn)濃縮）細胞破碎技術研究的發(fā)展方向 多種破碎方法相結(jié)合 與上游過程相結(jié)合 上游過程中培養(yǎng)基、生長期、操作參數(shù)等都對細胞破碎有影響 采用基因工程方法改造菌種 包含體的形成 克隆噬菌體溶解基因 耐高溫產(chǎn)品的基因表達 與下游過程相結(jié)合 細胞破碎與固液分離緊密相關 要從后分離過程的整體角度來看待細胞破碎操作作業(yè)作業(yè) 為什么在提取植物組織中的酶時需要除去所含的酚類化合為什么在