第九章DNA序列測定

1、 即即核酸核酸dna分子一級結(jié)構(gòu)的測定，是現(xiàn)代分子生物學(xué)一項分子一級結(jié)構(gòu)的測定，是現(xiàn)代分子生物學(xué)一項重要的技術(shù)重要的技術(shù)。 1963年，年，和和等人第一次完成胰島素等人第一次完成胰島素51個個氨基酸的序列測定，這在當(dāng)時來說是一件了不起的大事。氨基酸的序列測定，這在當(dāng)時來說是一件了不起的大事。70年年代后期，代后期，和和等人又建立了核酸序列測等人又建立了核酸序列測定的方法，定的方法，sanger雙脫氧末端終止法和雙脫氧末端終止法和maxam-gilbert化學(xué)化學(xué)裂解法將核酸序列測定技術(shù)推進(jìn)到裂解法將核酸序列測定技術(shù)推進(jìn)到“直讀直讀”階段，使核酸序列階段，使核酸序列測定變得遠(yuǎn)比蛋白質(zhì)氨基酸序列測

2、定容易，這樣人們可以通過測定變得遠(yuǎn)比蛋白質(zhì)氨基酸序列測定容易，這樣人們可以通過核酸序列和遺傳密碼推導(dǎo)出蛋白質(zhì)氨基酸的序列。核酸序列和遺傳密碼推導(dǎo)出蛋白質(zhì)氨基酸的序列。 在四種反應(yīng)體系中，寡聚核苷酸分別終止于不同位在四種反應(yīng)體系中，寡聚核苷酸分別終止于不同位置的置的a、t、g或或c堿基，將待測堿基，將待測dna片段轉(zhuǎn)變成一系列放片段轉(zhuǎn)變成一系列放射性核素標(biāo)記的單鏈射性核素標(biāo)記的單鏈dna片斷，并使其一端為一固定的片斷，并使其一端為一固定的末端，而另一端由于長度不同，成為一系列相差末端，而另一端由于長度不同，成為一系列相差1個堿基個堿基的連續(xù)末端。經(jīng)電泳分離，放射自顯影，可直接讀出的連續(xù)末端。經(jīng)電

3、泳分離，放射自顯影，可直接讀出dna的序列。的序列。 通過測定對突變進(jìn)行定位和鑒定，應(yīng)用時測定野通過測定對突變進(jìn)行定位和鑒定，應(yīng)用時測定野生型基因上同源區(qū)和突變體的相應(yīng)序列直接在一張膠片上比較二者序生型基因上同源區(qū)和突變體的相應(yīng)序列直接在一張膠片上比較二者序列差異。（已知基因序列）列差異。（已知基因序列） 目的是提供一段目的是提供一段dna準(zhǔn)確的核苷酸序列。（未知基準(zhǔn)確的核苷酸序列。（未知基因序列）因序列）對已知基因序列檢查，特別是有遺傳傾向的病例檢測相關(guān)基因?qū)σ阎蛐蛄袡z查，特別是有遺傳傾向的病例檢測相關(guān)基因有無突變，有助于闡明疾病發(fā)病機理及建立相應(yīng)診療方案。有無突變，有助于闡明疾病發(fā)病機

4、理及建立相應(yīng)診療方案。對已經(jīng)克隆的未知序列進(jìn)行測定，從而闡明該基因的一級結(jié)構(gòu)，對已經(jīng)克隆的未知序列進(jìn)行測定，從而闡明該基因的一級結(jié)構(gòu)，如人類基因組計劃中大量的工作是要闡明克隆片段的核苷酸的排列順如人類基因組計劃中大量的工作是要闡明克隆片段的核苷酸的排列順序。序。 測序目的不同或靶測序目的不同或靶dna片段大小有區(qū)別，則序列分析的具體方案片段大小有區(qū)別，則序列分析的具體方案有所不同，所以測序之前應(yīng)根據(jù)相應(yīng)情況制訂序列測定的策略，這個有所不同，所以測序之前應(yīng)根據(jù)相應(yīng)情況制訂序列測定的策略，這個問題在后面將涉及到，但由于學(xué)時限制，不可能完全展開來講，請同問題在后面將涉及到，但由于學(xué)時限制，不可能完全

5、展開來講，請同學(xué)參看相關(guān)書籍。學(xué)參看相關(guān)書籍。 優(yōu)點1、末端終止法使用特異性引物與單鏈模板dna退火，在dna聚合酶作用下進(jìn)行延伸反應(yīng)，用ddntp終止，用page區(qū)分長度僅相差1個核苷酸的ssdna，從而完成測序的方法。簡便、迅速、應(yīng)用廣泛。2、化學(xué)裂解法用化學(xué)試劑在a、g、c、t處特定的裂解dna片段，產(chǎn)生一簇各種長度的短鏈，經(jīng)過page放射自顯影可直讀dna順序。不需酶促反應(yīng)，可以對寡核苷酸測序。3、dna測序自動化類似末端終止法，所不同的是用熒光染料標(biāo)記，計算機自動讀出。1、高負(fù)荷，1塊膠可測16個樣品；2、機讀不需放射自顯影；3、安全不用同位素；4、簡單迅速8-10h。 不管是上述哪

6、一種方法，測序基本過程如下：不管是上述哪一種方法，測序基本過程如下：（p255,圖圖10-2） 解決了質(zhì)粒問題，節(jié)省了時間，解決了質(zhì)粒問題，節(jié)省了時間，但缺乏靈活性。但缺乏靈活性。 以酶學(xué)測序反應(yīng)或（和）放標(biāo)測序以酶學(xué)測序反應(yīng)或（和）放標(biāo)測序產(chǎn)物為基礎(chǔ)，微機處理。產(chǎn)物為基礎(chǔ)，微機處理。 使極少數(shù)測序產(chǎn)物線性放大。使極少數(shù)測序產(chǎn)物線性放大。 60.-180.￥，搞定。￥，搞定。 當(dāng)當(dāng)3-oh由于脫氧或被取代，下一個核苷酸不能通過由于脫氧或被取代，下一個核苷酸不能通過5磷酸形成磷酸形成3，5磷酸二酯鍵，使鏈的延伸反應(yīng)終止在這個異常的核苷酸處。如果用相磷酸二酯鍵，使鏈的延伸反應(yīng)終止在這個異常的核苷酸

7、處。如果用相同的同的4組引物組引物-模板混合物，每一組加模板混合物，每一組加4種種dntp，其中，其中1種用種用32p（或（或35s）標(biāo)記，加標(biāo)記，加1種種ddntp，每組將產(chǎn)生一種特異性的以，每組將產(chǎn)生一種特異性的以ddntp為末端的不同為末端的不同長度的核苷酸鏈，經(jīng)長度的核苷酸鏈，經(jīng)page分離，即可讀出被測定的全部順序（分離，即可讀出被測定的全部順序（dntp和和ddntp競爭結(jié)合底物）。（競爭結(jié)合底物）。（p255，圖，圖10-2） 在在dna合成時，利用合成時，利用ddntp與與dntp競爭摻入到競爭摻入到新生的新生的dna鏈上使鏈終止的原理。即在鏈上使鏈終止的原理。即在a、c、g、

8、t 4種反應(yīng)體系中，分別加入不同的種反應(yīng)體系中，分別加入不同的ddntp，其他試劑相，其他試劑相同，經(jīng)酶促合成反應(yīng)，生成具有相同的同，經(jīng)酶促合成反應(yīng)，生成具有相同的5末端，而末端，而3不不同的同的dna片段的混合物。經(jīng)電泳分離，放射自顯影，片段的混合物。經(jīng)電泳分離，放射自顯影，直接讀出直接讀出dna的核苷酸序列。的核苷酸序列。 酶促測序反應(yīng)中利用一個與模板特定序列互補的合成寡核苷酶促測序反應(yīng)中利用一個與模板特定序列互補的合成寡核苷酸作為酸作為dna合成的引物。合成的引物。 在許多情況下可將靶在許多情況下可將靶dna片段克隆于片段克隆于m13噬菌體或噬菌粒載噬菌體或噬菌粒載體，以取得單鏈體，以取

9、得單鏈dna分子作為模板。也可用分子作為模板。也可用sanger法測定變性雙法測定變性雙鏈鏈dna模板序列（如變性質(zhì)粒模板序列（如變性質(zhì)粒dna）。以上兩種情況都可以采用）。以上兩種情況都可以采用能與位于靶能與位于靶dna側(cè)翼的載體序列相退火的通用引物，不必取得與側(cè)翼的載體序列相退火的通用引物，不必取得與未知未知dna序列互補的引物。序列互補的引物。m13噬菌體重組子的通用測序引物一噬菌體重組子的通用測序引物一般長般長15-29bp，與緊靠，與緊靠m13mp18多克隆位點區(qū)的多克隆位點區(qū)的hindiii或或m13mp19多克隆位點區(qū)多克隆位點區(qū)ecori位點的序列互補。這些引物同樣也位點的序列

10、互補。這些引物同樣也可用于可用于puc質(zhì)粒的質(zhì)粒的dna進(jìn)行進(jìn)行“雙鏈雙鏈”測序，并且已經(jīng)商品化。測序，并且已經(jīng)商品化。 純單鏈純單鏈dna和經(jīng)過熱變性或堿變性的雙鏈和經(jīng)過熱變性或堿變性的雙鏈dna都可以都可以用作用作sanger法測定的模板。模板的質(zhì)量和所用的法測定的模板。模板的質(zhì)量和所用的dna聚合聚合酶的種類是至關(guān)重要的。酶的種類是至關(guān)重要的。 通常采用通常采用m13噬菌體顆粒分離到的單鏈?zhǔn)删w顆粒分離到的單鏈dna模板效果模板效果最佳，用變性雙鏈最佳，用變性雙鏈dna作模板則難獲此效果。小量制備質(zhì)作模板則難獲此效果。小量制備質(zhì)粒粒dna常被寡核苷酸小分子，核糖核苷酸及常被寡核苷酸小分子

11、，核糖核苷酸及dna聚合酶抑聚合酶抑制劑所污染，前兩者可被用作隨機引物，造成假象和強終制劑所污染，前兩者可被用作隨機引物，造成假象和強終止現(xiàn)象，使測序膠含糊不清。采用小量制備質(zhì)粒止現(xiàn)象，使測序膠含糊不清。采用小量制備質(zhì)粒dna測定測定未知未知dna克隆片段的序列，并不可取，如果用克隆片段的序列，并不可取，如果用cscl-溴化乙溴化乙錠梯度離心結(jié)果純化質(zhì)粒錠梯度離心結(jié)果純化質(zhì)粒dna，測序結(jié)果會好得多，但又，測序結(jié)果會好得多，但又耗費大量的人力和物力。耗費大量的人力和物力。 因為因為dna是相當(dāng)大的分子，一般由幾是相當(dāng)大的分子，一般由幾kb組成，最小的質(zhì)粒和病毒組成，最小的質(zhì)粒和病毒也在也在1k

12、b以上，而測序的最好方法，一次也只能測幾百個以上，而測序的最好方法，一次也只能測幾百個bp（以（以300-500bp為好，為好，300bp最佳），所以測序前，可以用最佳），所以測序前，可以用2種限制酶消化待測種限制酶消化待測dna，使其降解成小片段，用瓊脂糖凝膠電泳分離回收?；厥掌?，使其降解成小片段，用瓊脂糖凝膠電泳分離回收?；厥掌?，如果超過如果超過700-800bp，則進(jìn)行第二次限制酶消化，再次分離回收。然，則進(jìn)行第二次限制酶消化，再次分離回收。然后分別測定每個片段的順序。由于兩種限制酶在后分別測定每個片段的順序。由于兩種限制酶在dna鏈上的切點位置鏈上的切點位置不同，產(chǎn)生的片段之間有交

13、錯重疊順序，據(jù)不同，產(chǎn)生的片段之間有交錯重疊順序，據(jù)2片段的這種末端重疊現(xiàn)片段的這種末端重疊現(xiàn)象，用計算機定出各片段的位置，而排出象，用計算機定出各片段的位置，而排出dna的全部序列。的全部序列。 在測序中，小片段在測序中，小片段dna只需直接克隆到只需直接克隆到m13mp或者質(zhì)粒載體中，或者質(zhì)粒載體中，進(jìn)行雙鏈或單鏈模板測序?，F(xiàn)在常用的進(jìn)行雙鏈或單鏈模板測序?，F(xiàn)在常用的m13mp載體一般是成對設(shè)計，載體一般是成對設(shè)計，如如m13mp18與與m13mp19都有相同的多克隆位點，但方向相反。同一都有相同的多克隆位點，但方向相反。同一待測的待測的dna片段分別克隆到這兩個載體中，用一通用引物進(jìn)行測

14、序。片段分別克隆到這兩個載體中，用一通用引物進(jìn)行測序。對于數(shù)對于數(shù)kb大片段大片段dna分子，則有幾種策略，如定向克隆，內(nèi)部片段克分子，則有幾種策略，如定向克隆，內(nèi)部片段克隆，原位亞克隆，包含上述用隆，原位亞克隆，包含上述用2種限制酶消化種限制酶消化dna等。等。-是寄生在細(xì)菌的病毒。存在是寄生在細(xì)菌的病毒。存在3種狀態(tài)，有尾種狀態(tài)，有尾20面體，無尾面體，無尾20面體和絲狀單鏈?zhǔn)删w（面體和絲狀單鏈?zhǔn)删w（filamentous），），m13是一類雄性特異的大腸桿是一類雄性特異的大腸桿菌噬菌體，含單鏈環(huán)狀的菌噬菌體，含單鏈環(huán)狀的dna。它感染細(xì)菌（宿主菌）呈溶原狀態(tài)生長，在。它感染細(xì)菌（宿主

15、菌）呈溶原狀態(tài)生長，在菌體內(nèi)形成過渡階段雙鏈環(huán)狀復(fù)制型菌體內(nèi)形成過渡階段雙鏈環(huán)狀復(fù)制型dna（replicative form dna，rf dna），在適當(dāng)?shù)臈l件下，可以擴(kuò)增至數(shù)百個拷貝。成熟的噬菌體成為單鏈），在適當(dāng)?shù)臈l件下，可以擴(kuò)增至數(shù)百個拷貝。成熟的噬菌體成為單鏈（正鏈、（正鏈、rf則以正鏈為模板復(fù)制則以正鏈為模板復(fù)制1條鏈，再以此鏈復(fù)制正鏈）分泌到培養(yǎng)液條鏈，再以此鏈復(fù)制正鏈）分泌到培養(yǎng)液中。因此雙鏈中。因此雙鏈dna（rf）可以按質(zhì)粒提取方法從細(xì)菌細(xì)胞中制備，做為克?。┛梢园促|(zhì)粒提取方法從細(xì)菌細(xì)胞中制備，做為克隆所用的載體。從培養(yǎng)上清液提取成熟的單鏈所用的載體。從培養(yǎng)上清液提取成熟

16、的單鏈dna做為測序模板。做為測序模板。 在感染過程中，在感染過程中，m13并不殺死細(xì)胞，但細(xì)胞的生長受到某種程度抑制。并不殺死細(xì)胞，但細(xì)胞的生長受到某種程度抑制。dsdna復(fù)制又產(chǎn)生大量的復(fù)制又產(chǎn)生大量的ssdna，它被，它被1個外殼蛋白包裝成成熟的噬菌體，個外殼蛋白包裝成成熟的噬菌體，在細(xì)胞生長的過程中，子代噬菌體顆粒釋放出來，這是在細(xì)胞生長的過程中，子代噬菌體顆粒釋放出來，這是m13不同于其他噬菌不同于其他噬菌體的特點。每體的特點。每ml培養(yǎng)液沉淀的噬菌體可提取培養(yǎng)液沉淀的噬菌體可提取5-10mgssdna，產(chǎn)量是很高的。，產(chǎn)量是很高的。用作克隆載體，用作克隆載體，m13有有1個得天獨厚

17、的優(yōu)點，即可產(chǎn)生大量含有外源個得天獨厚的優(yōu)點，即可產(chǎn)生大量含有外源dna其其中中1條鏈的條鏈的dna分子，后者可在下列工作中充作模板：分子，后者可在下列工作中充作模板： 都是從同一重組都是從同一重組m13mp1改造而來。改造而來。在基因在基因ii-iv（500bp，570bp左右）之間有左右）之間有1個多克隆位點個多克隆位點（multiple cloning sites，mcs）可供外源基因插入。）可供外源基因插入。該區(qū)域（該區(qū)域（mcs）插入了）插入了1小段小段ecoli.dna，有，有-半乳糖苷酶基因半乳糖苷酶基因（lacz）的調(diào)控序列及其）的調(diào)控序列及其n端端146個個aa編碼信息，它與

18、宿主菌（含編碼信息，它與宿主菌（含lacz）-互補，形成有活性的互補，形成有活性的-半乳糖苷酶，使平板上底半乳糖苷酶，使平板上底x-gal生色成藍(lán)噬菌斑，生色成藍(lán)噬菌斑，當(dāng)外源基因插入當(dāng)外源基因插入mcs，破壞了，破壞了-互補，幾乎無一例外生成無色（白）噬斑。互補，幾乎無一例外生成無色（白）噬斑。這是一種非常有效的克隆篩選選擇性標(biāo)志。這是一種非常有效的克隆篩選選擇性標(biāo)志。是一對載體，它們有相同的是一對載體，它們有相同的13個多克隆個多克隆位點，但方向相反。（當(dāng)位點，但方向相反。（當(dāng)rf dna被兩種限制酶切割后，被兩種限制酶切割后，m13mp18和和m13mp19輕易不能重新環(huán)化，當(dāng)連接混合液

19、中含外源匹配末端輕易不能重新環(huán)化，當(dāng)連接混合液中含外源匹配末端dsdna片片段時方閉合成環(huán)，這一片段在二者中將以互為相反的兩個方向插入。這樣段時方閉合成環(huán)，這一片段在二者中將以互為相反的兩個方向插入。這樣m13mp18正鏈中含有外源正鏈中含有外源dna的一條鏈，而在的一條鏈，而在m13mp19正鏈中含外源正鏈中含外源dna的另一條鏈）。所以的另一條鏈）。所以m13mp18和和m13mp19作為一對載體可用同一通作為一對載體可用同一通用引物，（從所插入用引物，（從所插入dna片段任一端開始），測定互為相反兩條鏈的片段任一端開始），測定互為相反兩條鏈的dna序列。（并可制備只與外源序列。（并可制備

20、只與外源dna任意任意1條條dna鏈互補的探針）。（分子克鏈互補的探針）。（分子克隆隆p202）。）。 測定數(shù)測定數(shù)kb的的dna序列時，可以建立一系列一端刪切序列時，可以建立一系列一端刪切200-300bp的的dna片段次級克隆。對它們分別測序，就可以連續(xù)讀出該大片段片段次級克隆。對它們分別測序，就可以連續(xù)讀出該大片段dna的全部序列。核酸酶的全部序列。核酸酶bal31和核酸外切酶和核酸外切酶iii，均可以達(dá)到連續(xù)刪切的目，均可以達(dá)到連續(xù)刪切的目的。的。-是從乳白短桿菌（是從乳白短桿菌（brevibacterium albidum）細(xì)）細(xì)菌中分離。它能以漸進(jìn)的方式將線型菌中分離。它能以漸進(jìn)的

21、方式將線型dna分子的分子的3，5兩端同時降解，兩端同時降解，形成小的寡核苷酸片段或單核苷酸。底物可以是帶延伸末端的，也可以形成小的寡核苷酸片段或單核苷酸。底物可以是帶延伸末端的，也可以是平頭末端的是平頭末端的dsdna，對，對3，5兩端降解有同樣性，此酶要求兩端降解有同樣性，此酶要求ca2+作輔作輔因子，以因子，以edta作螯合劑，可使該酶失活。作螯合劑，可使該酶失活。 bal31還有較弱的單鏈特異內(nèi)切酶活性，與核酸酶還有較弱的單鏈特異內(nèi)切酶活性，與核酸酶s1相似，降解相似，降解ssdna或或ssrna形成形成5磷酸末端的單或寡核苷酸酶片段，能從磷酸末端的單或寡核苷酸酶片段，能從dna片片段

22、中切除單鏈尾巴，產(chǎn)生平頭末端。核酸酶段中切除單鏈尾巴，產(chǎn)生平頭末端。核酸酶s1是從米曲霉是從米曲霉（aspergillus oryze）中分離的。）中分離的。-是一種從是一種從e.coli中分離，從中分離，從dsdna的的3-oh末端降末端降解產(chǎn)生解產(chǎn)生5單核苷酸的外切酶。（此外，外核酸酶單核苷酸的外切酶。（此外，外核酸酶iii還有內(nèi)核酸酶，還有內(nèi)核酸酶，rnaseh和和3-磷酸酶的活性。磷酸酶的活性。 klenow大片段大片段-dddpi是由分子量是由分子量109kd一條多肽鏈組成，此酶可被一條多肽鏈組成，此酶可被枯草桿菌蛋白酶分解成枯草桿菌蛋白酶分解成2個片段，個片段，1個片段分子量為個片

23、段分子量為76kd，有聚合酶，有聚合酶，35外切酶活力，此片段稱為外切酶活力，此片段稱為klenow片段，另一片段片段，另一片段34kd，有，有5外切外切酶活力。酶活力。 此酶是末端終止法最早采用的酶，用它進(jìn)行測序常常產(chǎn)生較高的本底和此酶是末端終止法最早采用的酶，用它進(jìn)行測序常常產(chǎn)生較高的本底和假帶，催化鏈延伸反應(yīng)的能力也較差，通常只能讀出距引物假帶，催化鏈延伸反應(yīng)的能力也較差，通常只能讀出距引物250個核苷酸以個核苷酸以內(nèi)的序列。此酶價格便宜，容易獲得，對于已知序列內(nèi)的序列。此酶價格便宜，容易獲得，對于已知序列dna次級克隆的鑒定次級克隆的鑒定仍有應(yīng)用價值。仍有應(yīng)用價值。 測序酶是經(jīng)過改造的

24、測序酶是經(jīng)過改造的t7噬菌體噬菌體dna聚合酶，消除了聚合酶，消除了35外切酶活性。外切酶活性?；钚苑浅７€(wěn)定，具有很高的鏈延伸能力和極快的聚合反應(yīng)速度，是測定較長活性非常穩(wěn)定，具有很高的鏈延伸能力和極快的聚合反應(yīng)速度，是測定較長dna序列的首選酶。該酶及名稱是序列的首選酶。該酶及名稱是hsb公司的專利。試劑盒已商品化。公司的專利。試劑盒已商品化。 taq酶用于序列測定，除具有很好的鏈延伸性能外，還可以在高溫酶用于序列測定，除具有很好的鏈延伸性能外，還可以在高溫（70-80）進(jìn)行反應(yīng)的優(yōu)點，因而能克服富含）進(jìn)行反應(yīng)的優(yōu)點，因而能克服富含gc序列的模板形成自身二序列的模板形成自身二級結(jié)構(gòu)對測定的影

25、響，將級結(jié)構(gòu)對測定的影響，將pcr與末端終止法測序結(jié)合進(jìn)行，只需少量模板。與末端終止法測序結(jié)合進(jìn)行，只需少量模板。 傳統(tǒng)傳統(tǒng)32p-dntp，由于，由于32p衰變過程中產(chǎn)生高能的衰變過程中產(chǎn)生高能的射線，導(dǎo)致射線，導(dǎo)致放射自顯影圖譜條帶擴(kuò)散，分辨率低，限制了識讀序列的數(shù)量。放射自顯影圖譜條帶擴(kuò)散，分辨率低，限制了識讀序列的數(shù)量。另外，由于另外，由于32p對對dna樣品輻射分解作用很強，通常都在測序反應(yīng)樣品輻射分解作用很強，通常都在測序反應(yīng)后后24小時內(nèi)上樣電泳，否則無法得到滿意的結(jié)果。小時內(nèi)上樣電泳，否則無法得到滿意的結(jié)果。 -32s-dntp近年來得到廣泛使用，它解決了近年來得到廣泛使用，它

26、解決了32p的兩大缺點，的兩大缺點，具有很高的分辨率，較低的本底。測序反應(yīng)產(chǎn)物具有很高的分辨率，較低的本底。測序反應(yīng)產(chǎn)物-20保存一周并保存一周并不明顯影響反應(yīng)結(jié)果。不明顯影響反應(yīng)結(jié)果。（五）用于測序的變性凝膠電泳（一）制膠（一）制膠（二）模板變性（雙鏈）（二）模板變性（雙鏈）（三）測序反應(yīng)（三）測序反應(yīng) 1、模板引物退火、模板引物退火 2、鏈延伸、鏈標(biāo)記、鏈終止反應(yīng)、鏈延伸、鏈標(biāo)記、鏈終止反應(yīng) 3、上樣電泳、上樣電泳 4、讀片（序）、讀片（序） （分子克隆（分子克隆p640） （必須經(jīng)過實踐才能獲得技巧）（必須經(jīng)過實踐才能獲得技巧） 1、將待測、將待測dna與與m13mp載體相連，構(gòu)成重組體

27、。載體相連，構(gòu)成重組體。 2、用兩種限制酶從待測、用兩種限制酶從待測dna片段的一端與載體序列之片段的一端與載體序列之間將間將dna切斷，產(chǎn)生線性切斷，產(chǎn)生線性dna，使近待測，使近待測dna片段的一端片段的一端為為5突出末端，近載體一端為突出末端，近載體一端為3突出末端。突出末端。 3、外切核酸酶、外切核酸酶從從5突出末端消化待測突出末端消化待測dna，37c時，每分鐘水解時，每分鐘水解250個核苷酸個核苷酸 4、核酸酶、核酸酶si去除殘余單鏈，自我環(huán)化，轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿去除殘余單鏈，自我環(huán)化，轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主菌得到次級克隆。主菌得到次級克隆。 5、將各克隆用于測序。、將各克隆用于測序。（三）引物

28、延伸法（三）引物延伸法 是一種定向測序法，從是一種定向測序法，從dna的的3依賴特定引依賴特定引物延伸測定一段物延伸測定一段dna序列，再根據(jù)測得序列設(shè)計序列，再根據(jù)測得序列設(shè)計新的引物，作下一延伸反應(yīng)的引物，如此向前推新的引物，作下一延伸反應(yīng)的引物，如此向前推進(jìn)，最終測得進(jìn)，最終測得dna的全長序列。的全長序列。 （直讀，（直讀，sanger雙脫氧末端法也是直讀法）雙脫氧末端法也是直讀法）法是法是maxam和和gilbert等人等人1977年創(chuàng)建的，用來測定年創(chuàng)建的，用來測定dna序序列。列?；瘜W(xué)法是用化學(xué)試劑在化學(xué)法是用化學(xué)試劑在a、g、c、t處特定地裂解處特定地裂解dna片段，產(chǎn)生一簇各

29、種長度的短鏈（等差數(shù)列片段，產(chǎn)生一簇各種長度的短鏈（等差數(shù)列 n=1），經(jīng)過），經(jīng)過page和放射自顯影后，可以直接讀出和放射自顯影后，可以直接讀出dna的順序。的順序。 某些試劑能修飾或破壞某些試劑能修飾或破壞dna鏈上特定核苷酸的堿基進(jìn)而鏈上特定核苷酸的堿基進(jìn)而使使n-糖苷鍵斷裂，暴露出的糖環(huán)以糖苷鍵斷裂，暴露出的糖環(huán)以-消除反應(yīng)，在消除反應(yīng)，在3和和5位位上斷裂磷酸二酯鍵。使戊糖脫落，用于嘌呤環(huán)的試劑是硫酸上斷裂磷酸二酯鍵。使戊糖脫落，用于嘌呤環(huán)的試劑是硫酸二甲酯，而聯(lián)氨可用于肼解嘧啶環(huán)。二甲酯，而聯(lián)氨可用于肼解嘧啶環(huán)。4種核苷酸的特異裂解種核苷酸的特異裂解和鑒別方法如下：和鑒別方法如下

30、：1、用放射性核素標(biāo)記待測、用放射性核素標(biāo)記待測dna一側(cè)末端一側(cè)末端2、將標(biāo)記、將標(biāo)記dna分為分為g、a+g、c+t、c 4個反應(yīng)體系個反應(yīng)體系3、用不同的化學(xué)試劑處理不同反應(yīng)體系，隨機斷裂、用不同的化學(xué)試劑處理不同反應(yīng)體系，隨機斷裂dna片段某種堿基中的任何一個，產(chǎn)生一組一端為放射線片段某種堿基中的任何一個，產(chǎn)生一組一端為放射線標(biāo)記的末端，另一端為不同大小的標(biāo)記的末端，另一端為不同大小的dna片段的混合物片段的混合物4、電泳分離，放射自顯影得到互相錯落的梯形圖譜，即、電泳分離，放射自顯影得到互相錯落的梯形圖譜，即可讀出可讀出dna序列序列作用的堿基作用的堿基試劑與反應(yīng)試劑與反應(yīng)堿基釋放堿

31、基釋放dna斷裂斷裂強強g/弱弱a稀釋稀釋250倍硫酸二甲酯，在倍硫酸二甲酯，在50mm卡可酸（卡可酸（ph8.0）10mmgcl2、0.1medta20060分鐘，分鐘，dnag的的n7和和a的的n3甲基化甲基化甲基化嘌呤不穩(wěn)定，甲基化嘌呤不穩(wěn)定，在中型在中型ph加熱被破壞加熱被破壞在在0.1m堿中，堿中，9015分鐘，戊糖脫落，分鐘，戊糖脫落，dna鏈斷裂，鏈斷裂，g斷裂斷裂比比a快快5倍倍a同上同上0.2nhcl、0、60分分鐘，堿基被破壞鐘，堿基被破壞同上，同上，a斷裂比斷裂比g快快c+t15-18m聯(lián)苯胺、聯(lián)苯胺、2050分鐘，嘧啶環(huán)被破壞釋放分鐘，嘧啶環(huán)被破壞釋放0.5m哌啶處理，

32、斷哌啶處理，斷裂裂dna鍵，鍵，c與與t有有同樣速率同樣速率c2mnacl，聯(lián)氨處理方法同上，聯(lián)氨處理方法同上，100分鐘，此時，分鐘，此時，t的破壞被抑制，只有的破壞被抑制，只有c被破壞釋放被破壞釋放同上，只在同上，只在c處斷裂處斷裂dna鏈鏈 g反應(yīng)反應(yīng)-硫酸二甲酯（硫酸二甲酯（dms）使）使gn7甲基化，其后斷開甲基化，其后斷開了了c8-c9間的化學(xué)鍵，哌啶置換了被修飾鳥嘌呤與核糖的結(jié)合。間的化學(xué)鍵，哌啶置換了被修飾鳥嘌呤與核糖的結(jié)合。 g+a反應(yīng)反應(yīng)-（哌啶）甲酸使嘌呤環(huán)上氮原子質(zhì)子化，削（哌啶）甲酸使嘌呤環(huán)上氮原子質(zhì)子化，削弱了嘌呤脫氧核糖核苷酸和腺嘌呤脫氧核糖核苷酸的糖苷鍵，弱了嘌

33、呤脫氧核糖核苷酸和腺嘌呤脫氧核糖核苷酸的糖苷鍵，然后哌啶置換了嘌呤。然后哌啶置換了嘌呤。 t+c反應(yīng)反應(yīng)-肼斷開了嘧啶環(huán)，產(chǎn)生堿基片段被哌啶置換。肼斷開了嘧啶環(huán)，產(chǎn)生堿基片段被哌啶置換。 c反應(yīng)反應(yīng)-在在nacl存在時，只有存在時，只有c才能與肼發(fā)生反應(yīng)，隨后，才能與肼發(fā)生反應(yīng)，隨后，被修飾的胞嘧啶被哌啶置換。被修飾的胞嘧啶被哌啶置換。限制酶消化待測限制酶消化待測dna，得到長度為，得到長度為100-200bp的一組片段，純化回的一組片段，純化回收每收每1個片段作為測序材料。個片段作為測序材料。堿性磷酸酶處理消除堿性磷酸酶處理消除5磷酸。磷酸。多核苷酸酶催多核苷酸酶催32pdntp標(biāo)記（標(biāo)記（

34、5-oh）末端。）末端。使標(biāo)記片段變性為單鏈。使標(biāo)記片段變性為單鏈。分成分成4-5個反應(yīng)體系，按上述程序（表或個反應(yīng)體系，按上述程序（表或4個機制）化學(xué)處理，嚴(yán)格個機制）化學(xué)處理，嚴(yán)格控制反應(yīng)條件。（使得平均每控制反應(yīng)條件。（使得平均每1個個dna分子只有分子只有1個位置被斷裂，這種斷裂個位置被斷裂，這種斷裂是隨機的，如是隨機的，如g反應(yīng)，則在反應(yīng)，則在dna鏈上任意位置鏈上任意位置g斷裂），斷裂），dna鏈上每鏈上每50-100堿基只有堿基只有1個被裂解，這樣，每個反應(yīng)中雖然都在同一核苷酸處斷裂個被裂解，這樣，每個反應(yīng)中雖然都在同一核苷酸處斷裂dna鏈，但由于堿基位置不同，產(chǎn)生鏈，但由于堿基位置不同，產(chǎn)生1