第二十一章免疫學(xué)方法技術(shù)

1、第21章 免疫學(xué)方法技術(shù)一、凝集反應(yīng)（agglutination reaction）l概念：細(xì)菌、細(xì)胞等顆粒性抗原或包被有抗原的顆粒狀物質(zhì)（如聚苯乙烯乳膠等）與相應(yīng)的抗體結(jié)合，出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的凝集團(tuán)，稱為凝集反應(yīng)。l1、直接凝集：將細(xì)菌或紅細(xì)胞與相應(yīng)的抗體直接反應(yīng)，出現(xiàn)細(xì)菌凝集或紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象。又分為玻片法和試管法。l2、間接凝集：將可溶性抗原包被在紅細(xì)胞或乳膠顆粒表面，與相應(yīng)抗體反應(yīng)出現(xiàn)顆粒凝集現(xiàn)象。細(xì)菌的鑒定和血型的檢查檢測(cè)病原體可溶性抗原，病原體感染后產(chǎn)生的抗體二、沉淀反應(yīng)（precipitation）l概念：可溶性抗原（免疫球蛋白、細(xì)胞裂解物、組織浸液等）與相應(yīng)抗體結(jié)合， 形成不溶性免疫

2、復(fù)合物，出現(xiàn)不透明的沉淀物。在液體中進(jìn)行出現(xiàn)絮狀沉淀，在半固體瓊脂凝膠上進(jìn)行，形成白色的沉淀。1單向免疫擴(kuò)散(single immunodiffusion)2雙向免疫擴(kuò)散(double immunodiffusion)3免疫電泳(immunoelectrophoresis)4免疫比濁(immunonephelometry) 2、雙向免疫擴(kuò)散（doule immunodiffusion）：抗原與抗體在瓊脂板中相互擴(kuò)散而形成一定類型的沉淀線的方法。常用于抗原或抗體的定性檢測(cè)、組成和兩種抗原相關(guān)性分析。 1）簡(jiǎn)易免疫電泳先將抗原樣品在瓊脂中進(jìn)行電泳分離，可將蛋白質(zhì)抗原分子分成不同的區(qū)帶，然后將抗血清

3、加入瓊脂板橫槽中，使二者進(jìn)行雙向擴(kuò)散，當(dāng)比例合適時(shí)即形成特異性的沉淀線， 2）對(duì)流免疫電泳(counter immunoelectrophoresis, ciep) 是將雙向免疫擴(kuò)散與電泳相結(jié)合的一種技術(shù)3）火箭免疫電泳(rocket immunoelectrophoresis)，抗原在電場(chǎng)下通過(guò)含有一定量抗體的瓊脂凝膠，并于抗體發(fā)生反應(yīng)，形成沉淀帶?？啥糠治?。4、免疫比濁在一定量抗體中分別加入遞增量的抗原，經(jīng)一定時(shí)間形成免疫復(fù)合物，液體混濁。用濁度計(jì)測(cè)量反應(yīng)體系的濁度，可繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并依據(jù)濁度推算樣品中抗原含量。 三、補(bǔ)體參與的反應(yīng)溶菌溶菌反應(yīng)反應(yīng)細(xì)菌與相應(yīng)細(xì)菌與相應(yīng)ab結(jié)合，可激活補(bǔ)體，

4、使細(xì)結(jié)合，可激活補(bǔ)體，使細(xì)菌溶解。主要發(fā)生于霍亂弧菌等菌溶解。主要發(fā)生于霍亂弧菌等g+菌，菌，可用于細(xì)菌鑒定。可用于細(xì)菌鑒定。溶血溶血反應(yīng)反應(yīng)紅細(xì)胞與相應(yīng)抗體結(jié)合，通過(guò)激活補(bǔ)體紅細(xì)胞與相應(yīng)抗體結(jié)合，通過(guò)激活補(bǔ)體使紅細(xì)胞溶解，可作為補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)的使紅細(xì)胞溶解，可作為補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)的指示系統(tǒng)。指示系統(tǒng)。補(bǔ)體結(jié)補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)合反應(yīng)是一種在補(bǔ)體參與的條件下，以綿羊紅是一種在補(bǔ)體參與的條件下，以綿羊紅細(xì)胞和溶血素作為指示系統(tǒng)來(lái)測(cè)定有無(wú)細(xì)胞和溶血素作為指示系統(tǒng)來(lái)測(cè)定有無(wú)相應(yīng)抗原或抗體的血清學(xué)試驗(yàn)。相應(yīng)抗原或抗體的血清學(xué)試驗(yàn)。免疫標(biāo)記技術(shù)（immunolabelling technique）l概念：用熒光素、同

5、位素或酶等示蹤物質(zhì) 標(biāo)記抗體（或抗原）進(jìn)行抗原-抗體反應(yīng)。標(biāo)記物質(zhì)未改變抗原抗體的免疫學(xué)特性，同時(shí)標(biāo)記物極大的提高了反應(yīng)的靈敏度，可以對(duì)微量物質(zhì)進(jìn)行定量、定性或定位檢測(cè)。l免疫標(biāo)記技術(shù)主要有三種基本類型：免疫熒光技術(shù)、免疫酶技術(shù)和同位素標(biāo)記技術(shù)。1抗體制備。l多克隆抗體l單克隆抗體，2標(biāo)記物與標(biāo)記方法。 放射性同位素、酶、熒光分子、化學(xué)和生物發(fā)光系統(tǒng)。免疫分析基本環(huán)節(jié) 3分析方式設(shè)計(jì)：非競(jìng)爭(zhēng)方式、競(jìng)爭(zhēng)方式；直接法、間接法；標(biāo)記抗原、標(biāo)記抗體；均相、非均相4.信號(hào)檢測(cè)。與相應(yīng)的標(biāo)記物對(duì)應(yīng)。主要為分光光度法、熒光光度法、化學(xué)發(fā)光檢測(cè)法。一、免疫熒光法(immunofluorescence,if)l

6、概念：熒光素標(biāo)記的抗體（抗原）與組織或細(xì)胞中的相應(yīng)抗原（抗體）結(jié)合，借助于熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀對(duì)抗原（抗體）進(jìn)行鑒定或定位。l（1）直接熒光法：熒光素直接標(biāo)記抗體，對(duì)標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)。該法優(yōu)點(diǎn)是特異性高，缺點(diǎn)是檢查任一抗原均須制備相應(yīng)熒光抗體。l（2）間接熒光法：用一抗與標(biāo)本中抗原結(jié)合，再用熒光素標(biāo)記的二抗進(jìn)行檢測(cè)。該法優(yōu)點(diǎn)是敏感度比直接法高，制備一種熒光素標(biāo)記的二抗即可用于多種抗原的檢測(cè),但非特異性反應(yīng)亦增強(qiáng)。免疫熒光法分類免疫熒光法圖示mouse kidney sectionlaminin - green-fluorescent qdot 565 igg cd31- red-fluoresc

7、ent qdot 655 iggnuclei - blue-fluorescent hoechst 33342controltslptslp - alexafluor 488 nuclei - propidium iodide hasmc 流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry, fcm)l概念：fcm是將免疫熒光技術(shù)應(yīng)用于流式細(xì)胞儀，對(duì)單個(gè)細(xì)胞的表面標(biāo)志（抗原或受體）進(jìn)行快速、精確的分析和自動(dòng)檢測(cè)，并將不同類型的細(xì)胞分選收集。lfcm還可對(duì)同一細(xì)胞的多種參數(shù)（如dna、rna、蛋白質(zhì)和細(xì)胞體積等）進(jìn)行多信息分析，為當(dāng)代生命科學(xué)研究領(lǐng)域中廣泛使用的一項(xiàng)新技術(shù)。流式細(xì)胞儀的細(xì)胞分析原理l待測(cè)細(xì)

8、胞被制成單細(xì)胞懸液，經(jīng)特異性熒光染料染色后加入樣品管中，在氣體壓力推動(dòng)下進(jìn)入流動(dòng)室。l流動(dòng)室內(nèi)充滿鞘液，在鞘液的約束下，細(xì)胞排成單列出流動(dòng)室噴嘴口，并被鞘液包繞形成細(xì)胞液柱，進(jìn)入流動(dòng)室。l被熒光染料染色的細(xì)胞受到強(qiáng)烈的激光照時(shí)后發(fā)出熒光，被熒光光電倍增管接收，實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞的定量分析。l再通過(guò)流束形成含有細(xì)胞的帶電液滴而實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞的分選。 流式細(xì)胞儀工作原理二、酶免疫測(cè)定(enzyme immunoassay, eia)l概念：是用酶標(biāo)記的抗體進(jìn)行的抗原抗體反應(yīng)。將抗原-抗體反應(yīng)的特異性與酶催化作用的高效性相結(jié)合，借助酶作用于底物的顯色反應(yīng)判定結(jié)果。l常用的酶為： 辣根過(guò)氧化物酶（hrp）、堿性磷

9、酸酯酶（ap）酶 底 物顯色反應(yīng) 測(cè)定波長(zhǎng) 辣根過(guò)氧化物酶 鄰苯二胺（opd） 3、3二氨基聯(lián)苯胺（dab） 氨基水楊酸鄰聯(lián)苯甲胺2,2-連胺基-2(3-乙基-并噻唑啉磺酸-6)銨鹽 橘紅色黃色棕色蘭色藍(lán)綠色492460449425642堿性磷酸酯酶 4-硝基酚磷酸鹽(pnp)萘酚-as-mx磷酸鹽+重氮鹽 黃色紅色 400500 葡萄糖氧化酶 abts+hrp+葡萄糖葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑蘭 黃色深藍(lán)色 405420 常用的方法如下：（1）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定可溶性抗原或抗體（2）免疫細(xì)胞或組織化學(xué)測(cè)定組織中或細(xì)胞表面的抗原1. 免疫細(xì)胞或免疫組化技術(shù)l概念：應(yīng)用酶標(biāo)記的抗體與組織或細(xì)胞抗原

10、發(fā)生反應(yīng)，結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察，對(duì)組織或細(xì)胞表面抗原進(jìn)行定性、定量、定位。iccihc2.酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) (enzyme linked immunosorbent assay，elisa) l基本原理：是將過(guò)量抗體（抗原）包被于載體（聚苯乙烯微量反應(yīng)板）上，通過(guò)抗原抗體反應(yīng)使酶標(biāo)記抗體（抗原）也結(jié)合在載體上，經(jīng)洗滌去除游離的酶標(biāo)記抗體（抗原）后，加入底物顯色，定性或定量分析有色產(chǎn)物確定待測(cè)物的存在與含量的檢測(cè)技術(shù)。l是酶免疫測(cè)定中應(yīng)用最廣的技術(shù)，用于測(cè)定可溶性抗原或抗體。elisa試劑盒試劑盒1. 雙抗體夾心法l用于檢測(cè)特異性抗原。l方法：將已知抗體吸附于固相載體加入待檢標(biāo)本(含相應(yīng)抗原)與之結(jié)合

11、。溫育后洗滌，加入酶標(biāo)抗體和底物進(jìn)行測(cè)定。 l該試驗(yàn)所用的包被抗體與酶標(biāo)抗體應(yīng)分別針對(duì)不同抗原決定基，或其中之一用多克隆抗體，且相互間應(yīng)無(wú)交叉反應(yīng)。2. 間接法l用于檢測(cè)特異性抗體。l方法：將已知抗原吸附于固相載體，加入待檢標(biāo)本(含相應(yīng)抗體)與之結(jié)合。洗滌后，加入酶標(biāo)抗球蛋白抗體(酶標(biāo)抗抗體)和底物進(jìn)行測(cè)定。 抗 原一 抗二 抗生物素hrp親合素3. 競(jìng)爭(zhēng)法l用于抗原和半抗原（抗原決定簇少）的定量測(cè)定，也可用于測(cè)定抗體。l方法：以測(cè)定抗原為例將持異性抗體吸附于固相載體；加入待測(cè)抗原和一定量的酶標(biāo)已知抗原，使二者競(jìng)爭(zhēng)與固相抗體結(jié)合；經(jīng)過(guò)洗滌分離，最后結(jié)合于固相的酶標(biāo)抗原與待測(cè)抗原含量呈負(fù)相關(guān)。

12、elisa反應(yīng)過(guò)程反應(yīng)過(guò)程動(dòng)畫(huà)演示動(dòng)畫(huà)演示4. 酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)ellsa方法的技術(shù)要點(diǎn) il與固相載體結(jié)合的抗原或抗體稱為免疫吸附劑。將抗原或抗體固相化的過(guò)程稱為包被(coating)，由于載體不同，包被的方法也不同。l使用聚苯乙烯制品為載體一般多采用物理吸附法。除載體的理化性質(zhì)外，受緩沖液的離子強(qiáng)度、ph值、包被時(shí)的溫度和時(shí)間等多種因素的影響。l用抗原或抗體包被后。固相載體表面往往尚殘留少量未飽和的吸附位點(diǎn)，產(chǎn)生非特異吸附，導(dǎo)致本底偏高。為此常用15bsa，或含520小牛血清的ph9.6碳酸鹽緩沖液注滿凹孔，37作用1h，可以消除此種干擾。這一過(guò)程稱為封閉(blocking)。固相載體和免

13、疫吸附劑的制備 ellsa方法的技術(shù)要點(diǎn) ii抗原和抗體l用于制備酶標(biāo)記物和包被固相載體的抗原要求純度高，抗原性完整；抗體需特異、效價(jià)高、親和力強(qiáng)，并具有較高的比活性。l如將抗體igg用木瓜蛋白酶水解為fab片段，再與酶連接，可以減少非特異性吸附，檢測(cè)效果更佳。lmcab的應(yīng)用，進(jìn)一步提高elisa法的特異性和靈敏度。使用針對(duì)抗原分子中不同決定簇的兩種mcab分別作為固相抗體和酶標(biāo)抗體用于雙位點(diǎn)夾心法，簡(jiǎn)化了操作程序。l通常采用特異性較高的mcab作為固相包被抗體，與酶標(biāo)記的多克隆抗體相結(jié)合進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果更為滿意。 l在elisa法中，用于標(biāo)記抗體或抗原的酶與免疫酶組織化學(xué)技術(shù)基本上相同。但所

14、用底物被酶裂解后，應(yīng)能生成可溶性有色產(chǎn)物，適合用分光光度計(jì)(酶標(biāo)儀)測(cè)量光密度值，籍以定量測(cè)定樣品中待撿抗原或抗體的含量。ellsa方法的技術(shù)要點(diǎn) iii常用的酶及其底物 n辣根過(guò)氧化物酶(hrp)opd, tmbn堿性磷酸酶(ap)pnpn半乳糖苷酶(gal)npgn葡萄糖氧化酶(gop)pap三、放射免疫測(cè)定法(radioimmunoassay, ria)l概念：是用放射性核素標(biāo)記抗原進(jìn)行的免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)。它將放射性核素顯示的高靈敏性和抗原抗體反應(yīng)的特異性結(jié)合，使檢測(cè)的敏感性達(dá)pg水平。常用于標(biāo)記的放射性核素有i125和i131。l常用于胰島素、生長(zhǎng)激素、藥物等微量物質(zhì)的測(cè)定。結(jié)合相游離相

15、 ag* ab ag 標(biāo)記抗原 特異性抗體 待測(cè)抗原( ag*-ab)+ (ag-ab) 抗原抗體復(fù)合物分離ag*-ab 和游離ag*從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀知含量測(cè)定ag*-ab和/或游離ag*放射性 示意圖ria法原理及標(biāo)準(zhǔn)曲線7550301001101001000未標(biāo)記抗原濃度（ng/ml)結(jié)合/未結(jié)合的放射活性（%）四、化學(xué)發(fā)光免疫分析l概念：將發(fā)光物質(zhì)（如吖啶酯、魯米諾等）標(biāo)記抗原或抗體，發(fā)光物質(zhì)在反應(yīng)劑（如過(guò)氧化陰離子）激發(fā)下發(fā)射光子，通過(guò)自動(dòng)發(fā)光分析儀測(cè)定光子產(chǎn)量，可反映待檢樣品中抗體或抗原含量。l該法靈敏度高，常用于檢測(cè)血清超微量活性物質(zhì)（甲狀腺素等激素）。靈敏，無(wú)污染，可用于替代放射免

16、疫。五、免疫膠體金標(biāo)記技術(shù) (immunogold labeling technique) l概念：是以膠體金作為示蹤標(biāo)記物，應(yīng)用于抗原抗體反應(yīng)的一種免疫標(biāo)記技術(shù)；膠體金是由氯金酸在還原劑如白磷、抗壞血酸、枸櫞酸鈉和鞣酸等作用下，聚合成特定大小的金顆粒，并由于靜電作用成為一種穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，故稱為膠體金。l電鏡：高電子密度l試紙：膠體金的光散射性與溶膠顆粒的大小密切相關(guān)， 顆粒大小發(fā)生變化，光散射也隨之發(fā)生變異，產(chǎn)生肉眼可見(jiàn)的顯著的顏色變化。l膠體金是氯金酸(haucl4)的水溶膠顆粒，具有高電子密度，在電鏡中顆粒致密，易于辨認(rèn)，定位比酶反應(yīng)物精確。膠體金標(biāo)記舉例：膠體金試紙檢測(cè)尿hcgl早孕

17、尿試紙條：兩條杠，檢測(cè)迅速，靈敏度高1）干燥試紙條 膠體金免疫快速檢測(cè)hcg原理2）加樣1.雙抗體夾心法-大分子抗原 3）反應(yīng)和遷徙 4）陽(yáng)性結(jié)果：兩條紅線 5）陰性結(jié)果：一條紅線 膠體金免疫試紙構(gòu)造六、免疫印跡技術(shù)l 免疫印跡(immunoblotting)又稱蛋白質(zhì)印跡(western blotting)，是一種借助特異性抗體鑒定抗原的有效方法。l凝膠電泳和固相免疫測(cè)定技術(shù)l將含有目標(biāo)蛋白(抗原)的樣品首先用sds-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sds-page)或非變性電泳(native-page)等分離后，通過(guò)轉(zhuǎn)移電泳原位轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜或其它膜的表面，然后將膜表面的蛋白質(zhì)再用抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行

18、特異性檢測(cè)。western blot method包括5個(gè)步驟：p1)固定：蛋白質(zhì)進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(page)并從膠上轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。p2)封閉：保持膜上沒(méi)有特殊抗體結(jié)合的場(chǎng)所，使場(chǎng)所處于飽和狀態(tài)，用以保護(hù)特異性抗體結(jié)合到膜上,并與蛋白質(zhì)反應(yīng)。p3)初級(jí)抗體(第一抗體)是特異性的。p4)第二抗體或配體試劑對(duì)于初級(jí)抗體是特異性結(jié)合并作為指示物。p5)適當(dāng)保溫后的酶標(biāo)記蛋白質(zhì)區(qū)帶，產(chǎn)生可見(jiàn)的、不溶解狀態(tài)的顏色反應(yīng)。單個(gè)核細(xì)胞的分離 淋巴細(xì)胞亞群的分離 t細(xì)胞功能檢測(cè)b細(xì)胞功能檢測(cè)免疫細(xì)胞及其亞類分離、鑒定和檢測(cè) 淋巴細(xì)胞功能測(cè)定 t細(xì)胞的鑒定和檢測(cè) b細(xì)胞的鑒定和檢測(cè) 一、免疫細(xì)胞及亞

19、類分離、鑒定和檢測(cè)（一）外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離淋巴細(xì)胞分離液（二）淋巴細(xì)胞亞群的分離尼龍棉分離法 e花結(jié)分離法 洗淘法 流式細(xì)胞術(shù) 磁分離技術(shù) 1、e玫瑰花環(huán)形成試驗(yàn)（三）t細(xì)胞及其亞群的鑒定和檢測(cè)可用于t細(xì)胞的鑒定和檢測(cè)。綿羊紅細(xì)胞+人外周血淋巴細(xì)胞 4 12h 花環(huán)樣細(xì)胞集團(tuán)正常人外周血中e玫瑰花環(huán)形成細(xì)胞占淋巴細(xì)胞總數(shù)的6080%。t細(xì)胞細(xì)胞cd2/e受體受體srbc/綿羊紅細(xì)胞綿羊紅細(xì)胞（三）t細(xì)胞及其亞群的鑒定和檢測(cè)2、t細(xì)胞單克隆抗體對(duì)t細(xì)胞及其亞群的鑒定和檢測(cè)所用的ab主要有：cd3mcab、cd4mcab和cd8mcab。方法：免疫熒光間接法。 外周血淋巴細(xì)胞+分別用小鼠抗人c

20、d3、cd4、cd8mcab （第一ab）+熒光素標(biāo)記的（第二ab ）熒光顯微鏡觀察。小鼠抗人mcab熒光標(biāo)記的兔抗小鼠igg抗體（三）t細(xì)胞及其亞群的鑒定和檢測(cè)2、t細(xì)胞單克隆抗體對(duì)t細(xì)胞及其亞群的鑒定和檢測(cè) 結(jié)果： （1）被cd3mcab著染熒光的細(xì)胞是總t細(xì)胞。 包括：th、th1、th2、tc、ts細(xì)胞。 （2）被cd4mcab著染熒光的細(xì)胞是th、th1、th2 （3）被cd8mcab著染熒光的細(xì)胞是tc、ts細(xì)胞。 計(jì)數(shù)： 100200個(gè)淋巴細(xì)胞，計(jì)算出染陽(yáng)性細(xì)胞百分率： cd3t細(xì)胞占6580%。cd4t細(xì)胞占5060%。 cd8t細(xì)胞占2030%， cd4t細(xì)胞與cd8t細(xì)胞比

21、值約2：1。 smigm/d是b細(xì)胞表面的標(biāo)志。通過(guò)對(duì)該種標(biāo)志的檢測(cè)，可對(duì)b細(xì)胞進(jìn)行鑒定和檢測(cè)。免疫熒光直接法。 熒光素標(biāo)記的兔抗人igm/d抗體+外周血淋巴細(xì)胞 直接免疫熒光染色。 著染熒光的細(xì)胞-b細(xì)胞。 占淋巴細(xì)胞總數(shù)的812%。（四）b細(xì)胞鑒定和檢測(cè)兔抗人igm/d抗體二、淋巴細(xì)胞功能測(cè)定1、淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)2、細(xì)胞毒性試驗(yàn)（lmc-t）1、溶血空斑試驗(yàn)2、定量溶血分光光度測(cè)定法1、淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)原理：t細(xì)胞 特異性ag或有絲分裂原 淋巴母細(xì)胞 （體積更大、代謝旺盛）根據(jù)其轉(zhuǎn)化程度和轉(zhuǎn)化率，測(cè)定機(jī)體細(xì)胞免疫功能狀態(tài)（1）非特異性轉(zhuǎn)化試驗(yàn)（2）特異性轉(zhuǎn)化試驗(yàn)（一）t細(xì)胞功能檢測(cè) t細(xì)胞 植物血凝素（pha）或刀豆蛋白a（con a） 淋巴母細(xì)胞。 （有絲分裂原） 正常人t細(xì)胞轉(zhuǎn)化率約為70%。（1）非特異性轉(zhuǎn)化試驗(yàn)1、淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)（一）t細(xì)胞功能檢測(cè)t細(xì)胞 特異性抗原（如結(jié)核菌素ot）或ppd 淋巴母細(xì)胞。