過柱子的原理與方法[共8頁]

1、過柱子的原理與方法標(biāo)簽：過柱子硅膠原理方法常說的過柱子應(yīng)該叫柱層析分離, 也叫柱色譜。 我們常用的是以硅膠或氧化鋁作固定相的吸附柱。,硅膠層析是根據(jù)物質(zhì)在硅膠上的吸附力不同而使物質(zhì)分離,一般情況下極性較大的物質(zhì)易被硅膠吸附, 極性較弱的物質(zhì)不易被硅膠吸附,整個層析過程即是吸附、解吸、 再吸附、再解吸過程。 硅膠層析主要用于石油產(chǎn)品的精制, 脫除芳烴物質(zhì)或用于中草藥有效成分的分離提純,高純度物質(zhì)的制備等。硅膠層析性狀： 該產(chǎn)品為白色均勻顆粒, 主要成分為二氧化硅,由優(yōu)質(zhì)硅膠為原料加工制成。其主要特點是能通過對混合物質(zhì)中的不同成分吸附保留時間的差異, 達到分離提純的目的。 依其純度又分為工業(yè)級粗孔

2、柱層析硅膠、試劑級柱層析硅膠。用途： 主要用于石油產(chǎn)品的精制, 脫除芳烴物質(zhì)或用于中草藥有效成分的分離提純, 高純度物質(zhì)的制備等。硅膠表面結(jié)構(gòu)概述在色譜和工業(yè)水處理領(lǐng)域中,無定形硅膠已得到了廣泛的應(yīng)用,它具有多孔的無定形結(jié)構(gòu),不產(chǎn)生任何 x 射線衍射 1,4。硅膠的表面存在著硅醇基團 (si-oh)和暴露的硅氧烷鍵 (si-o-si)。硅醇基團是強吸附的極性基團,而硅氧烷鍵是疏水基團。硅氧烷鍵上的 鍵被 d-p作用而加強, 氧原子上的孤對電子參與 作用, 不能參與給體與受體間的相互作用, 不能形成氫鍵。scott 和 kucera 證實硅氧烷基團幾乎不吸附極性溶劑分子。然而,由于硅氧烷鍵的疏水

3、作用性,可以吸附某些非極性溶劑分子。 對硅膠改性而言,硅醇基比硅氧烷基重要得多。硅醇基團可以孤立、成對 (雙生 )和締合 (連位)等不同的方式存在于硅膠表面。最近研究表明,不僅兩個或兩個以上的締合硅醇基團可以形成鍵合對, 甚至成對硅醇基團也可以形成鍵合對。硅膠表面的結(jié)構(gòu)可以通過許多方法進行測定。 一般情況下, 隨著比表面積的增加, 硅膠表面上硅醇基團的濃度略有降低。 通常硅醇含量的測定方法有同位素交換法、 滴定法、 光譜法和烷基鋁法等。 nawrock1 報道了用同位素交換法測定硅膠表面的硅醇基濃度是 8.0 1.0mol/m2 ,而且這個數(shù)值常常被視為硅膠的物理化學(xué)常數(shù)。硅醇基團具有明顯的酸

4、性,測定的 pka 值是 7.1。通過對硅膠表面的結(jié)構(gòu)分析,可知硅膠表面硅醇基的類型、濃度和表面分布都會影響所制備鍵合相的性能, 而硅膠的預(yù)處理則可以改變表面硅醇類型的分布, 提高表面的締合硅醇的含量,改善硅膠表面鍵合相的性能。硅膠柱層析技術(shù)硅膠柱層析原理硅膠層析法的分離原理是根據(jù)物質(zhì)在硅膠上的吸附力不同而得到分離, 一般情況下極性較大的物質(zhì)易被硅膠吸附,極性較弱的物質(zhì)不易被硅膠吸附, 整個層析過程即是吸附、 解吸、再吸附、再解吸過程。硅膠柱層析流動相極性小的用乙酸乙酯：石油醚洗脫；極性較大的用甲醇：氯仿洗脫；極性大的用甲醇：水：正丁醇：醋酸洗脫；拖尾可以加入少量氨水或冰醋酸硅膠柱層析慣用方法

5、1.稱量。 200-300 目硅膠,稱 30-70 倍于上樣量；如果極難分,也可以用 100 倍量的硅膠 H。干硅膠的視密度在 0.4 左右,所以要稱 40g 硅膠,用燒杯量 100ml 也可以。2.攪成勻漿。加入干硅膠體積一倍的溶劑用玻璃棒充分?jǐn)嚢?。如果洗脫劑是石油?/ 乙酸乙酯 /丙酮體系,就用石油醚拌；如果洗脫劑是氯仿 / 醇體系,就用氯仿拌。如果不能攪成勻漿,說明溶劑中含水量太大,尤其是乙酸乙酯 / 丙酮,如果不與水配伍走分配色譜的話,必須預(yù)先用無水硫酸鈉久置干燥。氯仿用無水氯化鈣干燥,以除去 1%的醇。如果樣品對酸敏感,不能用氯仿體系過柱。3.裝柱。將柱底用棉花塞緊,不必用海沙,加

6、入約 1/3 體積石油醚（氯仿） ,裝上蓄液球,打開柱下活塞,將勻漿一次傾入蓄液球內(nèi)。隨著沉降,會有一些硅膠沾在蓄液球內(nèi),用石油醚（氯仿）將其沖入柱中。4.壓實。沉降完成后,加入更多的石油醚,用雙聯(lián)球或氣泵加壓,直至流速恒定。柱床約被壓縮至 9/10 體積。無論走常壓柱或加壓柱,都應(yīng)進行這一步,可使分離度提高很多,且可以避免過柱時由于柱床萎縮產(chǎn)生開裂。5.上樣。干法濕法都可以。海沙是沒必要的。上樣后,加入一些洗脫劑,再將一團脫脂棉塞至接近硅膠表面。然后就可以放心地加入大量洗脫劑,而不會沖壞硅膠表面。6.過柱和收集。柱層析實際上是在擴散和分離之間的權(quán)衡。太低的洗脫強度并不好,推薦用梯度洗脫。收集

7、的例子： 10mg 上樣量, 1g 硅膠 H,0.5ml 收一餾分； 1-2g 上樣量, 50g硅膠（ 200-300 目）,20-50ml 收一餾分。7.檢測。要更多地使用專用噴顯劑,如果僅用紫外燈,會損失較多產(chǎn)品,紫外的靈敏度一般比噴顯劑底 1-2 個數(shù)量級。8.送譜。收集的產(chǎn)品旋干,在送譜前通常需要重結(jié)晶。如果樣品太少或為液體,可過一小凝膠柱,作為送譜前的最后純化手段?？沙渥V 1.5ppm 左右所謂的“硅膠”峰。注意事項1.先根據(jù) TLC方法篩選好洗脫劑,使兩相鄰物質(zhì) Rf 值之差最大化2.將柱子必須裝平整、均勻3.考慮有限柱填料的吸附量4.可考慮用剃度法分開并洗脫柱層析分離的實驗方

8、法和方法技巧 1B= vrGq一：柱子可以分為：加壓,常壓,減壓壓力可以增加淋洗劑的流動速度, 減少產(chǎn)品收集的時間, 但是會減低柱子的塔板數(shù)。 所以其他條件相同的時候,常壓柱是效率最高的,但是時間也最長,比如天然化合物的分離,一個柱子幾個月也是有的。減壓柱能夠減少硅膠的使用量, 感覺能夠節(jié)省一半甚至更多, 但是由于大量的空氣通過硅膠會使溶劑揮發(fā) （有時在柱子外面有水汽凝結(jié)） ,以及有些比較易分解的東西可能得不到,而且還必須同時使用水泵抽氣（很大的噪音,而且時間長） 。以前曾經(jīng)大量的過減壓柱,對它有比較深厚的感情,但是自從嘗試了加壓后,就幾乎再也沒動過減壓的念頭了。加壓柱是一種比較好的方法, 與

9、常壓柱類似, 只不過外加壓力使淋洗劑走的快些。 壓力的提供可以是壓縮空氣,雙連球或者小氣泵（給魚缸供氣的就行） 。特別是在容易分解的樣品的分離中適用。 壓力不可過大, 不然溶劑走的太快就會減低分離效果。 個人覺得加壓柱在普通的有機化合物的分離中是比較適用的。三：關(guān)于無水無氧柱適用于對氧,水敏感,易分解的產(chǎn)品,可以濕柱,也可以干柱。不過在樣品之前至少要用溶劑把柱子飽和一次, 因為溶劑和硅膠飽和時放出的熱量有可能是產(chǎn)品分解, 畢竟要分離的是敏感的東東, 小心不為過。 也是因為分離的東西比較敏感, 所以接收瓶一定要用可密封的,遵循 schlenk 操作。至于是加壓、常壓、減壓,隨需而定。因為是 sc

10、hlenk 操作,所以點板是個問題,如果樣品是顯色的,恭喜了,不用點板,直接看柱子上的色帶就行了。如果樣品無色,只好準(zhǔn)備幾十個 schlenk 瓶,一瓶一瓶的點,不過幾次之后就知道樣品在哪,也就可以省些了。像我以前過一根無水無氧柱,需要六個 schlenk,現(xiàn)在只一個就能把所要的全收集到。無水無氧柱中用的比較多的是用氧化鋁作固定相。因為硅膠中有大量的羥基裸露在外,很容易是樣品分解, 特別是金屬有機化合物和含磷化合物。 而氧化鋁可以做成堿性、 中性和酸性的,選擇余地比較大,但是比硅膠要貴些。聽說有個方法,就是用石英做柱子,然后用HF254 做固定相,這樣在柱子外面用紫外燈一照就知道產(chǎn)品在哪里了,

11、沒有驗證過。哪位做過可以提出來大家參詳參詳。四：關(guān)于濕法、干法上樣濕法省事, 一般用淋洗劑溶解樣品, 也可以用二氯甲烷、 乙酸乙酯等, 但溶劑越少越好,不然溶劑就成了淋洗劑了。 很多樣品在上柱前是粘乎乎的, 一般沒關(guān)系。 可是有的上樣后在硅膠上又會析出, 這一般都是比較大量的樣品才會出現(xiàn), 是因為硅膠對樣品的吸附飽和, 而樣品本身又是比較好的固體才會發(fā)生, 這就應(yīng)該先重結(jié)晶, 得到大部分的產(chǎn)品后再柱分, 如果不能重結(jié)晶,那就不管它了,直接過就是了,樣品隨著淋洗劑流動會溶解的。有些樣品溶解性差,能溶解的溶劑又不能上柱（比如 DMF,DMSO 等,會隨著溶劑一起走,顯色是一個很長的脫尾） ,這時就

12、必須用干法上柱了。 樣品和硅膠的量有一種說法是 1：1,我覺得是越少越好,但是要保證在旋干后,不能看到明顯的固體顆粒（那說明有的樣品沒有吸附在硅膠上） 。五：溶劑的選擇當(dāng)然是最便宜,最安全,最環(huán)保的了。所以大多選用石油醚,乙酸乙酯。文獻中有寫用正己烷的, 太貴了, 除非特別需要不要用不然銀子嘩嘩的,流的比淋洗劑還快,不過因為極性很小,有時還是非它不可。乙醚也可以用, 但是就是容易睡覺, 注意保持清醒別讓溶劑流干了, 那樣柱子也就不爽了。二氯甲烷也有用的, 但是要知道,它和硅膠的吸附是一個放熱過程, 所以夏天的時候經(jīng)常會在柱子里產(chǎn)生氣泡, 天氣冷的時候會好一些。 甲醇據(jù)說能溶解部分的硅膠, 所以

13、產(chǎn)品如果想過元素分析的話要留神, 應(yīng)該經(jīng)過后繼處理, 比如說重結(jié)晶等。其他的溶劑用的相對較少,要依個人的不同需要選擇了。 Q7&Yy25由于某些原因,用到的淋洗劑多是大包裝的（便宜嘛） ,我們這里是用 10 升或 25 升的塑料桶裝的, 就要注意這些工業(yè)品的純度是較低的。 經(jīng)常能夠從送來的大桶底部看見有色的雜質(zhì), 其他的雜質(zhì)就可想而知了, 所以在比較嚴(yán)格的柱分時就要對溶劑重蒸。 當(dāng)然過原料時就可以免去這一步了,反正下面還有提純的方法。另外溶劑在過柱子后最好也回收使用, 一方面環(huán)保, 另一方面也能節(jié)省部分經(jīng)費, 缺點是要消耗一定的人工。 這里要注意的是, 一般在過柱同時進行的是減壓旋蒸, 石油醚

14、和乙酸乙酯的比例由于揮發(fā)度的不同會導(dǎo)致極性的變化, 一般會使得極性變大, 在梯度淋洗時比較合適, 正好極性越來越大了。在過完柱子后, 溶劑最后回收要采用常壓,因為在減壓旋蒸時會有部分低沸點的雜質(zhì)一起出來, 常壓時就會減少這種現(xiàn)象, 如果雜質(zhì)和你下面要過的樣品有反應(yīng)那就慘了。六：關(guān)于操作問題1、裝柱柱子下面的活塞一定不要涂潤滑劑,會被淋洗劑帶到產(chǎn)品中的,可以采用四氟節(jié)門的。干法和濕法裝柱覺得沒什么區(qū)別, 只要能把柱子裝實就行。 裝完的柱子應(yīng)該要適度的緊密 （太密了淋洗劑走的太慢） ,一定要均勻 （不然樣品就會從一側(cè)斜著下來） 。書中寫的都是不能見到氣泡, 我覺得在大多數(shù)情況下有些小氣泡沒太大的影

15、響, 一加壓氣泡就全下來了。 當(dāng)然如果你裝的柱子總是有氣泡就說明需要多練習(xí)了。 但是柱子更忌諱的是開裂, 甭管豎的還是橫的,都會影響分離效果,甚至作廢！2、加樣用少量的溶劑溶樣品加樣, 加完后將下面的活塞打開, 待溶劑層下降至石英砂面時, 再加少量的低極性溶劑,然后再打開活塞, 如此兩三次,一般石英砂就基本是白色的了。 加入淋洗劑,一開始不要加壓, 等溶樣品的溶劑和樣品層有一段距離 （24cm 就夠了）,再加壓,這樣避免了溶劑（如二氯甲烷等）夾帶樣品快速下行。3、淋洗劑的選擇感覺上要使所需點在 rf0.20.3 左右的比較好。不要認為在板上爬高了分的比較開,過柱子就用那種極性,如果 rf 在

16、0.6,即使相差 0.2 也不容易在柱子上分開,因為柱子是一個多次爬板的狀態(tài),可以通過公式的比較： 0.6/0.8 一次的分離度,肯定不如（ 0.2/0.3 ）的三次方或四次方大。4、樣品的收集用硅膠作固定相過柱子的原理是一個吸附與解吸的平衡。 所以如果樣品與硅膠的吸附比較強的話,就不容易流出。這樣就會發(fā)生,后面的點先出,而前面的點后出。這時可以采用氧化鋁作固定相。 另外,收集的試管大小要以樣品量而定, 特別是小量樣品, 如果用大試管,可能一根就收到了三個樣品, wuwu 。如果都用小試管那工作量又太大。5、最后的處理柱分后的產(chǎn)品, 由于使用了大量的溶劑, 其中的雜質(zhì)也會累積到產(chǎn)品中, 所以如果想送分析,最好用少量的溶劑洗滌一下,因為大部分的雜質(zhì)是溶在溶劑里