南開(kāi)大學(xué) 分子生物物理-生物分子相互作用

1、第一章 蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的功能催化功能催化功能運(yùn)輸功能運(yùn)輸功能防御功能防御功能收縮和運(yùn)動(dòng)功能收縮和運(yùn)動(dòng)功能結(jié)構(gòu)功能結(jié)構(gòu)功能信號(hào)傳導(dǎo)和調(diào)控功能信號(hào)傳導(dǎo)和調(diào)控功能遺傳和發(fā)育遺傳和發(fā)育蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)層次從高到低的形成過(guò)程蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)層次從高到低的形成過(guò)程第二章 蛋白質(zhì)的折疊蛋白質(zhì)的合成過(guò)程定義：蛋白質(zhì)折疊是多肽鏈憑借相互作用在細(xì)胞環(huán)境（特定的酸堿度、溫度等）下自己組裝自己，從無(wú)規(guī)卷曲（去折疊態(tài)）折疊到三維功能結(jié)構(gòu)（天然態(tài)）的物理過(guò)程。Anfinsen的經(jīng)典熱力學(xué)假說(shuō)： Anfinsen認(rèn)為天然蛋白質(zhì)多肽鏈所采取的構(gòu)象是在一定環(huán)境條件下（如溶液組分、pH、溫度、離子強(qiáng)度等），整個(gè)系統(tǒng)的總Gibbs自由

2、能取最低，所以處于變性狀態(tài)的多肽鏈能夠在這樣的環(huán)境下自發(fā)折疊成天然構(gòu)象。n分子伴侶n折疊酶n分子內(nèi)伴侶n Ellis1987年提出了蛋白質(zhì)“輔助性組裝學(xué)說(shuō)”。相對(duì)于“自組裝”學(xué)說(shuō)，認(rèn)為蛋白質(zhì)多肽鏈的正確折疊和組裝需要其他蛋白質(zhì)分子的幫助。第三章 生物分子的相互作用3.1 分子內(nèi)與分子間的相互作用力n相互作用的一般知識(shí)n強(qiáng)相互作用n弱相互作用n水結(jié)構(gòu)與水化作用3.1.1 相互作用的一般知識(shí) 生物分子以及由它們所組成體系的功能和其結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，而這種結(jié)構(gòu)之所以能夠維持取決于分子內(nèi)部基團(tuán)之間或者分子之間的各種相互作用力。用化學(xué)語(yǔ)言說(shuō)，就是存在各種主鍵（共價(jià)鍵、配位鍵）和次級(jí)鍵（氫鍵、范德華力、疏水相

3、互作用）。 主鍵：強(qiáng)相互作用，熱穩(wěn)定，維持原子結(jié)合，形成一級(jí)結(jié)構(gòu)。 次級(jí)鍵：弱相互作用，單獨(dú)或少數(shù)次級(jí)鍵將由熱運(yùn)動(dòng)而被破壞。但大量次級(jí)鍵決定生物大分子的空間結(jié)構(gòu)，既可保持穩(wěn)定性，又有較大的靈活易變性。 如蛋白質(zhì)維持一級(jí)結(jié)構(gòu)靠原子之間的共價(jià)結(jié)合（包括二硫鍵），維持二級(jí)結(jié)構(gòu)例如-螺旋、-折疊則依靠氫鍵等。氫鍵和共價(jià)鍵相比要弱得多，因此加熱或其它不很劇烈的方法就能使之?dāng)嗔?。但由于氫鍵數(shù)量較多，它在維持整個(gè)分子的空間結(jié)構(gòu)方面仍起很重要作用，只有一定數(shù)量的氫鍵都受到破壞，才能使結(jié)構(gòu)改變，分子喪失其活性。因此研究研究結(jié)構(gòu)以及結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系都必須以對(duì)相互作用力的了解作為基礎(chǔ)。 此外，生物體內(nèi)存在著大量特異

4、相互作用，在藥物、激素和細(xì)胞膜上的某些分子（如受體）之間，酶與其底物之間，以及抗原和抗體之間，都有這種特異相互作用。特異相互作用是識(shí)別（recognition）現(xiàn)象的基礎(chǔ)，并且是生命現(xiàn)象區(qū)別于非生命過(guò)程的一種特征。所以相互作用力的研究對(duì)于了解藥物、激素、酶、抗體等的作用機(jī)理具有十分重要的意義。當(dāng)熱運(yùn)動(dòng)時(shí)各種分子被帶到一起，那些表面當(dāng)熱運(yùn)動(dòng)時(shí)各種分子被帶到一起，那些表面形態(tài)相匹配的分子正確地靠攏。促使大分子形態(tài)相匹配的分子正確地靠攏。促使大分子形成發(fā)生特異相互反應(yīng)的一些非共價(jià)鍵包括形成發(fā)生特異相互反應(yīng)的一些非共價(jià)鍵包括氫鍵和范德華力。氫鍵和范德華力。 分子內(nèi)與分子間相互作用的意義：維持大分子的結(jié)

5、構(gòu) 分子間特異的相互作用（識(shí)別）實(shí)際上兩個(gè)原子核之間還有斥力，由于斥力而產(chǎn)生的勢(shì)能按指數(shù)規(guī)律變化：勢(shì)能與勢(shì)能曲線(xiàn)直接測(cè)定兩個(gè)原子或分子之間的力很困難，但在許多情況下常?？蓽y(cè)定相互作用的能量。例如當(dāng)Na+與Cl-相距無(wú)限遠(yuǎn)時(shí)，可認(rèn)為相互作用力為0，因此可以任意規(guī)定此時(shí)體系所具有的勢(shì)能為0。而當(dāng)這兩個(gè)離子由于引力作用彼此接近到相距為r時(shí)，其勢(shì)能為：因此整個(gè)體系勢(shì)能為E1與E2之和，即：E和r的關(guān)系按上式繪成圖，稱(chēng)為勢(shì)能曲線(xiàn)。斥力和引力平衡時(shí)勢(shì)能曲線(xiàn)出現(xiàn)最小值。 鍵能 鍵能指分開(kāi)原子系統(tǒng)的勢(shì)能與結(jié)合原子系統(tǒng)的勢(shì)能之差，可通過(guò)各種物理和化學(xué)方法測(cè)定，因此研究相互作用能比相互作用力更為方便。 一般把相互

6、作用分為強(qiáng)和弱兩類(lèi)，其標(biāo)準(zhǔn)是分子熱運(yùn)動(dòng)對(duì)它的影響。強(qiáng)相互作用不易受熱運(yùn)動(dòng)影響，而弱相互作用則易為熱運(yùn)動(dòng)所削弱或破壞。分子熱運(yùn)動(dòng)的平均能量為kT（T為絕對(duì)溫度，k為波爾茲曼常數(shù)），在體溫（310K）下此值約為2.51103J/mol。強(qiáng)相互作用遠(yuǎn)大于此值，弱相互作用與其同數(shù)量級(jí)。 強(qiáng)相互作用：共價(jià)鍵、離子鍵、配位鍵 弱相互作用：氫鍵、范德華力、疏水力 3.1.2 強(qiáng)相互作用意義： 維持原子結(jié)合，形成一級(jí)結(jié)構(gòu)包括：共價(jià)鍵 離子鍵 配位鍵一、共價(jià)鍵（covalent bond） 是化學(xué)鍵的一種，原子互相接近形成分子時(shí)共同使用它們的外層電子，在理想情況下達(dá)到電子飽和的狀態(tài)，由此組成比較穩(wěn)定的化學(xué)結(jié)構(gòu)叫

7、做共價(jià)鍵。其本質(zhì)是原子軌道重疊后，高概率地出現(xiàn)在兩個(gè)原子核之間的電子與兩個(gè)原子核之間的電性作用，原來(lái)分屬不同原子的電子云重新組合成屬于由這兩個(gè)相互作用的原子所組成體系的新的電子云分布，或者說(shuō)，原子軌道改變?yōu)榉肿榆壍馈?由于電子的微觀屬性，共價(jià)鍵的形成不能簡(jiǎn)單的用庫(kù)侖靜電相互作用來(lái)說(shuō)明，需要用量子力學(xué)的理論才能給出合理解釋。1. 共價(jià)鍵的形成圖分子軌道和原子軌道的原始狀態(tài)有關(guān)，如兩個(gè)氫原子外圍各有一個(gè)1s軌道，形成共價(jià)鍵時(shí)可得到兩種分子軌道，一種為成鍵軌道，另一種為反鍵軌道。這兩種軌道都對(duì)于聯(lián)結(jié)兩個(gè)原子核A和B的鍵軸對(duì)稱(chēng)，稱(chēng)為鍵。成鍵軌道兩核間電子云密度大，稱(chēng)為 軌道，反鍵軌道兩核間密度小，稱(chēng)為

8、 *軌道。每個(gè)鍵中有兩個(gè)電子，成鍵軌道能量較低，反鍵*軌道能量較高。能層能層n一一二二三三四四符號(hào)符號(hào)KLMN能級(jí)能級(jí)sspspdspdf軌道軌道數(shù)數(shù)1131351357最多最多容納容納的電的電子數(shù)子數(shù)22626102610142818322n2 能層、能級(jí)、原子軌道能層、能級(jí)、原子軌道鍵（sigma bond）n由兩個(gè)原子軌道沿軌道對(duì)稱(chēng)軸方向相互重疊導(dǎo)致電子在核間出現(xiàn)概率增大而形成的共價(jià)鍵，叫做鍵，可以簡(jiǎn)記為“頭碰頭”。一般的單鍵都是鍵。由于鍵是沿軌道對(duì)稱(chēng)軸方向形成的，軌道間重疊程度大，所以，通常鍵的鍵能比較大，不易斷裂，而且，由于有效重疊只有一次，所以?xún)蓚€(gè)原子間至多只能形成一條鍵。鍵（pi

9、 bond） n成鍵原子的未雜化p軌道，通過(guò)平行、側(cè)面重疊而形成的共價(jià)鍵，叫做鍵，可簡(jiǎn)記為“肩并肩”，其中的電子稱(chēng)為電子。鍵與鍵不同，它的成鍵軌道必須是未成對(duì)的p軌道。兩個(gè)原子間可以形成最多2條鍵，例如，碳碳雙鍵中，存在一條鍵，一條鍵，而碳碳三鍵中，存在一條鍵，兩條鍵。 原子軌道電子云密度的幾何圖形 鍵與 鍵s-s, s-p, p-pp-p成鍵能力n s，p，d 軌道電子的相對(duì)成鍵能力：n 成鍵能力大的軌道形成的共價(jià)鍵牢固，因此，p-p成鍵s-s成鍵。5,3, 1dpsfff2. 共軛體系生物大分子中存在大量的共軛體系嘌呤嘧啶芳香族氨基酸磷酸根生物大分子中共軛體系的意義二 離子鍵離子鍵與生物大

10、分子的識(shí)別有關(guān)：三 配位鍵3.1.3 弱相互作用作用：維持大分子的空間結(jié)構(gòu)包括：氫鍵、范德化力形成：有些與偶極子的存在有關(guān)靜電相互作用12123, U=q qq qFrrr1 電荷電荷電荷相互作用電荷相互作用乙酰膽堿脂酶對(duì)Ach水解包含了各種相互作用強(qiáng)相互作用起定位作用，弱相互作用決定其排列偶極子-偶極矩各種電相互作用及E與r的關(guān)系n電荷-電荷n電荷-偶極子n偶極子-偶極子n電荷-誘導(dǎo)偶極子n偶極子-誘導(dǎo)偶極子31rr121r61r41r2 電荷電荷偶極相互作用偶極相互作用3()qUrr -q+qqrxy3 偶極偶極偶極相互作用偶極相互作用1212323()()1, rrUlrrr 12rlr

11、4 電場(chǎng)誘導(dǎo)作用電場(chǎng)誘導(dǎo)作用-誘導(dǎo)偶極子誘導(dǎo)偶極子 以上討論的相互作用，都涉及電荷的非對(duì)稱(chēng)分布，即正、負(fù)電荷的重心不重合，由于正負(fù)電荷吸引而在電場(chǎng)中儲(chǔ)存能量。 正負(fù)電荷重心重合的中性分子或基團(tuán)，在外電場(chǎng)的誘導(dǎo)下，亦會(huì)出現(xiàn)極化現(xiàn)象，從而形成誘導(dǎo)偶極子。誘導(dǎo)偶極子與電場(chǎng)相互作用而儲(chǔ)存能量，這種相互作用稱(chēng)為電場(chǎng)的誘導(dǎo)作用。 電場(chǎng)的誘導(dǎo)作用包括電荷誘導(dǎo)偶極相互作用和偶極誘導(dǎo)偶極相互作用。短程力n短程力（short-range force）是原子或基團(tuán)接近到很短距離時(shí)明顯出現(xiàn)的作用力。n1、當(dāng)離子與分子接近時(shí)，相互間即逐漸產(chǎn)生靜電作用。n2、分子和分子間也可發(fā)生相互作用。這種相互作用可以發(fā)生在偶極與偶極

12、之間，偶極和誘導(dǎo)偶極之間及誘導(dǎo)偶極之間，這些作用力統(tǒng)稱(chēng)為范德華力。 氫鍵除共價(jià)鍵之外的最強(qiáng)的穩(wěn)定因素 氫鍵相對(duì)強(qiáng)度比較弱，一般在40kJ/mol以下，而共價(jià)鍵一般都是數(shù)百kJ/mol。單個(gè)氫鍵很容易被熱擾動(dòng)所破壞，但它們數(shù)量很大，故在穩(wěn)定水結(jié)構(gòu)和蛋白、核酸結(jié)構(gòu)方面都有極其重要的意義。氫鍵的本質(zhì)n電荷相互作用n電負(fù)性 : X, Y電負(fù)性要求大nX-H: 氫的給體nY: 氫受體YHXH2O既是給體又是受體氫鍵可在分子內(nèi)形成 （分子內(nèi)氫鍵）范德華力 早在1873年，Van der Waals就注意到在物質(zhì)的聚集態(tài)中，分子間存在一種遠(yuǎn)比化學(xué)鍵弱的吸引力，這種引力是導(dǎo)致實(shí)際氣體不完全符合理想氣體定律的原

13、因之一，后人因此把分子間的引力稱(chēng)為范德華力。 廣義的范德華力：偶極相互作用 (Keesom力)、誘導(dǎo)相互作用(Debye力)、色散相互作用 狹義的范德華力：色散相互作用(London力) 兩個(gè)非極性分子之間也存在相互的吸引，這種吸引主要是色散相互作用。 一個(gè)非極性分子沒(méi)有永久偶極矩，但由于電子的運(yùn)動(dòng)，他可以有一個(gè)瞬時(shí)非零的偶極矩，但在測(cè)量的時(shí)間間隔內(nèi)平均偶極矩為零。這種瞬時(shí)偶極矩誘導(dǎo)相鄰分子產(chǎn)生誘導(dǎo)偶極矩，從而在分子間產(chǎn)生相互吸引。 London推出，兩分子間色散相互作用的近似表達(dá)式： I1, I2為兩個(gè)分子的電離能，1, 2為兩個(gè)分子的極化率誘導(dǎo)偶極-誘導(dǎo)偶極6212121r23IIIIU色

14、散力一般比較弱，但在非極性分子間，這種相互作用占主導(dǎo)地位。以下兩個(gè)效應(yīng)可以使色散相互作用得到加強(qiáng)： 累加效應(yīng)：一個(gè)分子可以有多個(gè)瞬時(shí)偶極矩，他們都可以誘導(dǎo)另一個(gè)分子產(chǎn)生一個(gè)偶極矩，總的相互作用是一種累加效應(yīng)。1. 位相效應(yīng)：當(dāng)兩個(gè)分子相同時(shí)，具有相同的固有頻率，故瞬時(shí)偶極矩能夠精確的同位相，從而產(chǎn)生最大的相互作用。即，色散相互作用傾向于把類(lèi)似的分子拉到一起，產(chǎn)生穩(wěn)定由相同亞單位組成的大分子。弱相互作用的生物學(xué)意義 維持大分子的空間結(jié)構(gòu)與細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu) 在分子識(shí)別過(guò)程中有重要意義3.1.4 水結(jié)構(gòu)與水化作用水的結(jié)構(gòu)單個(gè)水分子的四面體結(jié)構(gòu)單個(gè)水分子的四面體結(jié)構(gòu)中心水分子與周?chē)膫€(gè)水分子的空間關(guān)系中心

15、水分子與周?chē)膫€(gè)水分子的空間關(guān)系鹽溶于水后發(fā)生了明顯的物理變化。n CaCl2溶于水后，鹽溶液的比熱比水小n NaCl溶于水后，總體積縮小體現(xiàn)了溶液的非理想性包括極性基團(tuán)的水化作用原因：破壞了水的結(jié)構(gòu)，兩個(gè)現(xiàn)象都可解釋離子的水化作用離子的水化作用n水化作用（hydration）是物質(zhì)與水發(fā)生化合的反應(yīng)，又稱(chēng)水合作用，一般指分子或離子的水合作用。其中當(dāng)鹽類(lèi)溶于水中生成電解質(zhì)溶液時(shí)，離子的靜電力破壞了原來(lái)的水結(jié)構(gòu)，在其周?chē)纬梢欢ǖ乃肿訉?，稱(chēng)為水化。 離子水化模型n根據(jù)X射線(xiàn)衍射分析，液態(tài)水是微觀晶體，在短程和短時(shí)間內(nèi)具有與冰相似的結(jié)構(gòu)，即1個(gè)中心水分子周?chē)?個(gè)水分子占在四面體的頂角包圍著它，

16、四面體結(jié)構(gòu)是通過(guò)氫鍵形成的。5個(gè)水分子沒(méi)有占滿(mǎn)四面體的全部體積，是一個(gè)敞開(kāi)式的松弛結(jié)構(gòu)。離子溶入水中后，離子周?chē)嬖谥粋€(gè)對(duì)水分子有明顯作用的空間，當(dāng)水分子與離子間相互作用能大于水分子與水分子間的氫鍵能時(shí)，水的結(jié)構(gòu)就遭到破壞，在離子周?chē)纬伤ぁ＞o靠離子的第一層水分子定向地與離子牢固結(jié)合，與離子一起移動(dòng)，不受溫度變化的影響。第一層以外的水分子也受到離子的吸引作用，使水的原有結(jié)構(gòu)遭到敗壞，但由于距離稍遠(yuǎn)，吸引較弱，與離子聯(lián)系較松。 nI區(qū)：初級(jí)水化層，區(qū)：初級(jí)水化層，水分水分子與離子有直接靜電相互子與離子有直接靜電相互作用，作用，與離子結(jié)合在一起與離子結(jié)合在一起作整體移動(dòng)，數(shù)目取決于作整體移動(dòng)

17、，數(shù)目取決于陽(yáng)離子種類(lèi)。陽(yáng)離子種類(lèi)。nII區(qū)：區(qū)：中間層原來(lái)的水結(jié)中間層原來(lái)的水結(jié)構(gòu)遭到破壞，水結(jié)構(gòu)的有構(gòu)遭到破壞，水結(jié)構(gòu)的有序取向趨勢(shì)與離子輻射狀序取向趨勢(shì)與離子輻射狀的電場(chǎng)作用相互競(jìng)爭(zhēng)。的電場(chǎng)作用相互競(jìng)爭(zhēng)。無(wú)無(wú)結(jié)構(gòu)水，結(jié)構(gòu)程度最小，結(jié)構(gòu)水，結(jié)構(gòu)程度最小，熵最大。熵最大。nIII區(qū)：體積水（容積水），區(qū)：體積水（容積水），正常的微晶結(jié)構(gòu)水。正常的微晶結(jié)構(gòu)水。n離子水化作用產(chǎn)生兩種影響，一是離子水化作用減少溶液“自由”水分子的數(shù)量，增加離子體積，因而改變電解質(zhì)溶液中電解質(zhì)的活度系數(shù)和電導(dǎo)性質(zhì)。這是溶劑對(duì)溶質(zhì)的影響；二是離子水化往往破壞附近水層中的正四面體結(jié)構(gòu)。降低離子鄰近水分子層的相對(duì)介電常數(shù)

18、，這是溶質(zhì)對(duì)溶劑的影響。 像蛋白質(zhì)這類(lèi)生物大分子，除了其主鏈有一定的偶極矩外，側(cè)鏈也有極性或離子基團(tuán)，因而水分子必然與其有相互作用而影響生物大分子的構(gòu)象和功能。n極性基團(tuán)暴露在水中，就會(huì)發(fā)生象離子那樣的水化作用；n非極性基團(tuán)暴露在水中，會(huì)發(fā)生疏水化作用。疏水相互作用籠形結(jié)構(gòu) 如果蛋白質(zhì)側(cè)鏈的一個(gè)離子基團(tuán)暴露在水中，可以預(yù)期，在該局部會(huì)產(chǎn)生如無(wú)機(jī)離子那樣的水合作用；相反如果一個(gè)疏水基團(tuán)從蛋白質(zhì)表面伸出，它會(huì)使周?chē)莘e水的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生空缺，形成籠狀結(jié)構(gòu)。側(cè)鏈中的離子（或極性）基團(tuán)與其它疏水鍵的距離會(huì)對(duì)水結(jié)構(gòu)有不同影響。 由于蛋白質(zhì)的疏水鍵和極性鍵與水有相反的作用，所以一般而言，蛋白質(zhì)在水中形成高級(jí)結(jié)構(gòu)

19、時(shí)，總是盡可能地把疏水側(cè)鏈卷縮到其內(nèi)部，而有離子化或偶極子的側(cè)鏈伸展到水溶液中。 但是由于蛋白質(zhì)構(gòu)象內(nèi)部仍會(huì)有極性基團(tuán)發(fā)生某種程度的離子化，因而在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)內(nèi)部也會(huì)有少量的水分子與這些基團(tuán)相絡(luò)合。 水結(jié)構(gòu)的生物學(xué)意義：與蛋白質(zhì)的功能的關(guān)系與蛋白質(zhì)的功能的關(guān)系蛋白質(zhì)的疏水側(cè)鏈一般位于蛋白質(zhì)分子內(nèi)部，而極性或偶極性側(cè)鏈在外，能和水相互結(jié)合，有時(shí)甚至結(jié)合得很緊密，以致這一層結(jié)合的水和蛋白質(zhì)分子成為一個(gè)整體，進(jìn)而影響蛋白質(zhì)的功能。疏水物質(zhì)的籠形結(jié)構(gòu)與生物學(xué)功能疏水物質(zhì)的籠形結(jié)構(gòu)與生物學(xué)功能一些化學(xué)不活潑物質(zhì)（如氯仿CHCl3，氧化亞氮N2O、二氧化碳CO2、環(huán)丙烷C3H6、氙Xe、氬Ar等）麻醉作用機(jī)

20、理的研究。機(jī)理：進(jìn)入體內(nèi)溶液中的這類(lèi)物質(zhì)能使其周?chē)乃肿有纬苫\狀結(jié)構(gòu)，這種水結(jié)構(gòu)是晶態(tài)的，它會(huì)阻礙神經(jīng)細(xì)胞膜對(duì)離子的通透。 腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞的差異3.2 生物分子間的相互作用ProteinDNARNAOthers The interaction of biomacromolecules is the fundamental basis of any cellular functionProteinothersDNARNAInteraction3.2.1 蛋白質(zhì)分子的相互作用n蛋白質(zhì)分子之間發(fā)生的相互作用對(duì)其發(fā)揮生物學(xué)功能具有非常重要的作用，如：n抗原與抗體結(jié)合免疫反應(yīng)n肌球蛋白與肌動(dòng)蛋白相

21、對(duì)滑動(dòng)肌肉收縮n配體（多肽激素）與受體結(jié)合生理效應(yīng)n蛋白抑制劑與酶結(jié)合抑制酶活性n分子聚合（有功能蛋白質(zhì)）n分子識(shí)別（抗原抗體、配體受體、酶底物）n分子裝配（病毒）n多酶復(fù)合體n蛋白質(zhì)復(fù)合物（細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路）單體胰島素形成二聚體單體胰島素形成二聚體血液凝固血液凝固 血纖維蛋白聚合血纖維蛋白聚合抗原抗體間的識(shí)別抗原抗體間的識(shí)別煙草花葉病毒（煙草花葉病毒（TMV）的自我裝配）的自我裝配丙酮酸脫氫酶復(fù)合體丙酮酸脫氫酶復(fù)合體膜配體與受體的作用膜配體與受體的作用ligandreceptor酪氨酸激酶酪氨酸激酶3.2.2 蛋白質(zhì)相互作用的研究方法nTagged Fusion Proteins (Pull

22、-down) 沉降實(shí)驗(yàn)nCo-immunoprecipitation (Co-IP) 免疫共沉淀nFluorescence Resonace Energy Trasfer (FRET) 熒光共振能量轉(zhuǎn)移nBiacore (Surface Plasmon Resonance, SPR) 表面等離子共振 nYeast Two-hybrid (Y2H) 酵母雙雜交熒光共振轉(zhuǎn)移技術(shù)熒光共振轉(zhuǎn)移技術(shù)表面等離子共振技術(shù)表面等離子共振技術(shù)噬菌體展示技術(shù)噬菌體展示技術(shù)酵母雙雜交技術(shù)酵母雙雜交技術(shù)基因外抑制子基因外抑制子合成致死篩選合成致死篩選分子生物學(xué)方法分子生物學(xué)方法免疫共沉淀免疫共沉淀Pull down

23、試驗(yàn)試驗(yàn)遺傳學(xué)方法遺傳學(xué)方法蛋白質(zhì)相互作用研究方法蛋白質(zhì)相互作用研究方法生物物理學(xué)方法生物物理學(xué)方法融合蛋白沉降實(shí)驗(yàn) 融合蛋白沉降實(shí)驗(yàn)基本原理是將一種蛋白質(zhì)固定于某種基質(zhì)上（如Sepharose），當(dāng)細(xì)胞抽提液經(jīng)過(guò)該基質(zhì)時(shí)，可與該固定蛋白相互作用的配體蛋白被吸附，而沒(méi)有被吸附的“雜質(zhì)”則隨洗脫液流出。被吸附的蛋白可以通過(guò)改變洗脫液或洗脫條件而回收下來(lái)。 為了更有效地利用pull-down技術(shù)，可以將待純化的蛋白以融合蛋白地形式表達(dá)，即將“誘餌”蛋白與一種易于純化的配體蛋白相融合。1988年Smith等利用谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶（glutathione-S-transferase, GST）融合標(biāo)簽從

24、細(xì)菌中一步純化出GST融合蛋白。從此GST融合蛋白在蛋白質(zhì)相互作用研究領(lǐng)域里得到極大的推廣。 GST融合蛋白在經(jīng)過(guò)固定有GST(glutathione)的色譜柱時(shí)，就可以通過(guò)GST 與GSH的相互作用而被吸附。當(dāng)再有細(xì)胞抽提物過(guò)柱，就可得到能夠與“誘餌”蛋白相互作用的興趣蛋白。 一般來(lái)說(shuō)GST融合蛋白pull-down方法用于兩個(gè)方面： 一、鑒定與已知融合蛋白相互作用的未知蛋白質(zhì) 二、鑒定兩個(gè)已知蛋白質(zhì)之間是否存在相互作用Pull-downGST pull-down, His pull-down免疫共沉淀 非變性裂解完整細(xì)胞時(shí)，胞內(nèi)許多蛋白質(zhì)間的結(jié)合狀態(tài)可以保持下來(lái)。如果蛋白質(zhì)X用其抗體免疫沉

25、淀，則在細(xì)胞內(nèi)與X穩(wěn)定結(jié)合的蛋白質(zhì)Y也能沉淀下來(lái)。 蛋白質(zhì)Y的沉淀是基于與X的物理性相互作用，被稱(chēng)為免疫共沉淀。 該技術(shù)在實(shí)際應(yīng)用中常用融合表達(dá)的帶有蛋白標(biāo)簽的特異性抗體與目標(biāo)蛋白質(zhì)或蛋白復(fù)合物結(jié)合，形成蛋白復(fù)合物沉淀。將蛋白質(zhì)復(fù)合物溶解，再通過(guò)對(duì)蛋白標(biāo)簽具有特異吸附作用的親和色譜柱將蛋白復(fù)合物分離純化出來(lái)，進(jìn)而通過(guò)凝膠電泳或質(zhì)譜等技術(shù)鑒定分離的蛋白。 免疫共沉淀法常用來(lái)確定生理?xiàng)l件下目的蛋白在細(xì)胞或組織內(nèi)是否存在與其相互作用的蛋白質(zhì)。 該方法的優(yōu)點(diǎn)是，所研究的相互作用蛋白均是經(jīng)翻譯后修飾的天然蛋白，可以表征生理?xiàng)l件下蛋白質(zhì)間的相互作用。 但該方法需首先針對(duì)目標(biāo)蛋白，制備出一定量的多克隆或單克

26、隆抗體，過(guò)程相對(duì)復(fù)雜。同時(shí)，目的蛋白質(zhì)只有達(dá)到一定濃度才能與抗體結(jié)合形成沉淀，因而該法只適用于研究具有高表達(dá)量的目標(biāo)蛋白，而且可能檢測(cè)不到低親和力和瞬間的蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互作用，應(yīng)用范圍有較大局限。Co-Immunoprecipitation熒光共振能量轉(zhuǎn)移( Fluorescence resonance energy transfer, FRET) 熒光共振能量轉(zhuǎn)移是近年來(lái)迅速發(fā)展的一種新技術(shù)，其最大的特點(diǎn)就是可以在活體細(xì)胞生理?xiàng)l件下對(duì)蛋白質(zhì)間的相互作用進(jìn)行實(shí)時(shí)的動(dòng)態(tài)研究，已成為現(xiàn)代蛋白質(zhì)組學(xué)研究的有力工具。 一對(duì)合適的熒光物質(zhì)構(gòu)成一個(gè)能量供受體對(duì)時(shí)，能量在它們之間可以發(fā)生轉(zhuǎn)移。 1948 年

27、Frster提出的這一熒光共振能量轉(zhuǎn)移理論奠定了FRET技術(shù)的理論基礎(chǔ)。 1992 年，Prasher等首次從維多利亞水母中分離并克隆了一種熒光物質(zhì)綠色熒光蛋白( green fluorescent protein, GFP) 。 隨后，Heim等通過(guò)點(diǎn)突變等方式，得到了多種熒光光譜不同的熒光蛋白，如藍(lán)色熒光蛋白( blue fluorescence protein, BFP) ，黃色熒光蛋白( yellow fluorescence protein, YFP) 和藍(lán)綠色熒光蛋白( cyan fluorescence protein, CFP ) 等，提供了大量的能量供受體，為FRET技術(shù)提供

28、了現(xiàn)實(shí)基礎(chǔ)。 目前FRET技術(shù)中常用的熒光蛋白對(duì)是YFP和CFP，當(dāng)與熒光基團(tuán)融合的被研究蛋白發(fā)相互作用時(shí)，熒光基團(tuán)在空間上靠近，發(fā)生能量轉(zhuǎn)移，通過(guò)檢測(cè)供受體分子發(fā)射程度比率的變化就可得知蛋白質(zhì)結(jié)合程度的強(qiáng)弱。 目前，F(xiàn)RET技術(shù)已在檢測(cè)酶活性變化、膜蛋白的研究、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞周期調(diào)控等研究中發(fā)揮了重要作用。 熒光信號(hào)的產(chǎn)生 熒光基團(tuán)在某波長(zhǎng)的激發(fā)光刺激下，產(chǎn)生一個(gè)更長(zhǎng)波長(zhǎng)的發(fā)射光。2. 什么是FRET? 當(dāng)某個(gè)熒光基團(tuán)的發(fā)射譜與另一熒光基團(tuán)的吸收光譜發(fā)生重疊，且兩個(gè)基團(tuán)距離足夠近時(shí)，能量可以從短波長(zhǎng)（高能量）的熒光基團(tuán)傳遞到長(zhǎng)波長(zhǎng)（低能量）的熒光基團(tuán)，這個(gè)過(guò)程稱(chēng)為熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）

29、，實(shí)際相當(dāng)于將短波長(zhǎng)熒光基團(tuán)釋放的熒光屏蔽。nThe donor emission spectrum must significantly overlap the excitation spectrum of the acceptor 供體發(fā)射波與受體激發(fā)波有重疊nThe donor and acceptor fluorophores must be in favorable mutual orientation 合適的空間取向nThe distance between the donor and acceptor fluorophores must be less than 100 距離10

30、0 FRET: basic requirements3. 綠色熒光蛋白 60年代，Shimomura等首先從水母（Aequoria Victoria ）中分離出一種水母發(fā)光蛋白（aequoren），該蛋白與鈣和腸腔素結(jié)合后可產(chǎn)生藍(lán)色熒光。然而水母中提取的顆粒都呈綠色，后經(jīng)證實(shí)在水母體內(nèi)還存在另外一種發(fā)光蛋白即綠色熒光蛋白 GFP，后經(jīng)研究表明，在水母體內(nèi)Ca2+和腸腔素與水母發(fā)光蛋白結(jié)合后，水母發(fā)光蛋白產(chǎn)生藍(lán)色熒光，GFP在藍(lán)光的激發(fā)下，產(chǎn)生綠色熒光 。Osamu Shimomura Osamu Shimomura in the lab in the basement of his home.

31、 He is holding a sample of “real” GFP isolated from Aequorea victorea, not produced by bacteria. In order to do his research Shimomura estimates that he collected over a million Aequorea specimens。 （One Aequorea weigh about 50g）William Ward (right) met Douglas Prasher on a jellyfish-hunting expediti

32、on in the 1980s Douglas Prasher was the first person to realize the potential of GFP as a tracer molecule.GFP could be used to report when a protein was being made in a cell.GFP could potentially be a very useful reporter molecule. 容易檢測(cè)分子量小 不需要其它底物Douglas Prasher 1992 年克隆年克隆了了GFP基因基因Chalfie 將GFP基因轉(zhuǎn)入

33、大腸桿菌中。Sergey A. Lukyanov 在珊瑚中發(fā)現(xiàn)了類(lèi)似GFP的蛋白。他還發(fā)現(xiàn)了紅色熒光蛋白。 Roger Tsien 對(duì)對(duì)GFP的機(jī)理作的機(jī)理作出了貢獻(xiàn)。制造出了貢獻(xiàn)。制造了很多了很多GFP突變突變體。體。2008年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng) 人們?cè)贕FP基因的基礎(chǔ)上已經(jīng)制造出藍(lán)色熒光蛋白，黃色熒光蛋白，青色熒光蛋白，又發(fā)現(xiàn)了紅色熒光蛋白。其中藍(lán)色熒光蛋白和綠色熒光蛋白，青色熒光蛋白和黃色熒光蛋白之間可以發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移。GFP and other FPs (fluorescent proteins)Detecting methodsnMonitor changes in donor fl

34、uorescence 檢測(cè)供體熒光nMonitor changes in acceptor fluorescence 檢測(cè)受體熒光nSimultaneously measure changes in both donor and acceptor fluorescence using spectral imaging 同時(shí)檢測(cè)受體和供體熒光表面等離子共振( Surface plasmon resonance, SPR) 表面等離子共振是數(shù)理科學(xué)與生物學(xué)相互滲透、結(jié)合而產(chǎn)生的一種全新的研究生物大分子之間相互作用的方法，近幾年在生物技術(shù)領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。 表面等離子共振( Surface plasmon resonance, SPR)是一種物理光學(xué)現(xiàn)象，當(dāng)一束平面單色偏振光以一定角度入射到鍍?cè)诓ＡП砻娴谋咏饘倌ど习l(fā)生全反射時(shí)，若入射光的波向量與金屬膜內(nèi)表面電子的振蕩頻率相一致，光線(xiàn)即被耦合入金屬膜引發(fā)電子共振，即表面等離子共振。由于共振的產(chǎn)生，導(dǎo)致反射光的強(qiáng)度在某一特定的角度大大減弱，反射光消失的角度稱(chēng)為共振角( SPR angle) ，共振角隨金屬表面折射率的變化而變化，而折射率的變化又與金屬表面結(jié)合物的分子質(zhì)量成正比。 在