第10章基因診斷GenediagnosisChinaMedi

1、p480 傳統(tǒng)的診斷：表現(xiàn)型傳統(tǒng)的診斷：表現(xiàn)型基因型基因型 基基 因因 診診 斷：基因型斷：基因型表現(xiàn)型表現(xiàn)型 （ 逆向診斷）逆向診斷）基因診斷的特征：基因診斷的特征：1 不受材料來源影響不受材料來源影響 外周血、活體穿刺組織、孕婦外周血、血斑等外周血、活體穿刺組織、孕婦外周血、血斑等2 癥狀前診斷癥狀前診斷 尤其對(duì)于一些延遲顯性疾病如尤其對(duì)于一些延遲顯性疾病如huntingtong舞蹈病舞蹈病3 產(chǎn)前診斷產(chǎn)前診斷 避免患兒出生，提高人口質(zhì)量避免患兒出生，提高人口質(zhì)量第一節(jié)第一節(jié) 基基 因因 診診 斷斷 技技 術(shù)術(shù)southern印跡雜交印跡雜交基基 因因 診診 斷斷 技技 術(shù)術(shù)norther

2、n印跡雜交印跡雜交基基 因因 診診 斷斷 技技 術(shù)術(shù)斑斑 點(diǎn)點(diǎn) 雜雜 交交點(diǎn)樣點(diǎn)樣probe-32p檢測(cè)檢測(cè)ab1 2 3 4基基 因因 診診 斷斷 技技 術(shù)術(shù)熒光原位雜交熒光原位雜交基基 因因 診診 斷斷 技技 術(shù)術(shù)熒光原位雜交熒光原位雜交基基 因因 診診 斷斷 技技 術(shù)術(shù)聚合酶鏈反應(yīng)聚合酶鏈反應(yīng)基基 因因 診診 斷斷 技技 術(shù)術(shù)聚合酶鏈反應(yīng)聚合酶鏈反應(yīng)基基 因因 診診 斷斷 技技 術(shù)術(shù) 多重多重pcr在一個(gè)在一個(gè)pcr體系中加入數(shù)對(duì)體系中加入數(shù)對(duì)pcr引物，覆蓋區(qū)域不重疊引物，覆蓋區(qū)域不重疊用于檢測(cè)同一基因多個(gè)外顯子的缺失用于檢測(cè)同一基因多個(gè)外顯子的缺失e1 e2 e3基基 因因 診診 斷

3、斷 技技 術(shù)術(shù) rt-pcr以以mrna為模板，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄酶合成為模板，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄酶合成cdna用于研究基因表達(dá)用于研究基因表達(dá)使微量使微量mrna迅速擴(kuò)增，提高迅速擴(kuò)增，提高mrna檢出的靈敏度檢出的靈敏度基基 因因 診診 斷斷 技技 術(shù)術(shù) pcr-sscp（single strand conformation polymorphism）單鏈單鏈dna由于堿基序列不同可引起構(gòu)象差異，這種由于堿基序列不同可引起構(gòu)象差異，這種差異將造成相同或相近長(zhǎng)度的單鏈差異將造成相同或相近長(zhǎng)度的單鏈dna電泳遷移率電泳遷移率的不同。據(jù)此，可用于的不同。據(jù)此，可用于dna中單個(gè)堿基的替代、微中單個(gè)堿基的替代、微小的

4、缺失或插入的檢測(cè)。小的缺失或插入的檢測(cè)?；?因因 診診 斷斷 技技 術(shù)術(shù) - primer - 32p-dntp摻入摻入 pcr擴(kuò)增擴(kuò)增 產(chǎn)物產(chǎn)物 變性變性 單鏈單鏈dna 中性聚丙烯酰胺凝膠電泳中性聚丙烯酰胺凝膠電泳 1 2 3 4 5 自顯影自顯影 1為正常為正常 結(jié)果分析結(jié)果分析 2、4、5為純合患者為純合患者 3為雜合子為雜合子 . 基基 因因 診診 斷斷 技技 術(shù)術(shù)生生 物物 芯芯 片片第二節(jié)第二節(jié) 基基 因因 診診 斷斷 方方 法及法及實(shí)例實(shí)例直接診斷直接診斷直接直接檢測(cè)致病基因的突變檢測(cè)致病基因的突變 基因突變類型基因突變類型缺失、點(diǎn)突變、重復(fù)、插入等缺失、點(diǎn)突變、重復(fù)、插入等

5、間接診斷間接診斷應(yīng)用應(yīng)用dna多態(tài)為遺傳標(biāo)記進(jìn)行連鎖多態(tài)為遺傳標(biāo)記進(jìn)行連鎖 分析，確定待測(cè)者是否得到帶有致病的染色體，分析，確定待測(cè)者是否得到帶有致病的染色體，從而從而間接間接地作出診斷地作出診斷 dna多態(tài)多態(tài)rflp、vntr、snpallele ii12kb8kb4kbprobe12kb8kb rflpsouthern blot檢測(cè)結(jié)果檢測(cè)結(jié)果 大小三三)單核苷酸多態(tài)性（單核苷酸多態(tài)性（snp）（single nucleiotide polymorphism）snp：發(fā)生在基因組中的單個(gè)核苷酸的替代：發(fā)生在基因組中的單個(gè)核苷酸的替代根據(jù)根據(jù)snp在基因中的位置，分為：在基因中的位置，分為

6、： 基因編碼區(qū)基因編碼區(qū)snp 基因周邊基因周邊snp 基因間基因間snp在人類基因組中每在人類基因組中每100300個(gè)核苷酸就有一個(gè)個(gè)核苷酸就有一個(gè)snp二、基診斷方法及實(shí)例二、基診斷方法及實(shí)例 直接檢測(cè)致病基因本身的異常。通常使用基因直接檢測(cè)致病基因本身的異常。通常使用基因本身或本身或鄰近鄰近dna序列序列作為探針，進(jìn)行作為探針，進(jìn)行southern 雜交雜交，或通過，或通過pcr 擴(kuò)增產(chǎn)物擴(kuò)增產(chǎn)物，以檢測(cè)基因點(diǎn)突變、缺失、插入等異常，以檢測(cè)基因點(diǎn)突變、缺失、插入等異常及性質(zhì)。主要適用于已知基因異常疾病的診斷。及性質(zhì)。主要適用于已知基因異常疾病的診斷。直接直接基因診斷及實(shí)例基因診斷及實(shí)例直

7、接基因診斷直接基因診斷 直接直接等位基因特異性寡核苷酸探針（等位基因特異性寡核苷酸探針（aso）（allele-specific-oligonucleotide ）斑點(diǎn)雜交結(jié)果：斑點(diǎn)雜交結(jié)果：突變突變直接直接突變突變直接直接bamhibamhi 2 2 1 1 2 2 10 kb14 kbprobe 1） 地中海貧血的基因診斷地中海貧血的基因診斷 基因不同程度的缺失可引基因不同程度的缺失可引起不同類型的起不同類型的 地中海貧血。地中海貧血。直接基因診斷直接基因診斷 缺失缺失直接直接southern blot 檢測(cè)結(jié)果：檢測(cè)結(jié)果： / /- /- - - /- - - - / - - 正常正常

8、缺缺1 缺缺2 缺缺3 缺缺414kb10kb缺失缺失直接直接pst1pst1pst1缺失缺失直接直接4.4kb3.7kb缺失缺失直接直接3） dmd的基因診斷的基因診斷dmd屬屬xrdmd基因是最大的基因，有基因是最大的基因，有79個(gè)外顯子個(gè)外顯子dmd基因突變主要以基因突變主要以缺失缺失為主，可涉及基因的不同部位為主，可涉及基因的不同部位e1 e2 e3缺失缺失直接直接病例外顯子 1 2 3 4 5 6 7 8pm34350136476052bp535113缺失缺失直接直接二）間接基因診斷方法及實(shí)例二）間接基因診斷方法及實(shí)例 當(dāng)當(dāng)致病基因致病基因雖然已知，但其雖然已知，但其異常性質(zhì)未知異常

9、性質(zhì)未知時(shí)，時(shí)，或疾病或疾病genegene本身尚未知本身尚未知時(shí)，主要通過時(shí)，主要通過genegene和和dnadna多態(tài)的連鎖分析多態(tài)的連鎖分析間接地間接地作出診斷。作出診斷。 連鎖分析基于連鎖分析基于遺傳標(biāo)記遺傳標(biāo)記與與gene在染色體上連在染色體上連鎖，鎖， 通過對(duì)受檢者及其家系進(jìn)行連鎖分析，分析通過對(duì)受檢者及其家系進(jìn)行連鎖分析，分析子代獲得某種子代獲得某種遺傳標(biāo)記遺傳標(biāo)記與與疾病疾病的關(guān)系，間接推斷受的關(guān)系，間接推斷受檢檢子代是否獲得帶有致病基因的染色體子代是否獲得帶有致病基因的染色體，間接地判，間接地判斷并做出診斷。斷并做出診斷。 遺傳標(biāo)記是基因組中的遺傳標(biāo)記是基因組中的dna 多

10、態(tài)多態(tài) 如：如：rflp，vntr 等。等。間接基因診斷間接基因診斷遺傳標(biāo)記相關(guān)基因表型分析間接基因診斷間接基因診斷 pah基因兩側(cè)基因兩側(cè)有有msp1酶切酶切位點(diǎn)位點(diǎn),用該酶用該酶消化可產(chǎn)生消化可產(chǎn)生23kb、19kb 兩種等位片段，兩種等位片段，以以pahcdna為探針與為探針與pku家系成員外周家系成員外周血血dna雜交。雜交。間接基因診斷間接基因診斷l(xiāng)ii2為為間接基因診斷間接基因診斷間接基因診斷間接基因診斷 以以3hvr為探針，與為探針，與pvuii酶切后的家系有關(guān)成酶切后的家系有關(guān)成員的基因組員的基因組dna進(jìn)行進(jìn)行southern blot 基因組基因組dnapvuii酶切酶切d

11、na片段片段變性變性轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)膜探針探針變性變性雜交雜交結(jié)果分析結(jié)果分析間接基因診斷間接基因診斷 1 2 1 2 3 4 5 5.7kb 3.4kb 2.3kb 間接基因診斷間接基因診斷結(jié)果分析結(jié)果分析 患者（患者（i1、ii1和和ii2）有）有3.4kb片段，片段，說明致病基因與說明致病基因與3.4kb片段連鎖，并按孟片段連鎖，并按孟德爾方式遺傳。德爾方式遺傳。ii5不含不含3.4kb片段，產(chǎn)前片段，產(chǎn)前診斷正常。診斷正常。間接基因診斷間接基因診斷3 甲型血友病甲型血友病診斷（診斷（pcrrflp）甲型血友病的基因診斷：已知甲型血友病xr，獲得家系成員基因組dna 。p1p2142bp99bp4

12、3bpbcl ibcl i -bcl i +間接基因診斷間接基因診斷間接基因診斷間接基因診斷 142bp99bp1 2123iii 1間接基因診斷間接基因診斷間接基因診斷間接基因診斷單體型分析單體型分析l有時(shí)用一種酶和一個(gè)探針不能提供可供分有時(shí)用一種酶和一個(gè)探針不能提供可供分析的信息，需采用一種以上的酶結(jié)合幾個(gè)析的信息，需采用一種以上的酶結(jié)合幾個(gè)基因探針雜交分析基因探針雜交分析。l根據(jù)同一條染色體上限制性位點(diǎn)的丟失或根據(jù)同一條染色體上限制性位點(diǎn)的丟失或獲得而出現(xiàn)的獲得而出現(xiàn)的一組一組多態(tài)位點(diǎn)所構(gòu)成的多態(tài)位點(diǎn)所構(gòu)成的不同不同片段長(zhǎng)度的組合類型片段長(zhǎng)度的組合類型進(jìn)行分析，該分析方進(jìn)行分析，該分析方法稱法稱單體型分析單體型分析（haplotyping)間接基因診斷間接基因診斷 舉例：舉例：pku家系家系hind 酶切：酶