5-DNA replication,mutation,injury and repair-2

1、第一節(jié) DNA的復制一、DNA復制的一般特征二、原核生物的DNA復制三、真核生物DNA復制四、線粒體DNA復制五、噬菌體和病毒DNA的復制第四章 DNA的復制、突變、損傷和修復（一）單鏈環(huán)狀DNA的復制過程單鏈環(huán)狀DNA以滾環(huán)復制方式進行，如大腸桿菌噬菌體X174、M13、G等?，F(xiàn)以X174為例說明。1. 第一階段：單鏈環(huán)狀DNA以親本鏈（正鏈）為模板合成互補的環(huán)狀負鏈，形成閉合的環(huán)狀復制型（RF1）。RF1合成的引發(fā)首先由單鏈結合蛋白（SSB）結合到單鏈環(huán)上。基因FT TT AT AA.TA.TA.TA.TA.TG.CG.CG.CG.CG.CA.TA GG AC.GC.GC.GC.GA.TA

2、.T5TGATAAAAGATTCACTCTCACCTTATA.TGA.TTTTCTGCTTAGGAGTTTAATCATCTTTCAGACTTT3A CA GG.CG.CG.CA.TA AG.CG.CG基因GX174 pas發(fā)夾結構在F和G基因之間有一個不完整的回文結構（palindromes），形成兩個發(fā)夾結構，此部分不與SSB結合。此結構稱為pas site，即引發(fā)體組裝位點（primosome assembly site），此結構與五種蛋白（priA，priB，DnaT，DnaB，DnaC）結合形成引發(fā)體。2. 第二階段：通過成環(huán)滾環(huán)復制（looping rolling replicati

3、on）產(chǎn)生多個子代復制型（RF）。首先， 由噬菌體A基因編碼的A蛋白（gpA）識別并結合到環(huán)狀雙螺旋DNA正鏈的復制原點，打開一個缺口，產(chǎn)生復制型（RF ），然后gpA的酪氨酸殘基與5端核苷酸共價連接，保留磷酸二酯鍵打開釋放的能量，接著，gpA，DNA螺旋酶和SSB共同參與DNA雙螺旋解旋，形成復制叉。gpA使打開的正鏈5端形成環(huán)（loop），由大腸桿菌的DNA聚合酶以“”鏈為模板，在打開的正鏈3端合成一條不斷循環(huán)的的正鏈，即為“滾環(huán)復制”（rolling circle replication）。（二）線狀DNA的復制過程1. 雙鏈線狀DNA復制起始 線狀DNA復制起始有兩種類型：一種是從DN

4、A中間開始，如T7，另一種是從末端起始如腺病毒。T7噬菌體的復制起始：T7有39936bp，41個基因。有三個啟動子PI、P、P，其中P起復制作用。T7的復制起始區(qū)位于基因1和基因1.1之間。T7DNA兩端有“末端冗余”，還有一個基因4產(chǎn)物的識別位點3CTGGG5。 T7復制起始必需三個酶： T7 RNA聚合酶，T7 DNA聚合酶，基因4蛋白（gene product 4，gp4）。 T7 RNA聚合酶（gp1）是基因1產(chǎn)物，是基因1.1直到最末尾的基因轉錄所不可缺少的。 基因4產(chǎn)物是多功能酶： 一是依賴單鏈DNA的核苷-5-三磷酸酯酶活性（dTTP酶活性最高）， 二是螺旋酶活性， 三是引發(fā)酶

5、活性。T7 DNA聚合酶由兩個亞基組成：一個是T7的基因5蛋白（gp5 ），分子量為84kDa，單獨存在時具有單鏈DNA35外切酶活性和進行下很低的聚合酶活性，聚合酶在催化1-50個脫氧核苷酸參入后即與模板脫離。另一個亞基是噬菌體誘導出來的寄主基因 trxA 編碼的硫氧還蛋白（thioredoxin），分子量為12kDa。兩個亞基結合后（1：1）成為具有很高進行性的DNA聚合酶，還具有單鏈、雙鏈DNA的3 5外切酶活性。腺病毒復制的起始腺病毒DNA為線性雙鏈，長度約3.6萬bp。每個腺病毒DNA在5末端都共價連接了一個55kDa的蛋白質(zhì)，稱末端蛋白質(zhì)（terminal protein），簡稱T

6、P。TP以絲氨酸羥基通過磷酸二酯鍵與5端的胞嘧啶共價連接。腺病毒兩端有反向末端重復序列，長度介于103-162bp。在兩末端各有50bp的區(qū)域為其兩個復制點其中一個C-G堿基對和第9-18堿基對完全保守核因子NF1的結合位點也高度保守頭25bp中有一段富含AT的區(qū)域，序列中AT占80%。保守序列NF1結合位點TP CATCATCAATAATATACCTTATTTTGGATTGAAGCCAATATGATAATGAG置換鏈 3 GTAGTAGTTATTATATGGAATAAAACCTAACTTCGGTTATACTATTACT C模板鏈腺病毒復制原點的序列起始過程：首先由寄主蛋白質(zhì)-核因子NF1與D

7、NA結合；在72KDa的腺病毒單鏈DNA結合蛋白（DBP）和ATP共同存在下由TP催化使末端解鏈；140KDa的腺病毒DNA聚合酶催化80KDa的TP前體蛋白8（pTP）中的絲氨酸殘基與dCTP5磷酸形成磷酸二酯鍵，反應除去一分子焦磷酸，形成pTP與dCMP的連接物； C與模板3端的G以氫鍵相結合形成起始復合物。dCMP游離的3-OH為DNA聚合酶延伸反應提供了引物復制起始復合體復制起始復合體 引發(fā)復制引發(fā)復制 （不需引物）（不需引物） 避免避免5-end shortent pTp-Ser-dCMP CG 過程過程 SSB + ATP DNA 末端解鏈末端解鏈 TP pTP-Ser + dCT

8、P pTP-Ser-dCMP 3 OH2. 線性DNA復制的終止：線性DNA復制完成后，面臨一個很嚴重的問題即當5端引物切除，因沒有3-OH的存在，無法將缺少的一段補起來。這稱5末端隱縮。T7噬菌體如何解決這一問題。T7噬菌體DNA兩端各有一段重復的數(shù)百個核苷酸稱為末端冗余（terminal redundancy），兩個子代分子中的單鏈末端可以互補。多余的單鏈部分可以被DNAase切去，然后再由DNA連接酶連接起來。1992年JD. Walson 提出了串聯(lián)體假說。?二聚體二聚體3-OHATCGTAGCATCGTAGC3-OHT7噬噬菌菌體體的的末末端端復復制制專一性核酸專一性核酸內(nèi)切酶內(nèi)切酶

9、3355335533553355互補的3端配對3535Pol I和連接酶封閉缺口35353553限制性酶交錯切割35353535Pol I 3端延伸完成復制3. 單鏈線狀DNA的復制嚙齒動物中的一種微小病毒（parvovirus），其基因組是一條單鏈線狀DNA。微小病毒一般含有4800bp，只編碼三個蛋白。轉錄和復制所需的蛋白和酶系統(tǒng)都利用宿主細胞。微小病毒單鏈DNA的兩端具有不同的反向重復順序，可形成發(fā)夾結構。RepCapITRITRssDNA; inverted terminal repeats (ITR); Rep gene required for DNA replication; C

10、ap gene encodes capsid proteins(-)35abcdabfeghfeabcdab53e f ghfe efghf eabcdba(-)(-)(+)(+)(-)3553 abcdbae f ghfe efghf e(-)(+)abcdab53e f ghfe efghf e(-)(+)abcdba efghf e(+)feghfe(-)(-)(+)(三）逆轉錄病毒1. 逆轉錄病毒的復制： 逆轉錄病毒即RNA病毒，需在逆轉錄酶的作用下首先將RNA轉變?yōu)閏DNA，再在DNA復制、轉錄、翻譯等蛋白酶作用下擴增的一類病毒。逆轉錄病毒有三個基因：gag-編碼核心蛋白；pol-編

11、碼逆轉錄酶；env-編碼被膜糖蛋白。 1970年Temin等和Baltimore分別從勞氏肉瘤病毒和小白鼠白血病病毒等致病RNA病毒中分離出逆轉錄酶，迄今已知的致癌RNA病毒都含有逆轉錄酶。 用特異抑制物（放線菌素D）能抑制致癌RNA病毒的復制，而對一般RNA病毒的復制無影響。已知放線菌素D專門抑制以DNA為模板的反應，可見致癌RNA病毒的復制過程必然涉及到DNA。所以Temin于1964年提出前病毒的假說。逆轉錄酶也和DNA聚合酶一樣，沿53方向合成DNA，底物為四種dNTP,并要求短鏈RNA作引物。 逆轉錄酶是多功能酶，兼有3種酶的活性： RNA指導的DNA聚合酶活性； DNA指導的DNA

12、聚合酶活性； 核糖核酸酶H的活性，專一水解RNA-DNA雜交分子中的RNA，可沿53方向起核酸外切酶的作用； 無校對功能，錯誤率高，易產(chǎn)生變異。逆轉錄過程 a) tRNA與PBS結合，反轉錄 合成部分DNADNA負鏈 b) RNase降解病毒RNA5末端 c) 第一次跳躍 d) 負鏈DNA繼續(xù)合成 e) RNA被降解，U3左邊留下片段 作引物合成部分正鏈DNAf) 第二次跳躍正鏈DNA與負鏈 的另一端結合 g) 完成正鏈合成 LTR末端2. 逆轉錄病毒與疾?。捍蠖鄶?shù)逆轉錄病毒造成的疾病都是比較慢性的，有些病毒雖然不直接導致疾病，但可以導致癌癥，有些病毒可以在其基因插入細胞基因內(nèi)而不導致疾病。在

13、人類進化的過程中有許多逆轉錄病毒將它們的基因插入人的基因內(nèi)并成為人的基因的一部分。癌基因（oncogene）又叫轉化基因（transforming gene）是人類或其他動物基因組中含有的一類基因。細胞癌基因（cellular oncogene， c-onc）原癌基因（proto-oncogene），未活化的c-onc。病毒癌基因（virus oncogene，v-onc）HIV病毒-引起艾滋病的病原體。人類免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus, HIV）是一種感染人類免疫系統(tǒng)細胞的慢病毒（Lentivirus），屬反轉錄病毒的一種。普遍認為，人類免疫缺陷病毒

14、的感染導致艾滋?。ˋIDS, Acquired Immune Deficiency Syndrome，“愛滋病”），艾滋病是后天性細胞免疫功能出現(xiàn)缺陷而導致嚴重機會感染及/或繼發(fā)腫瘤并致命的一種疾病。自1983年發(fā)現(xiàn)（Luc Montagnier； Robert Gallo） ，HIV全球奪命2500萬，死亡人數(shù)超過第一次世界大戰(zhàn)，目前艾滋病病毒感染者尚有3300萬人。HIV結構及生活史周期3. HIV與藥物 核苷類似物：1985年發(fā)現(xiàn)幾種核苷類似物（nucleoside analgues）能競爭性抑制HIV-1逆轉錄酶活性，并在逆轉錄中終止cDNA鏈的延伸。如3-疊氮脫氧胸苷（azidoth

15、ymidine, AZT)，1987年FDA批準上市的第一個治療艾滋病有效藥物。本品經(jīng)細胞中酶的作用轉化成活性型三磷酸齊多夫定，后者競爭性抑制HIV的逆轉錄酶，抑制其DNA的合成、運送和整合至宿主細胞核，而抑制病毒復制。 類似的還有雙脫氧肌苷/胞苷（DDI/DDC）非核苷類似物：Nevirapine 和 Pyridinone 兩者均可直接抑制HIV-1逆轉錄酶，對AZT耐藥株有效；對HIV-2無作用，易產(chǎn)生耐藥性。 HIV-1蛋白酶的抑制劑第二節(jié) 基因突變一、突變概念和類型（一）突變概念：突變(mutation)是指遺傳物質(zhì)發(fā)生的可遺傳的變異。 沒有發(fā)生突變的基因稱為野生型(wild type

16、)基因。自然發(fā)生的突變稱自發(fā)突變（spontaneous mutation）。物理或化學因素引起的突變稱為誘發(fā)突變（induced mutation）；這些因素叫做誘變劑（mutagen）；由于突變劑的作用而產(chǎn)生突變的過程或作用稱為突變生成作用（mutagenesis）。帶有突變位點的基因稱為突變基因（mutant gene）；帶有突變基因的生物個體或群體稱為突變體（mutant）。第四章 DNA的復制、突變、損傷和修復（二）突變類型：根據(jù)突變的原因和結果，可從多方面、多角度對基因突變進行分類。1. 堿基置換突變（base substitution mutation）；由于堿基對的置換或者一個

17、或多個堿基的增加或減少而引起的基因突變。根據(jù)DNA堿基序列的不同改變又可分為點突變、堿基插入、堿基缺失等。點突變：通常指堿基替代，點突變又可分為：單點突變（point mutation）和多點突變（multiple mutation）?？梢苑譃檗D換（transitions）和顛換（transversions）兩類。轉換：嘌呤和嘌呤之間的替換，或嘧啶和嘧啶之間的替換。顛換：嘌呤和嘧啶之間的替換。堿基插入（base inseration）：通常指較長的堿基序列增加。有時插入序列本身攜帶遺傳信息，如轉座成分。轉座成分的插入可使插入位點的基因失活，同時又帶進新的基因。堿基缺失（base deletio

18、n）：通常指較長的一段堿基序列的缺少。缺失突變的回復突變率很低移碼突變（frame shift mutation）：插入、缺失一個或兩個堿基引起閱讀框架的改變。移碼突變可能產(chǎn)生新的終止密碼，導致蛋白質(zhì)合成過早終止。如果經(jīng)突變造成蛋白質(zhì)必需基因的改變，將使蛋白質(zhì)功能喪失。根據(jù)對遺傳信息的改變情況進行分類，可分為：同義突變（synonymous mutation）又稱沉默突變（silent mutation）：由于密碼子具有兼并性，單個堿基置換后未引起編碼氨基酸變化，例如GCG的第三位G被A取代而成GCA，則mRNA中相應的密碼子CGC就被轉錄為CGU，CGC和CGU都是精氨酸的密碼子。 錯義突變

19、（missense mutation）：是指DNA分子中的核苷酸置換后導致合成的多肽鏈中一個氨基酸被另一氨基酸所取代。如鐮刀貧血病，血紅蛋白亞基多肽鏈的第6個氨基酸是谷氨酸，其mRNA分子正常編碼為：GAA或GAG。如果基因正鏈上GAG中的一個堿基A變成T，即從GAGGTG，則其轉錄產(chǎn)物mRNA上密碼子變成了GUG，GUG是代表纈氨酸。這樣谷氨酸被纈氨酸取代。無義突變（nonsense mutation）：當單個堿基置換導致出現(xiàn)終止密碼子(UAG、UAA、UGA)時，多肽鏈將提前終止合成，所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)(或酶)大都失去活性或喪失正常功能。例如，DNA分子模板鏈中ATG的G被T代替時，相應的mR

20、NA上的密碼子便從UAC變成終止信號UAA，因此翻譯便到此為止，使肽鏈縮短。4. 根據(jù)突變表現(xiàn)型對外界環(huán)境的敏感性分類非條件性突變（nonconditional mutation）條件性突變（conditional mutation）根據(jù)研究目的選擇一定的條件，使細胞產(chǎn)生一定的突變，但能正常生長或近乎正常。最常用的條件是溫度，因為溫度宜控制，所以最常見的條件型突變?yōu)闇囟让舾型蛔儯╰emperature sensitive mutation）5. 從突變效應背離或返回到野生型可分為：正向突變（forward mutation）指由野生型變?yōu)橥蛔冃褪钦蛲蛔儭?回復突變（backmutation

21、or reverse mutation），回復到野生型的突變。6. 影響基因調(diào)控序列：突變位點可能存在于負責基因調(diào)控的DNA序列中。如突變位點在啟動子區(qū)域，則有可能造成啟動子上升突變（promoter up mutation）或下降突變（ promoter down mutation）。如果突變位點發(fā)生在操縱子（operator），使操縱子的阻遏蛋白結合位點發(fā)生突變，則不能結合阻遏蛋白或突變發(fā)生在調(diào)節(jié)基因上使其不能產(chǎn)生有功能的阻遏蛋白。突變位點位于操縱子或調(diào)節(jié)基因的突變造成的兩種結果都使結構基因失去了負向控制，使細胞不能根據(jù)需要來控制蛋白質(zhì)生成，即細胞產(chǎn)生不依賴于需要的，有固定數(shù)量的蛋白質(zhì)；基

22、因的這種表達方式叫組成型表達。產(chǎn)生這種表達方式的操縱子突變或調(diào)節(jié)基因的突變叫做組成型突變（constitutive mutation）。啟動子突變體和組成型突變體是研究基因調(diào)控的重要手段。二、突變原因（一）自發(fā)突變(spontaneous mutation)， 自然發(fā)生的，無人為干擾的突變。引起自發(fā)突變的因素主要有DNA復制中的錯誤和DNA自發(fā)的化學改變。 DNA復制錯誤：如A與C配對，這樣在復制時將產(chǎn)生該位點為A-T與G-C配對的兩條子鏈。由于堿基自身存在互變異構體，可能形成錯誤的堿基配對。1. 自發(fā)的化學變化：最常見的是脫嘌呤（depurination）和脫氨基（deamination）D

23、NA復制錯誤 ATGTCTACAGATGTC AT A TCTA TAGTA TAGATGTC TACAG ATGTC TACAG ATGTCTACAG ATGTCTACAG 新鏈 5 3 A G T TT C A A A A A C G 模板鏈 3 5 新合成鏈環(huán)出 5 3 5 T 3 A G T T A G T T T TT C A A A A C G T C A A A A A C G 3 A 5 3 5 模板鏈環(huán)出 新鏈上插入一個堿基 新鏈上缺失一個堿基 5 3 5 T 3 A G T T T T G C A G T T T T T G CT C A A A A C G T C A A

24、 A A A C G 3 A 5 3 5 圖214 在 DNA 復制中由于 DNA 的錯誤環(huán)出自發(fā)產(chǎn)生堿基的插入和缺失 (參考 Peter J. Russell: Genetics, 3rd ed.,Fig18-8)脫嘌呤作用：指在DNA雙螺旋鏈上脫氧核糖和嘌呤之間的糖苷鍵斷裂，A或G被切下，成為無嘌呤位點。脫氨基作用：DNA雙鏈的堿基上去除氨基，如胞嘧啶上有一個易被氧化的氨基，該氨基變成羰基（去氨基）后，該位點上嘧啶變成了尿嘧啶。如果DNA中有“U”未被細胞的DNA修復系統(tǒng)除去，那么當該突變的DNA復 制時，子鏈在該位點將加上一個A與之配對，結果本應是C-G對轉變成了T-A對，產(chǎn)生了堿基轉換

25、突變。4. 氧化作用損傷堿基（oxidatively danaged bases）：細胞代謝產(chǎn)生的一些活性氧集團，如過氧化物（O2-）、過氧化氫（H2O2）和羥基(-OH)等，可使DNA氧化損傷，從而導致突變。如胸苷氧化后產(chǎn)生胸苷乙二醇，G氧化后產(chǎn)生8-氧-7，8二氫脫氧鳥嘌呤或8-氧鳥嘌呤（8-O-G，GO），GO可與A錯配，導致G-CT-A突變。利用誘變劑增加突變率1. 射線：包括紫外線、X射線、射線及宇宙射線等。UV是所有病毒和細菌的誘變劑。由于DNA中的嘌呤和嘧啶的雜環(huán)有很強的吸收254-260UV的能力，所以這種波長的UV能引起DNA堿基變化，造成DNA突變。主要是引起相鄰的兩個T形

26、成二聚體。TT的緊密連接引起雙螺旋變形，從而阻斷轉錄并暫時阻斷DNA復制，引起細胞死亡。（二）誘發(fā)突變（induced mutation）X、和宇宙射線是離子化射線。當射線作用于組織時，產(chǎn)生具有高度反應性的自由基。引起DNA損傷。DNA損傷包括三種效應：DNA鏈戊糖和磷酸組成組成的骨架被破壞，造成單鏈斷裂；雙鏈斷裂核苷酸堿基改變。2. 化學誘變劑 堿基類似物：是一類化學結構與DNA中正常堿基十分相似的化合物。通常指人工合成的，如嘌呤類似物有8-吖鳥嘌呤，6-巰基嘌呤，二氨基嘌呤；嘧啶類似物有5-溴尿嘧啶，5-氟尿嘧啶等。如5-溴尿嘧啶和T很相似，僅在第5個碳元子上由Br取代了甲基 5-BU有，

27、酮式，烯醇式兩種異構體，可分別與A及G配對結合 A A G GT BUK BUE C酮式 烯醇式氨基嘌呤（2-aminopurine，2-AP）：也是堿基類似物。它也有二種互變形式，一種是正常狀態(tài)，另一種是稀有形式狀態(tài)，以亞胺形式存在。前一種可與DNA雙鏈中原來的A-T配對，轉成C-G配對或原有的G-C對變成A-T對。A 2AP 2AP* GT T C C亞硝酸：使嘌呤或嘧啶脫氨，改變核酸結構和性質(zhì)，造成DNA復制紊亂。HNO2還能造成DNA雙鏈間的交聯(lián)而引起遺傳效應。 可使G第二個碳原子上的氨脫去，產(chǎn)生黃嘌呤（xanthine，X），黃嘌呤仍能與C配對，故不產(chǎn)生堿基轉換。但若C和A脫氨后分別

28、產(chǎn)生U和次黃嘌呤(H)，U與A配對， H與C配對，使C-G轉換成A-T或A-T轉換成G-C； 堿基修飾劑HNO2AH G G A AT C C C U THNO2 羥胺：只能特意地和胞嘧啶（C）起反應。在C上第4個碳原子加-OH，該產(chǎn)物可和A配對使G-C轉換成T-A；HA C 4-OH-C TG A A 烷化劑：一類使堿基烷基化的化合物，如甲基磺酸乙酯（EMS）、氮芥（NM）、甲基磺酸甲酯（MMS）、亞硝酸胍（NG）等。EMS使G第6位烷基化，使T第4位上甲基化，產(chǎn)生O-6-E-G和O-6-E-T。兩者分別和T，G配對，是原來的G-C對轉變成A-T對，A-T轉變?yōu)镚-C。GO-6-E-G A

29、T O-4-E-T CCT T A G G DNA插入劑：又稱插入突變劑（intercalating mutagens），包括原黃素（proflavin）、丫啶橙（acridine orange）、溴化3，8-二氨基-5-乙基-6苯基菲啶鎓（ethidium bramide）和ICR的復合物等。 (a) 增加堿基 插入劑分子 模板鏈 5ATCAG TTACT3 新合成鏈 3TAGTC G AATGA5 068nm 隨機選擇堿基 嵌入插入劑處 下一輪復制 5ATCAG C TTACT 3 3TAGTC G AATGA 5(b)缺失堿基 模板鏈 5ATCAG T TACT3 新合成鏈 3TAGTC

30、 ATGA5 插入劑失去 后復制 插入劑 5 ATCAGTACT 3 3 TAGTCATGA 5 圖21-15 插入突變導制堿基的增加(a)和減少 (b) （三）基因的人工誘變：1. 體外定向突變的方法：有目的地進行選擇性DNA突變。1985年加拿大的Michael Smith建立，于1993年獲得了諾貝爾化學獎。具體方法有三種：（1）聚核苷酸介導的用單鏈模板定點突變；（2）雙引物法定點突變；（3）用摻入U的單鏈為模板進行聚核苷酸介導的體外定點突變。三種方法產(chǎn)生定點突變的原理是一樣的。舉例如下：先合成一條包括被替代的靶堿基及附近序列的一段寡核苷酸，這條寡核苷酸除被替換的靶堿基，其余的序列與野生

31、型DNA分子中的相應序列完全一致。將待研究的DNA克隆變性后插入到單鏈噬菌體（如M13）DNA中。將合成的寡核苷酸與單鏈噬菌體中DNA克隆的互補單鏈進行雜交。以寡核苷酸做引物，DNA克隆的互補單鏈做模板，在DNA聚合酶I Klenow片段的作用下合成完整的互補鏈，再用DNA連接酶連接起來，將此雙鏈DNA導入大腸桿菌中，經(jīng)修復和DNA復制就可以得到可穩(wěn)定遺傳的突變DNA克隆。例如將干擾素的第17位氨基酸Cys變?yōu)镾er，Cys的密碼子為TGT而Ser的密碼子為AGT，因此只需改變一個堿基對。ACAAGTTCATGAACTTGAACATGA2. 體外定點突變的應用體外定點突變技術是研究蛋白質(zhì)結構和

32、功能之間的復雜關系的有力工具，也是實驗室中改造/優(yōu)化基因常用的手段。如：將胰高血糖素第21位的氨基酸天冬氨酸突變?yōu)楸彼幔芯恳雀哐撬亟Y構與功能的變化：研究組蛋白脫乙?；?（HDAC1）保守氨基酸中組氨酸的定點突變對其功能的影響 研究人血紅蛋白99、82位點突變，與血紅蛋白四聚體穩(wěn)定性的關系。（四）適應性突變1988年凱恩斯等人于英國著名的Nature上，發(fā)表了一篇名為，The origin of mutants的文章， 發(fā)現(xiàn)了適應性突變。凱恩斯所用的大腸桿菌的lacZ基因（其產(chǎn)物為半乳糖 ，可分解乳糖為葡萄糖和半乳糖）帶有一個點突變，稱為琥珀突變（amber mutation），這樣的突

33、變會使得lacZ基因產(chǎn)物轉譯（translate）不完全，故其產(chǎn)物會失去正常分解乳糖的功能除非有突變發(fā)生，使得lacZ的產(chǎn)物能完全轉譯，否則帶有這種基因的大腸桿菌便無法生長在以乳糖為唯一碳源的培養(yǎng)平板上。凱恩斯的實驗結果可得到兩個重要的結論乳糖可誘使Lac +突變種持續(xù)產(chǎn)生，而不是因為饑餓所導致； 乳糖誘使細菌產(chǎn)生特定方向的突變，也就是乳糖只會誘使大腸桿菌的LacZ基因產(chǎn)生突變，而不影響其他的基因。 三、突變體的分離與分析（一）突變體的分離： 分子生物學研究中，基因突變可以在體外按照人們的設計進行，但是仍然有很多不需要的突變體，因此需要分離，方法有：利用遺傳分析方法，篩選、選擇、富集需要的突變

34、體，常見的例子是利用抗性基因，使帶有抗性基因的突變體可以生長，其它被殺死。（二）突變體的分析：遺傳檢測法1. 根據(jù)重組載體的抗藥性標志篩選：如抗氨芐青霉素（anpr）、抗四環(huán)素(terr)、抗卡那霉素(kanr)等。當培養(yǎng)基中含有抗生素時，只有攜帶相應抗藥性基因載體的細胞才能生存繁殖，這就把凡未能接受載體DNA的細胞全部篩除掉了。如果外源目的序列是插入在載體的抗藥性基因中間使這抗藥性基因失活，這個抗藥性標志就會消失。例如質(zhì)粒pBR322含有anpr、和terr兩個抗藥基因，若將目的序列插入terr基因序列中，轉化大腸桿菌，讓細菌放在含氨芐青霉素或四環(huán)素培養(yǎng)基中，凡未接受質(zhì)粒DNA的細胞都不能生

35、長；凡在含氨芐青霉素和四環(huán)素中都能生長的細菌是含有質(zhì)粒pBR322的，但其pBR322未插入目的序列，凡在氨芐青霉素中能生長、而在四環(huán)素中不能生長的細菌就很可能是含有目的序列的重組質(zhì)粒。 -半乳糖苷酶法載體含有l(wèi)acZ的藍白篩選法：藍白篩選法是一種利用藍色化合物作為指示劑的篩選方法，篩選含有編碼-半乳糖苷酶的基因。主要是在載體的非必要區(qū)插入一個大腸桿菌-半乳糖苷酶的基因片段lacZ。攜帶lacZ 的載體轉入lac-的宿主菌后，在含有X-gal(5-溴-4氯-3-吲哚-D-半乳糖苷)和IPTG(異丙基硫代-D-半乳糖苷)平板上可形成藍色菌落。外源基因插入lacZ（或lacZ被取代）后，重組子將喪

36、失分解X-gal的能力。轉入lac-的平板上可形成白色菌落。 2. 核酸雜交法：利用標記的核酸做探針與轉化細胞的DNA進行分子雜交，可以直接篩選和鑒定目的序列克隆。常用的方法是Southern 印跡雜交和斑點雜交等。將轉化后生長的菌落復印到硝酸纖維膜上，用堿裂菌，菌落釋放的DNA就吸附在膜上，再與標記的核酸探針溫育雜交，核酸探針就結合在含有目的序列的菌落DNA上而不被洗脫。核酸探針可以用放射性核素標記，結合了放射性核酸探針的菌落集團可用放射性自顯影（auroradiography）法指示出來，核酸探針也可以用非放射性物質(zhì)標記，通常是經(jīng)顏色呈現(xiàn)指示位置，這樣就可以將含有目的序列的菌落挑選出來。3. PCR技術（見書）四、突變與人類疾病突變基因改變了原有的結構與功能，導致原有的遺傳性狀發(fā)生改變，其中一部分基因突變可導致遺傳病或具有遺傳傾向的病甚至腫瘤。如血友病是凝血因子基因的