實(shí)驗(yàn)二堿裂解法抽提質(zhì)粒DNA2

1、實(shí)驗(yàn)一、堿裂解法抽提質(zhì)粒實(shí)驗(yàn)一、堿裂解法抽提質(zhì)粒DNA質(zhì)粒質(zhì)粒是攜帶外源基因進(jìn)入細(xì)菌中擴(kuò)增或表達(dá)的主要載體，它在基因操作中具有重要作用。質(zhì)粒的分離與提取質(zhì)粒的分離與提取是最常用、最基本的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。質(zhì)粒的提取方法很多，大多包括 3 個主要步驟個主要步驟：細(xì)菌的培養(yǎng)、細(xì)菌的收集和裂解、質(zhì)粒 DNA 的分離和純化。本實(shí)驗(yàn)以堿裂解法堿裂解法為例，介紹質(zhì)粒的抽提過程。 1、掌握堿裂解法抽提質(zhì)粒的原理、步驟及各試劑的作用；、掌握堿裂解法抽提質(zhì)粒的原理、步驟及各試劑的作用；2、掌握常用分子生物學(xué)試劑的配制；、掌握常用分子生物學(xué)試劑的配制；3、掌握無菌操作技術(shù)；、掌握無菌操作技術(shù)；4、掌握大腸桿菌的培養(yǎng)、保存

2、及液體培養(yǎng)物、掌握大腸桿菌的培養(yǎng)、保存及液體培養(yǎng)物OD值測定的方法；值測定的方法；5、掌握移液器、分光光度計、離心機(jī)的正確使用方法；、掌握移液器、分光光度計、離心機(jī)的正確使用方法；6、學(xué)會根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要選擇合適的大腸桿菌菌株和質(zhì)粒載體。、學(xué)會根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要選擇合適的大腸桿菌菌株和質(zhì)粒載體。一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊?、?shí)驗(yàn)?zāi)康脑谠?pH 12.012.6 堿性堿性環(huán)境中，細(xì)菌的線性大分子量染色體環(huán)境中，細(xì)菌的線性大分子量染色體 DNA 變性分開，變性分開，而共價閉環(huán)的質(zhì)粒而共價閉環(huán)的質(zhì)粒 DNA 雖然變性但仍處于拓?fù)淅p繞狀態(tài)。雖然變性但仍處于拓?fù)淅p繞狀態(tài)。將將 pH 調(diào)至調(diào)至中性中性并有并有高鹽高鹽存在及存在及

3、低溫低溫的條件下，大部分染色體的條件下，大部分染色體 DNA 、大分、大分子量的子量的 RNA 和蛋白質(zhì)在去污劑和蛋白質(zhì)在去污劑 SDS 的作用下形成沉淀，而質(zhì)粒的作用下形成沉淀，而質(zhì)粒 DNA 仍然仍然為可溶狀態(tài)。為可溶狀態(tài)。通過離心，可除去大部分細(xì)胞碎片、染色體通過離心，可除去大部分細(xì)胞碎片、染色體 DNA 、 RNA 及蛋白質(zhì)，質(zhì)粒及蛋白質(zhì)，質(zhì)粒 DNA 尚在上清中，然后用酚、氯仿抽提進(jìn)一步純化質(zhì)粒尚在上清中，然后用酚、氯仿抽提進(jìn)一步純化質(zhì)粒 DNA 。二、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理1 1、 含有含有pBluescript II SK (+)(pSK)(pSK)質(zhì)粒載體的大腸桿菌菌株質(zhì)粒載體的

4、大腸桿菌菌株DH5菌液菌液2 2、含有重組質(zhì)粒、含有重組質(zhì)粒 MP3MP3的大腸桿菌菌株的大腸桿菌菌株DH5菌液菌液注：注：pBluescriptpBluescript是由是由StratageneStratagene公司開發(fā)的噬菌粒載體（公司開發(fā)的噬菌粒載體（phagemid vectorphagemid vector，由質(zhì)，由質(zhì)粒載體和單鏈?zhǔn)删w的復(fù)制起點(diǎn)結(jié)合而成）。粒載體和單鏈?zhǔn)删w的復(fù)制起點(diǎn)結(jié)合而成）。重組質(zhì)粒重組質(zhì)粒MP3MP3是利用是利用Hind III對對水稻基因組水稻基因組DNADNA進(jìn)行進(jìn)行部分酶切（不完全酶切）部分酶切（不完全酶切），然后，然后與與Hind III酶切的酶切的

5、pSK（長約（長約3kb）連接篩選得到的重組質(zhì)粒，插入的）連接篩選得到的重組質(zhì)粒，插入的水稻基因組水稻基因組DNADNA片段長約片段長約3kb3kb。三、實(shí)驗(yàn)材料三、實(shí)驗(yàn)材料分子生物學(xué)常用的大腸桿菌（分子生物學(xué)常用的大腸桿菌（E. coli）菌株：）菌株：DH5：是世界上最常用的生物工程菌株之一，特別是在克隆應(yīng)用方面；其主要特點(diǎn)是 ：高轉(zhuǎn)化率、高穩(wěn)定性、遺傳標(biāo)記多；是擴(kuò)增菌，可使質(zhì)粒高拷貝數(shù)擴(kuò)增。DH10B：was designed for the propagation of large insert DNA library clones. It is used extensively, t

6、aking advantage of properties such as high DNA transformation efficiency and maintenance of large plasmids.BL21：是表達(dá)菌，利于蛋白的表達(dá)。該質(zhì)粒載體用的是該質(zhì)粒載體用的是pUC的復(fù)制子，拷的復(fù)制子，拷貝數(shù)能達(dá)到貝數(shù)能達(dá)到500-700個。個。四、儀器設(shè)備四、儀器設(shè)備五、實(shí)驗(yàn)用具五、實(shí)驗(yàn)用具高壓滅菌鍋 超凈工作臺 恒溫?fù)u床 恒溫培養(yǎng)箱 干燥箱 臺式離心機(jī)（冷凍式或非冷凍式）臺式離心機(jī)（冷凍式或非冷凍式） 旋渦振蕩器培養(yǎng)用試管 量筒 冰盒 微量離心管 移液器移液器 吸管頭若干六、試劑六、

7、試劑細(xì)菌培養(yǎng)用試劑細(xì)菌培養(yǎng)用試劑細(xì)菌裂解用試劑細(xì)菌裂解用試劑質(zhì)質(zhì)粒粒提提取取用用試試劑劑核酸沉淀、純化、溶解用試劑核酸沉淀、純化、溶解用試劑注：配制時要把試劑粉末加入到水里，把注：配制時要把試劑粉末加入到水里，把水加到試劑里會造成結(jié)晶難溶。水加到試劑里會造成結(jié)晶難溶。七、實(shí)驗(yàn)步驟七、實(shí)驗(yàn)步驟（一）細(xì)菌的培養(yǎng)（一）細(xì)菌的培養(yǎng)（二）菌體的收集和裂解（二）菌體的收集和裂解（三）分離與純化質(zhì)粒（三）分離與純化質(zhì)粒DNA1、取超低溫與干有種保存的含有質(zhì)粒的大腸桿菌菌液于固體 LB培養(yǎng)基上 劃線，37 倒置過夜培養(yǎng)至長出單菌落；2、用無菌牙簽挑取單菌落，接種于含有 Amp 抗生素的 LB 培養(yǎng)基中， 37

8、 搖床，200 r/min 過夜培養(yǎng)。（一）細(xì)菌的培養(yǎng)（一）細(xì)菌的培養(yǎng)3、吸取 1.5 ml 菌液， 12000 rpm 離心1分鐘，收集菌體，倒掉菌液；若菌體沉淀少，重復(fù)以上步驟再次收集菌體，盡量將菌液倒干凈盡量將菌液倒干凈；4、加入 300 l 溶液 I + 5 l RNaseA （10 mg/ml）振蕩打勻，重新懸浮細(xì)胞，震蕩混勻（注意：應(yīng)徹底打勻沉淀或碎塊應(yīng)徹底打勻沉淀或碎塊），靜置2分鐘；5、加入 250 l 溶液 II ，輕柔顛倒輕柔顛倒混勻，放置至清亮，一般不超過放置至清亮，一般不超過 5 分鐘分鐘；6、加入 180 l 溶液 III 顛倒混勻，放置于冰上 10 分鐘，使雜質(zhì)充分

9、沉淀；7、12000 rpm離心10 分鐘；（二）菌體的收集和裂解（二）菌體的收集和裂解8、吸取 約500-600 l 上清液（注意：不要吸取到飄浮的雜質(zhì)，若有雜質(zhì)，則上清12000 rpm離心5分鐘后吸取上清）至另一 Eppendorf 管中；（記體積）（記體積）9、加入 2/3 體積的酚/氯仿上下顛倒抽提10分鐘，室溫下靜置待分層后12000 rpm 離心 10分鐘；（含有酚和氯仿的管子要蓋好放于通風(fēng)櫥中）（含有酚和氯仿的管子要蓋好放于通風(fēng)櫥中）10、移取上清液（記體積），加2倍體積冷的冷的無水乙醇無水乙醇（ -20 冰箱），冰箱），混勻；11、離心（12000 rpm，10分鐘，室溫)，

10、倒掉乙醇。離心幾秒鐘，用移液器盡可能盡可能除去除去乙醇乙醇；12、加入0.5 ml 70乙醇洗DNA沉淀一次，離心2分鐘，倒掉乙醇；13、加40 l 1 TE 溶解，于65熱板上溫育10分鐘，之后于 -20 保存?zhèn)溆?。（若溶液若溶液I中不加中不加RNaseA，則加入，則加入 2 l RNaseA于于37 恒溫箱中溫育恒溫箱中溫育3030分鐘分鐘消化殘留的消化殘留的RNARNA）（三）分離質(zhì)粒（三）分離質(zhì)粒DNA1、每小組合并所提的兩管相同質(zhì)粒，加入1 TE或者ddH2O調(diào)整DNA溶液為300 l，加入300 l 酚/氯仿，充分振蕩充分振蕩抽提抽提5-10 min。（去蛋白）（去蛋白）2、離心（

11、12000 rpm，5分鐘），吸取上清液（注意不要觸碰到中間雜質(zhì)和下層的（注意不要觸碰到中間雜質(zhì)和下層的有機(jī)相，吸上清記體積最好用有機(jī)相，吸上清記體積最好用200 l移液器）移液器）。3、加入1/10體積的3 M NaAc，加2倍體積的預(yù)冷無水乙醇預(yù)冷無水乙醇，混勻。4、置于-70oC冰箱約10分鐘以上或-20oC冰箱30分鐘至數(shù)小時。（DNA沉淀）沉淀）5、離心（12000 rpm，15分鐘，4oC），倒掉乙醇，離心幾秒鐘，用移液器盡可能除去乙醇（為了盡可能減少雜質(zhì)殘留）（為了盡可能減少雜質(zhì)殘留）。6、用0.5 ml 70乙醇洗DNA沉淀一次，離心2分鐘，倒掉乙醇。（去除（去除DNA中的中的

12、鹽離子）鹽離子） 7、離心幾秒鐘，用移液器盡可能除去酒精，風(fēng)干（或熱板上烘干1 min）。8、根據(jù)DNA沉淀的大小加2050 l 1 TE 溶解DNA沉淀，并在65熱板上溫育10分鐘（可使可使DNaseDNase失活失活），之后于 -20 保存?zhèn)溆谩?（三）純化質(zhì)粒（三）純化質(zhì)粒DNA質(zhì)粒抽提方法即去除去除 RNA，將質(zhì)粒與細(xì)菌基因組細(xì)菌基因組 DNA分開分開，去除蛋白質(zhì)及去除蛋白質(zhì)及其它雜質(zhì)其它雜質(zhì)，以得到相對純凈的質(zhì)粒。使用相對過量的試劑使用相對過量的試劑 這是適合所有核酸抽提的建議。試劑相對過量的好處是：穩(wěn)定性好，純度高，操作更簡單。關(guān)注溶液I、溶液II和溶液III的比例！詳情請參考：詳

13、情請參考：http:/ kb）。注意事項(xiàng)注意事項(xiàng)1、因?yàn)榧?xì)菌培養(yǎng)液中的細(xì)胞壁成分抑制限制性內(nèi)切酶活性，所有未從細(xì)菌沉淀中除去所有培養(yǎng)液可導(dǎo)致質(zhì)粒不能被限制性內(nèi)切酶切割或不能完全切割。2、酚：酚：在酸性pH條件下，DNA分配于有機(jī)相。因此，使用前酚必須用水飽和并用Tris平衡至 pH7.8，以防DNA分配到有機(jī)相。3、乙醇沉淀：乙醇沉淀：是從水溶液中回收核酸的標(biāo)準(zhǔn)方法。乙醇能夠消除核酸的水化層，使帶負(fù)電荷的磷酸基團(tuán)暴露出來。Na+之類的平衡離子能夠與這些帶電基團(tuán)結(jié)合，在沉淀形成部位降低多核苷酸鏈之間的排斥作用。因此，只有在陽離子的量足以中和暴露的磷酸殘基的電荷時才會發(fā)生乙醇沉淀。思考題（質(zhì)粒抽提）思考題（質(zhì)粒抽提）1、為什么真核生物的基因組DNA不能用堿法抽提？2、異丙醇和無水乙醇對核酸沉淀的優(yōu)缺點(diǎn)。3、劃線培養(yǎng)好的平板和培養(yǎng)好的菌液如何短暫存放？4、抽提質(zhì)粒一般用1TE溶解，TE的成分是什么？各成分有什么作用？5、加3M NaAc及無水乙醇（或異丙醇）沉淀DNA的原理是什么？6、